CN117362404A - 纳米磁珠介导超表达DlNIP1转运蛋白的龙眼花粉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了纳米磁珠介导超表达DlNIP1转运蛋白的龙眼花粉及其应用，具体公开了一种蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID ON:1所示或SEQ ID ON:1所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺少或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。本发明通过检测对‘石硖’(正常品种)和‘伊多’(缺硼品种，表现为花而不实)的2个发育时期和5个组织器官的DlNIP1表达水平，结果显示，DlNIP1仅在‘石硖’花中显著高表达，表明DlNIP1可作为提高龙眼结实率的靶基因，用于提高硼转运效率，利于花粉管生长，进而提高龙眼的结实性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及纳米磁珠介导超表达DlNIP1转运蛋白的龙眼花粉及其应用。
背景技术
龙眼是世界上重要的热带亚热带水果。我国是龙眼原产国和最大生产国，种植面积和产量均超过世界龙眼种植面积和产量的一半。2022年我国龙眼种植面积为450万亩(数据来自国家荔枝龙眼产业技术体系)，主要分布在广东、广西、福建、四川和云南等省区。上述主产区龙眼主要种植在丘陵坡地，土壤类型主要为赤红壤及红壤等。由于红壤的特性造成龙眼主产区土壤的硼元素严重缺乏，97％以上的土壤平均有效硼含量低于0.5mg/kg，广东龙眼园土壤硼含量最低，仅0.17mg/kg。因此随着龙眼园结果年数的增加，出现树势衰弱、叶片黄化、卷曲症状，严重时落花落果，果实发育异常，严重制约着龙眼产业发展。
硼是高等植物生长发育所必需的微量元素。硼对碳水化合物的运输、花粉萌发和花粉管的生长等都有着广泛的影响。在农业生产上，硼的过量和缺少都可抑制作物的生长，影响作物的品质和产量。关键是，适合作物生长的硼浓度很窄，缺硼可以通过施肥补充，可是施肥又容易导致硼的毒害。近年来对植物吸收和转运硼机制的研究表明，不同物种中起关键作用的基因有差异，其中一类NIPs家族蛋白(NOD26-like intrinsic proteins)作为硼酸的转运通道，在作物硼转运过程中起重要作用。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种蛋白质。
本发明第二方面的目的，在于提供编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第一方面的核酸分子相关的生物材料。
本发明第四方面的目的，在于提供一种超表达DlNIP1的龙眼花粉。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第四方面的龙眼花粉的制备方法。
本发明第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的蛋白质、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料和/或本发明第四方面的龙眼花粉的应用。
本发明第七方面的目的，在于提供一种产品。
本发明第八方面的目的，在于提供一种提高龙眼结实率的方法。
本发明第九方面的目的，在于提供一种用于扩增本发明第二方面的核酸分子的试剂。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，在于提供一种蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ IDON:1所示或SEQ ID ON:1所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺少或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
本发明第二个方面，在于提供编码本发明第一方面的蛋白质的核酸分子。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID ON:4所示。
本发明第三个方面，在于提供与本发明第一方面的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料包含a1)～a3)中的至少一种：
a1)表达盒，含有本发明第一方面的核酸分子；
a2)重组细胞，含有本发明第一方面的核酸分子或a1)中表达盒；
a3)重组表达载体，含有权利要求2所述的核酸分子、a1)中表达盒或a2)中重组细胞。
优选地，所述重组载体为质粒载体、病毒载体或细胞载体。
优选地，所述质粒载体可以是任选的质粒，所述病毒载体可以任选的病毒，所述细胞载体不包括繁殖材料。
优选地，所述载体为植物表达载体pRI101-GFP载体。
优选地，所述重组表达载体由以下制备方法制备得到：将DlNIP1基因连接到经KpnI和BamH I双酶切后的pRI101-GFP载体，构建得到重组表达载体。
本发明第四个方面，在于提供一种超表达DlNIP1的龙眼花粉，所述龙眼花粉过表达本发明第一方面的蛋白质或本发明第二方面的核酸分子。
本发明第五个方面，在于提供本发明第四方面的龙眼花粉的制备方法，包括以下步骤：将本发明第二方面的核酸分子或本发明第三方面的生物材料整合到龙眼花粉中，即得到超表达DlNIP1的龙眼花粉。
优选地，所述制备方法包括采用农杆菌介导法、DNA直接插入法、花粉管通道法、植物病毒介导法或花粉磁转染法将本发明第二方面的核酸分子或本发明第三方面的生物材料整合到龙眼花粉中，即得到超表达DlNIP1的龙眼花粉。
优选地，采用花粉磁转染法。
优选地，所述花粉磁转染法的具体步骤包括：
(1)将纳米磁珠MNP与质粒DNA在室温条件下结合，形成MNP/DNA复合物；
(2)收集龙眼的新鲜花粉，与磁转化悬浮液混合，进行开孔预处理；
(3)将MNP/DNA复合物加入到(2)中反应体系中，轻柔混匀，在外界磁场下进行转染，转染结束后即得到超表达DlNIP1的龙眼花粉。
优选地，所述磁转化悬浮液包括0.02w/v％～0.5w/v％Ca(NO3)2·4H2O、4w/v％～7w/v％蔗糖，0.01w/v％～0.05％H3BO3和30～40mM MES，pH值6～7。
优选地，所述纳米磁珠MNP与质粒DNA的质量比为1:(800～1200)；进一步为1:900～1100；最优为1:1000。
本发明第六个方面，在于提供本发明第一方面的蛋白质、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料和/或本发明第四方面的超表达DlNIP1的龙眼花粉在b1)～b7)中任一项中的应用：
b1)提高龙眼结实率；
b2)制备提高龙眼结实率的产品；
b3)龙眼分子育种；
b4)提高龙眼花粉的硼转运效率；
b5)制备提高龙眼花粉的硼转运效率的产品；
b6)提高龙眼花粉萌发生长；
b7)提高龙眼花粉萌发生长的产品。
本发明第七个方面，在于提供一种包括本发明第一方面的蛋白质、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的生物材料和/或本发明第四方面的超表达DlNIP1的龙眼花粉的产品。
优选地，所述产品的功能包括c1)～c3)中的至少一种；
c1)提高龙眼结实率；
c2)提高龙眼花粉的硼转运效率；
c3)提高龙眼花粉萌发生长。
优选地，所述产品还包括辅料。
优选地，所述辅料包括但不限于填充剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂或防腐剂中的至少一种。
优选地，所述填充剂包括但不限于淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖中的至少一种；所述粘合剂包括但不限于纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、水、糊精、明胶、羟丙基纤维素、甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；所述稀释剂包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙和结晶纤维素中的至少一种；所述崩解剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙和藻酸中的至少一种；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢钠、微粉硅胶、滑石粉、无水硅胶和硬脂酸镁中的至少一种：所述助悬剂包括但不限于微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、羧甲基纤维素钠和固态聚乙二醇中的至少一种：所述润湿剂包括但不限于甘油、吐温-80、氧基氢化蓖麻油、十二烷基硫酸钠和卵磷脂中的至少一种：所述溶剂包括但不限于乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇和植物油中的至少一种，所述植物油包括但不限于大豆油、蓖麻油、花生油、调和油中的至少一种：所述表面活性剂包括但不限于十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦和聚山梨(吐温)中的至少一种：所述矫味剂包括但不限于阿斯巴甜、蔗糖素、香精、甜菊素、安赛蜜、柠檬酸和糖精钠中的至少一种；所述防腐剂包括但不限于对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯中的至少一种。
本发明第八个方面，在于提供一种提高龙眼结实率的方法，包括以下步骤：在花粉授粉时，将本发明第四方面的超表达DlNIP1的龙眼花粉授予龙眼雌蕊，即可。
优选地，所述龙眼的品种包括但不限于石硖、储良、伊多、草铺种、东边勇、古山二号、四季蜜、大乌圆、东壁、八月鲜、红壳、粉壳、水南1号、福眼和立冬本中至少一种；进一步为石硖、储良和伊多。
本发明第九个方面，在于提供一种用于扩增本发明第二方面的核酸分子的试剂，所述试剂包括引物对NIP1-F/R。
优选地，所述引物NIP1-F/R的序列如SEQ ID ON:2～3所示。
优选地，所述试剂还包括酶、反应缓冲液、dNTPs、Mg2+。
本发明的有益效果是：
本发明通过检测对‘石硖’(正常品种)和‘伊多’(缺硼品种，表现为花而不实)的2个发育时期(1月底和3月底)和5个组织器官(根、茎、叶、花)的DlNIP1表达水平，结果显示，DlNIP1仅在‘石硖’花中显著高表达，DlNIP1作为硼转运通道，与花期的硼转运效率密切相关，表明DlNIP1可作为提高龙眼结实率的靶基因，用于提高硼转运效率，利于花粉管生长，进而提高龙眼的结实性。
与普通花粉相比，本发明提供的超表达DlNIP1的龙眼花粉的花粉萌发率显著提高，在0.05％H3BO3条件下，花粉萌发率可达到40.70％。
通过实验证明，将本发明提供的超表达DlNIP1的龙眼花粉授予龙眼雌蕊，可显著提高龙眼的结实率，特别是一些不易坐果的龙眼品种，例如‘伊多’，可为后续龙眼分子育种提供参考。
附图说明
图1为DlNIP1在不同组织部位的表达情况。
图2为pRI101-GFP质粒图谱。
图3为DlNIP1超表达载体的构建；其中，左图为载体构建中的电泳图，右图为鉴定连接成功的DlNIP1超表达的阳性质粒的电泳图，图中，A代表DlNIP1的带有Sal I和BamH I酶切位点的全长序列，B代表Sal I和BamH I双酶切pRI101-GFP质粒。
图4为龙眼花粉磁转化体系及DlNIP1转化花粉的验证；其中，a为扫描电镜观察龙眼花粉结构；b为DlNIP1转化后花粉萌发情况；c为RT-PCR筛选超表达DlNIP的花粉，图中1～10为获得的不同批次的转基因花粉，有条带(900bp)，即表明DlNIP1有表达，CK表示非转基因花粉，无条带，H2O是空白对照，也无条带；d为观察对照组花粉的绿色荧光蛋白GFP信号；e为观察超表达DlNIP1花粉的绿色荧光蛋白GFP信号。
图5为人工授粉的‘伊多’龙眼结实图；其中，a为枪头喷点液体花粉；b为授粉后套袋；c为对照组花粉的结实图；d为超表达DlNIP1‘石硖’龙眼花粉的结实图。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
大肠杆菌菌株E.coli DH5α、农杆菌EHA105、植物表达载体pRI101-GFP载体由本实验室保存备用；基础载体pMD-19T购自TaKaRa公司(TaKaRa，Dalian，China)；磁性纳米载体(MNPs，CAT#：Mag2100，购自南京东纳生物有限公司)。
实施例1
龙眼(Dimocarpus longan Lour.)种质来自广东省农业科学院果树研究所龙眼资源圃，十年生，生长健壮。
对龙眼品种‘石硖’(正常品种)和‘伊多’(缺硼品种，表现为花而不实)的DlNIP1表达水平进行检测，包括比较2个发育时期(1月底和3月底)和5个组织器官(根、茎、叶、花)，结果显示DlNIP1仅在喷硼处理的‘石硖’花中显著高表达(图1)。DlNIP1作为硼转运通道，与花器的硼转运效率密切相关。以上表明，DlNIP1可作为提高龙眼结实率的靶基因。
1.石硖花的总RNA提取和cDNA第一条链的合成
取新鲜的石硖雌花，根据南京诺维赞生物科技股份有限公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(CAT﹟:RC401)说明书提取其RNA，用1.5％凝胶检测RNA质量，并测定RNA的浓度。参照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)试剂盒(VazymeCode：R312-01)说明书反转录得到cDNA，具体过程如下：取1μgRNA为模板，加RNase FreedH2O补齐至8μL，混匀，65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。加2μL 5×gDNA wiper Mix，用移液器轻吹打混匀，42℃变性2min，立即冰浴中放置至PCR管无余温，短暂离心后依次加入：2μL 10×RT mix、2μL HiScript III Enzyme Mix、1μL Oligo(dT)20VN、5μL RNase Free dH2O，混匀后于25℃ 5min，37℃ 45min，85℃ 5s，4℃冰浴，最后将反转录产物于-20℃保存备用，得到cDNA。
2.DlNIP1基因的克隆和序列分析
以上述cDNA为模板，依据本团队2022年公布的龙眼基因组数据中编码DlNIP1的cDNA序列，设计出可扩增DlNIP1转运蛋白编码基因的完整开放阅读框的引物，包含Sal I和BamH I酶切位点，引物序列如下：NIP1-F:5’-ttgatacatatgcccTTGATACATATGCCCGTCGACATGAAA AGC TGT TACGAAGAGCAAC-3’(Sal I，SEQ ID NO:2)，NIP1-R:5’-GCCCTTGCTCACCATGGATCCACTGCTAAGGAACACTAAAGA GC-3’(BamH I，SEQ ID NO:3)。使用TAKARA高保真酶ExTaq，采用下列反应体系进行扩增：50μL反应体系包括5μL 10×ExTaq Buffer，1μL cDNA，0.2mMdNTPs，1.5mM MgSO4，1mM上/下游引物，0.25μL ExTaq酶，无菌水补充至50μL。为了避免扩增后期发生严重的错配，本实施例使用28个循环，根据扩增片段长度设定循环参数，PCR反应条件如下：94℃ 3min变性；然后94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，28个循环；最后72℃终延伸10min。PCR扩增产物经TaKaRa公司凝胶回收试剂盒回收，与PMD19-T载体(TaKaRa公司)连接后转化大肠杆菌DH5α，取鉴定为阳性克隆的重组子菌液500μL由上海生工测序公司进行测序，克隆分离的DlNIP1转运蛋白编码基因ORF为900bp，编码一个由299个氨基酸组成的蛋白质，推测分子量为32kD，pI＝6.66。DlNIP1转运蛋白编码基因的ORF氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
MKSCYEEQPSPEIPNSASTSSQSKEGQEIGSNTMSENKDVPLKNPIFLCISHELDLNPARMVLAEMVGTFILMFAVCGIIASTQLMGGEVGLMEYAATAGLTIIVVVFCIGPISGAHVNPAVTIAFAIFDHFPWSRVPFYIFAQTVGSALGTYVGKLVYGVKTDLMSTHPLQGCVSAFWVEFIATFIIVFLAAAMTKEAQFVGNLAGFVVGVAIGLAVLITGPISGGSMNPARSLGPAIISWNFKDIWIYVTAPVIGAAAGGFLHSLLRLRPRPQPRSSSAASSSNTDLLSRSLVFLSS(SEQ ID NO:1)。
核苷酸序列为
ATGAAAAGCTGTTACGAAGAGCAACCGTCACCTGAAATACCAAACTCTGCATCAACCAGTAGCCAGTCCAAGGAGGGTCAAGAGATAGGCTCCAACACAATGTCTGAAAACAAAGATGTTCCATTGAAGAATCCTATTTTTCTCTGCATTTCTCATGAATTGGATCTAAACCCTGCTCGTATGGTTCTAGCAGAGATGGTAGGGACTTTCATTTTAATGTTTGCTGTTTGTGGGATCATAGCAAGCACACAGTTGATGGGAGGTGAAGTTGGTTTGATGGAATATGCAGCCACAGCAGGGTTGACAATAATAGTTGTGGTATTCTGCATAGGGCCCATCTCTGGTGCTCATGTAAATCCAGCTGTTACAATAGCCTTCGCCATCTTTGATCATTTTCCATGGTCCAGGGTTCCGTTTTATATATTTGCACAAACAGTTGGTTCTGCGTTGGGAACCTATGTTGGTAAACTAGTCTATGGAGTAAAAACCGATCTTATGTCCACTCACCCTCTCCAAGGCTGTGTTTCTGCATTCTGGGTCGAGTTCATTGCAACATTTATCATTGTGTTTCTTGCTGCAGCAATGACAAAAGAAGCTCAATTTGTAGGCAATTTAGCAGGATTTGTTGTTGGTGTGGCAATTGGACTTGCAGTGCTTATTACAGGCCCAATTTCAGGAGGATCAATGAATCCTGCAAGGTCACTAGGCCCTGCAATTATTTCCTGGAACTTCAAGGACATATGGATATATGTTACTGCCCCTGTAATTGGAGCTGCTGCTGGTGGTTTTCTGCATAGTTTACTCCGGCTCAGGCCGCGGCCTCAGCCTCGTTCTTCTTCTGCTGCCTCCTCTTCTAACACGGACCTACTTAGCCGCTCTTTAGTGTTCCTTAGCAGTTAG(SEQID ON:4)。
3.DlNIP1超表达载体的构建及遗传转化龙眼花粉
pRI101-GFP载体经Sal I和BamH I双酶切后，回收大片段。然后将从龙眼cDNA克隆得到的DlNIP1基因连接到pRI101-GFP表达载体，构建得到超表达DlNIP1的植物表达载体，命名为pRI-DlNIP1(结构如图2所示，电泳图如图3所示)。
前期利用扫描电子显微镜观察‘石硖’龙眼花粉生物表面孔径在5～10μm(图4中a)。构建好的质粒pRI-DlNIP1经花粉磁转染法转化到‘石硖’龙眼花粉中。通过将MNP与pRI-DlNIP1质粒以质量比1:1000混合，磁性纳米载体(MNPs，2μg)连接质粒DNA(pRI-DlNIP1，2000μg)形成MNP/DNA复合物，添加悬浮液(组分是0.03w/v％Ca(NO3)2·4H2O，5w/v％蔗糖，0.01w/v％H3BO3和30mM MES，pH值6.3)至终体积为300μl。在外界磁场下，室温孵育30min,磁性纳米载体(MNPs)将pRI-DlNIP1通过‘石硖’龙眼花粉表面孔，导入龙眼花粉(150mg)中，构建得到纳米基因载体系统。
利用RT-PCR定量分析转基因花粉的DlNIP1的表达情况(图4中c)，利用激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM710)观察GFP信号(图4中d～e)，结果表明成功获得DlNIP1超表达的‘石硖’龙眼花粉。
4.转基因花粉的验证
将3中得到的DlNIP1超表达的‘石硖’龙眼花粉均匀分布在含有不同浓度(0.05％、0.1％、0.2％)H3BO3的固体培养基(5％蔗糖和1.5％琼脂粉)上培养。光照培养箱内温度28℃放置培养8h，体式显微镜下观察花粉萌发率，比较不同浓度硼处理的花粉萌发率。同时以普通的‘石硖’龙眼花粉(即没有经过DlNIP1超表达)作为对照组。
结果图表1所示，不同浓度剂量H3BO3处理，对照组与超表达DlNIP1的花粉萌发率有显著差异，DlNIP1超表达‘石硖’龙眼花粉的萌发率均高于对照组‘石硖’龙眼花粉的萌发率；且随着H3BO3浓度上升，0.1％～0.2％时，对照组‘石硖’龙眼花粉的萌发率下降显著，但DlNIP1超表达花粉的萌发率始终保持较高水平，且显著高于对照。表明超表达DlNIP1可提高花粉硼转运效率，利于花粉萌发生长。
表1不同浓度H3BO3处理条件下花粉的萌发率
实施例2‘伊多’龙眼结实率表型评价
测试时间、地点：2023年广东省农业科学院果树研究所龙眼资源圃。
为了对超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉与对照组花粉(普通的‘石硖’龙眼花粉)进行授粉后的结实性测试及观察，以‘伊多’龙眼为母本，授以‘石硖’的花粉。具体授粉过程如下：
针对对照组花粉，4月10日‘伊多’雌花盛开，早上10：00，将0.5mg/μL液体‘石硖’花粉用枪头吸取少许，对着‘伊多’雌花轻点，喷出花粉液，去除剩余未开放的花蕾套袋，完成授粉，套袋。连续3天，每天重复授粉一次。
针对超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉，4月10日，‘伊多’雌花开放，早上10：00，将液体花粉用枪头吸取少许，对着‘伊多’雌花轻点，喷出花粉液，去除剩余未开放的花蕾套袋，完成授粉，套袋。连续3天，每天重复授粉一次。
6月1日调查坐果粒数，授以对照组花粉的‘伊多’龙眼的每穗座果率为0，而授以超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉的‘伊多’龙眼的座果率达到19.81％(表2)。‘伊多’龙眼雌花授予不同花粉50天后的实物图如图5所示。表明授以超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉可以提高‘伊多’龙眼的座果率。
表2龙眼座果率对比
实施例3‘储良’龙眼结实率表型评价
测试时间、地点：2023年广东省农业科学院果树研究所龙眼资源圃。
为了对超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉与对照组花粉(普通的‘石硖’龙眼花粉)进行授粉后的结实性测试及观察，以‘储良’龙眼为母本，授以‘石硖’的花粉。具体授粉过程如下：
针对对照组花粉，4月3日‘储良’雌花盛开，早上10：00，将0.5mg/μL液体‘石硖’花粉用枪头吸取少许，对着‘储良’雌花轻点，喷出花粉液，去除剩余未开放的花蕾套袋，完成授粉，套袋。连续3天，每天重复授粉一次。
针对超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉，4月3日，‘储良’雌花开放，早上10：00，将液体花粉用枪头吸取少许，对着‘储良’雌花轻点，喷出花粉液，去除剩余未开放的花蕾套袋，完成授粉，套袋。连续3天，每天重复授粉一次。
6月1日调查坐果粒数，授以对照组花粉的‘储良’龙眼的每穗座果率为20.52％，而授以超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉的‘储良’龙眼的座果率达到35.26％(表2)，座果率提高了1.72倍，表明授以超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉可以提高‘储良’龙眼的座果率。
实施例4‘石硖’龙眼结实率表型评价
测试时间、地点：2023年广东省农业科学院果树研究所龙眼资源圃。
为了对超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉与对照组花粉(普通的‘石硖’龙眼花粉)进行授粉后的结实性测试及观察，以‘石硖’龙眼为母本，授以‘石硖’的花粉。具体授粉过程如下：
针对对照组花粉，4月3日‘石硖’雌花盛开，早上10：00，将0.5mg/μL液体‘石硖’花粉用枪头吸取少许，对着‘石硖’雌花轻点，喷出花粉液，去除剩余未开放的花蕾套袋，完成授粉，套袋。连续3天，每天重复授粉一次。
针对超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉，4月3日，‘石硖’雌花开放，早上10：00，将液体花粉用枪头吸取少许，对着‘石硖’雌花轻点，喷出花粉液，去除剩余未开放的花蕾套袋，完成授粉，套袋。连续3天，每天重复授粉一次。
6月1日调查坐果粒数，授以对照组花粉的‘石硖’龙眼的每穗座果率为25.34％，而授以超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉的‘石硖’龙眼的座果率达到36.78％(表2)，座果率提高了1.45倍，表明授以超表达DlNIP1的‘石硖’龙眼花粉可以提高‘石硖’龙眼的座果率。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID ON:1所示或SEQIDON:1所示氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺少或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.与权利要求2所述核酸分子相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料包含a1)～a3)中的至少一种：
a1)表达盒，含有权利要求2所述的核酸分子；
a2)重组细胞，含有权利要求2所述的核酸分子或a1)中表达盒；
a3)重组表达载体，含有权利要求2所述的核酸分子、a1)中表达盒或a2)中重组细胞。
4.一种超表达DlNIP1的龙眼花粉，其特征在于，所述龙眼花粉过表达权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的核酸分子。
5.权利要求4超表达DlNIP1的龙眼花粉的制备方法，包括以下步骤：将权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料整合到龙眼花粉中，即得到超表达DlNIP1的龙眼花粉。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括采用农杆菌介导法、DNA直接插入法、花粉管通道法、植物病毒介导法或花粉磁转染法将权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料整合到龙眼花粉中，即得到超表达DlNIP1的龙眼花粉。
7.权利要求1所述的蛋白质、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的生物材料和/或权利要求4所述的超表达DlNIP1的龙眼花粉在b1)～b7)中任一项中的应用：
b1)提高龙眼结实率；
b2)制备提高龙眼结实率的产品；
b3)龙眼分子育种；
b4)提高龙眼花粉的硼转运效率；
b5)制备提高龙眼花粉的硼转运效率的产品；
b6)提高龙眼花粉萌发生长；
b7)提高龙眼花粉萌发生长的产品。
8.一种产品，包括权利要求1所述的蛋白质、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的生物材料和/或权利要求4所述的超表达DlNIP1的龙眼花粉。
9.一种提高龙眼结实率的方法，包括以下步骤：在花粉授粉时，将权利要求4所述的超表达DlNIP1的龙眼花粉授予龙眼雌蕊，即可；优选地，所述龙眼的品种包括但不限于石硖、储良、伊多、草铺种、东边勇、古山二号、四季蜜、大乌圆、东壁、八月鲜、红壳、粉壳、水南1号、福眼和立冬本中至少一种。
10.一种用于扩增权利要求2所述的核酸分子的试剂，其特征在于，所述试剂包括引物对NIP1-F/R，所述引物NIP1-F/R的序列如SEQ ID ON:2～3所示。
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101503468A (zh) * | 2009-03-13 | 2009-08-12 | 北京林业大学 | 一种与花粉萌发和/或花粉管生长相关的蛋白及其编码基因与应用 |
| CN103224555A (zh) * | 2013-05-27 | 2013-07-31 | 中国农业科学院棉花研究所 | 植物发育相关蛋白GhSOC1及其编码基因和应用 |
| CN109652423A (zh) * | 2018-12-07 | 2019-04-19 | 沈阳农业大学 | 一种水稻开花期调控蛋白及其在育种中的应用 |
| CN113717983A (zh) * | 2021-09-07 | 2021-11-30 | 重庆文理学院 | 龙眼基因DlGRAS34、蛋白及其在调控植株开花中的应用 |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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