CN106544344A

CN106544344A - 一种组织特异性启动子在调控农作物产量中的应用

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Publication number: CN106544344A
Application number: CN201510612568.3A
Authority: CN
Inventors: 沈志成; 张先文; 王东芳; 林朝阳
Original assignee: HANGZHOU RUIFENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU RUIFENG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明公开了一种组织特异性启动子在调控农作物产量中的应用，所述的应用是利用组织特异性启动子调控农作物TEL基因的表达，实现农作物产量的提高；所述组织特异性启动子包括对农作物茎尖分生区、花尖分生区、花原基、花序、穗子、种子和根中至少一个或者一个以上的组织或器官有转录活性的启动子；首次揭示了组织特异性启动子调控TEL基因在植物中过表达能有效避免组成型启动子带来的一系列负面影响，有效改良作物产量相关性状，使其“源、流、库”形成一个新的平衡，提高作物产量。

Description

一种组织特异性启动子在调控农作物产量中的应用

(一)技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种通过组织特异性启动子来定时定点定量的调控可以影响植物生长的基因及其在转基因农作物改良中的应用。该方法可以用来调控植物的产量相关性状，并最终达到显著提高农作物产量的目的。

(二)背景技术

通过转基因可以改良农作物的性状，如获得抗虫能力、抗除草剂能力、提高产量、增强抗干旱、抗病能力等。改良农作物的性状也是农作物新品种培育中的核心内容，具有重要价值。

高产是一个受种质、气候、栽培和肥料等许多因素共同影响的复杂性状。但是，种质是种植者最难以控制，也是最为关键的影响产量的因素之一。在一定的栽培条件下，不同品种的表型千差万别，而包括株高、分蘖数、粒重、单株粒数、结实率、生长周期、灌浆效率等产量相关性状就决定了一个品种最终的产量。上述产量相关性状又是受植物中某一个或多个基因控制的。因此，可以通过精准的调控相关基因的表达来改变植物的产量相关进展，进而提高作物产量。例如，利用转基因表达一种植物的转录因子(Transcription factor)可以提高农作物的产量(美国专利7,598,529,4)。因此，发现新的产量调控基因和深入研究这些基因的表达对植物表型和产量的影响非常重要。

研究者在一个突变体中发现了玉米的“terminal ear1”(TE1)基因。该基因主要在野生型玉米植株的芽和根的分生组织中表达，TE1基因功能缺失的突变体玉米植株叶片的形态和生长的位置都异常，说明其可能参与决定植株叶片空间结构的形成(Veit et al.,(1998)Nature 393,166-168)。水稻中TE1的同源基因“PLASTOCHRON2”的功能和玉米TEL-1相似。“PLASTOCHRON2”基因功能缺失的水稻突变体的叶片成熟速率加快，同时植株矮小，说明其功能与调控叶片生长和成熟相关(Kawakatsu,(2006)The Plant Cell Online 18,612-625；Xiong et al.,(2006)Cell Research 16,267-276)。

TE1和“PLASTOCHRON2”都属于酵母中调控减数分裂的一个关键基因MEI2的同源基因。而MEI2同源基因大致可以分为三个亚族，即AML(Arabidopsis-mei2-Like1)，TEL(TERMINAL EAR1-Like)和MTC(mei2C-Terminal RRM only)(Anderson et al.,(2004)Plant Mol Biol 54,653-670；Jeffares et al.,(2004)Dev Genes Evol 214,149-158)。上述三个亚族中，AML和TEL都具有3个RRM(RNA RecognitionMotif)，而MTC亚族中只有一个RRM。我们研究组在一个意外获得的类似增强子陷阱结构的高产水稻突变体中克隆到了水稻的TEL基因，发现TEL基因具有调控植株株高、生长势、粒重、生物量等性状的功能。我们进一步研究意外的发现MEI2同源基因的三个亚族中，只有增强TEL亚族基因的表达才能调控水稻的产量相关性状的表型，而改变AML和MCT亚族基因的表达，对水稻表型没有任何显著影响(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069)。

启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。它控制基因表达(转录)的位置、起始时间及其表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动，进而决定植物的表型。比如，IAA可以调控细胞的生长和发育，研究者试图通过调控IAA的表达量来调控棉纤维的生长发育，进而提高棉花的产量和质量。首先用棉纤维特异性启动子E6启动子调控IAA合成的关键基因iaaM和iaaH在棉花中表达，尽管获得的转基因棉花棉纤维中自由IAA含量增加了，但是棉纤维的长度、韧度和细度都没有改进(John,M.E.(1999)Developmental Biology,Quality Improvement and Textile Processing(ed.Basra,A.S.),271–292)。之后，研究者精选5个棉纤维或胚珠相关特异性启动子来调控iaaM表达，最终只找到一个胚珠表皮特异性启动子能显著增加棉纤维的数量，提高棉绒产量。另外四个启动子不是导致植物畸形就是没有获得理想表型(Zhang et al.,(2011)Nature Biotechnology 29,453-458))。因此，选择合适的启动子对获得理想的植株表型至关重要。

最近，我们的研究还意外的发现TEL基因表达的强度和位置对植株表型的影响很大。例如用组成型启动子35S启动子启动TEL基因表达的植株会表现出不育、结实率降低、成熟推迟、植株过高、穗位过高、株型不协调等影响植物产量的表型出现。因此，探索出合适的启动子来调控TEL基因表达对获得高产植物品种至关重要。而本发明首次公开了利用组织特异性启动子调控TEL基因表达来改良植物的方法，特别是获得农艺性状优良的基因工程植物的方法。

(三)发明内容

本发明提供一种利用组织特异性启动子启动TEL基因在植物中表达，调控作物的产量相关性状，提高作物产量的目的。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种组织特异性启动子在调控农作物产量中的应用，所述的应用是利用组织特异性启动子调控农作物TEL基因的表达，即构建结构如：“组织特异性启动子-TEL基因-终止子”的表达框，然后将表达框转入植物细胞，获得提高农作物产量的植株，实现农作物产量的提高；所述组织特异性启动子包括对农作物茎尖分生区、花尖分生区、花原基、花序、穗子、种子和根中至少一个或者一个以上的组织或器官有转录活性的启动子。

进一步，所述组织特异性启动子包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列，更优选所述组织特异性启动子为下列之一：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列。

进一步，本发明所述利用组织特异性启动子调控TEL基因的表达过程中还包括至少引入一个增强子，所述增强子引入到组织特异性启动子和TEL基因及其终止子构成的表达框任意一端30kb以内的位置，所述增强子是CaMV 35S增强子。

进一步，本发明所述农作物包括双子叶植物和单子叶植物，具体所述农作物包括玉米、水稻、小麦、高粱、大麦、甘蔗、大豆、棉花、油菜和向日葵。

本发明提供的生殖组织(包括花尖分生区、花原基、花序、穗子、种子)特异性启动子包括但不限于玉米GA20-氧化酶基因GA20ox-1的启动子和水稻GA20-氧化酶基因GA20ox-1的启动子，启动子序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，其转录活性主要在未开放的花中(Sasaki et al.,(2002)Nature416,701-702)；水稻中的GA3ox-1基因，其转录活性主要在生殖组织，启动子序列为SEQ ID NO.3(Itohet al.,(2001)P Natl Acad Sci USA 98,8909-8914)；玉米auxin import carrier1(AUX1)基因的启动子，启动子序列为SEQ ID NO.4。水稻LONELY GUY(LOG)基因的启动子，启动子序列为SEQ ID NO.5，其转录活性主要在SAM和发育的穗子中(Kurakawa et al.,(2007)Nature 445,652-655)；水稻OsARGOS基因的启动子，启动子序列为SEQ ID NO.6，启动子转录活性主要在幼嫩组织中(Wang et al.,(2009)Journal of Genetics and Genomics 36,31-40)；水稻OsMADS45基因的启动子，启动子序列为SEQ ID：7，其转录活性主要在花分生组织(Bai et al.,(2008)Transgenic Res 17,1035-1043)。玉米的CYP78A1启动子，启动子序列为SEQ ID NO.8，其转录活性主要在发育的花序中(Imaishi et al.,(2000)Biosci BiotechBioch 64,1696-1701)。玉米或水稻中部分HD-Zip II基因的启动子(Agalou et al.,(2008)Plant Mol Biol 66,87-103；Rice et al.,(2014)PLoS ONE 9)，这些序列分别为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20。

本发明提供的根特异性启动子包括但不限于玉米zmGRP3基因的启动子(Goddemeier et al.,(1998)Plant Mol Biol 36,799-802)，其序列为SEQ ID NO.21；水稻COS9基因的启动子(Depater and Schilperoort,(1992)Plant Mol Biol 18,161-164)，其序列为SEQ ID NO.22；水稻Os03g01700基因的启动子(Li et al.,(2013)Plant Sci 207,37-44)，其序列为SEQ ID NO.23；水稻RCc3基因的启动子(Xu et al.,(1995)PlantMol Biol 27,237-248)，其序列为SEQ ID NO.24；水稻OsNAC10基因的启动子(Jeong et al.,(2010)PlantPhysiol 153,185-197)，其序列为SEQ ID NO.25。

本发明还提供了来源于OsTEL1或者其同源基因的启动子，其转录活性主要在茎尖、花尖和根尖(Anderson,et al.,(2004)Plant Mol Biol 54,653-670；Kawakatsu,(2006)The Plant Cell Online 18,612-625；Xiong,et al.,(2006)Cell Research 16,267-276)，其序列为SEQ ID NO.26；玉米ZmTE1基因的启动子，其序列为SEQ ID NO.27；大豆GmTEL1基因的启动子，其序列为SEQ ID NO.28。

植物基因天然启动子的区域可以通过试验获得确定。一般启动子可以是编码蛋白质的阅读框5'端外面至少0.25kb、0.5kb、1.0kb、2.0kb、或3.0kb的DNA片段。

本发明提供的组织特异性启动子包括上述启动子及其同源基因中具有类似表达模式的基因的启动子。来自不同物种中的同源基因往往具有相似的表达模式，这些同源基因的启动子的转录活性往往也具有类似的模式。

另外，本发明提供的组织特异性启动子还包括具有上述启动子类似强度和分布的转录活性，根据上述启动子修饰或人工合成的启动子。启动子的转录活性的强弱和分布是通过其序列中一个或多个元件来实现的，而并不是其序列中每一个碱基都和其功能相关。因此，对一个启动子进行某些序列的增减、变换、甚至只需要通过截取或人工合成其中一个或多个元件就能实现该启动子启动基因组织特异性表达的功能。

本发明提供的TEL基因为水稻的OsTEL1基因及其来自其他植物的同源基因。在植物中提高TEL基因表达水平能够导致转基因植物提高生物量、增大植物的种子，并从而提高产量(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069)。

编码本发明功能蛋白质的基因的多核苷酸序列可以有多种不同的变异。多核苷酸序列的变异包括但不限于：1)由于同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的多核苷酸序列，这些序列编码具有相同活性的蛋白质多肽；2)来源于生物的遗传多态性(genetic polymorphism)，即同一种植物的不同个体或者群体之间的多样性；3)通过人工操作导入多核苷酸序列的变异。人工导入的这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的定向变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生点突变、插入或者缺失变异等。通过人工操作导入多核苷酸序列的变异也包括通过Gene Shuffling等方法获得仍然具有正常功能的杂合基因。例如US专利2002/0058249；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370:389-391；Crameri et al.(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509；Crameri et al.(1998)Nature 391:288-291；and U.S.Pat.NOs.5,605,793and 5,837,458。

本发明同时也提供了获得能够调控植物产量相关性状，提高植物产量的基因工程植物的方法。本发明提供的方法包括：1)构建包含表达本发明提供的多核苷酸序列的表达框(即组织特异性启动子-TEL基因-终止子)。表达框可以通过一个或者几个控制表达的多核苷酸序列与OsTEL1基因或者其同源基因功能性连接而获得。本发明特别提供了组织特异性启动子用来定量定点的控制目标基因的表达。2)将表达框导入到植物中，并且获得表达。特别是通过利用组织特异性启动子，使导入的基因获得最佳的表达量和最好的表达位置，从而达到有效改良植物产量相关性状，提高植物产量，并且避免由于目标基因的过度和越位表达带来的负面影响。

本发明提供的多核苷酸可以被克隆到质粒载体中，在细胞中获得大量复制。利用这种DNA重组技术，本发明获得的多核苷酸可以和控制基因表达的启动子和终止子功能性地连接而构成表达框。所谓功能性地连接指启动子和终止子能够发挥控制与它连接的多核苷酸的表达。通常启动子连接在5’端，而终止子连接在3’端。

控制基因表达的终止子可以是提供基因的天然终止子，也可以是从同种植物的其他基因或者其他植物基因的终止子。常用的终止子包括来源于农杆菌的Octopine合成酶终止子和nopaline合成酶终止子等。参考文献包括：Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene 91:151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；and Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。

为了提高基因在目标植物中的表达水平，基因的多核苷酸序列可以进一步修饰和改变。这些改变包括删除内含子、清除一些可能影响基因正常表达的序列，如隐藏的非成熟的PolyA信号序列等。根据目标植物的密码子使用情况，编码相同蛋白质多肽的多核苷酸序列可以优化，以提高其在目标植物中的表达量。

可选的，在DNA表达框中加入一个或多个增强子可以增加TEL编码序列的表达水平。增强子无论是在基因的上游还是下游，都会对基因的表达起到增强作用。因此，可以通过增强子来调控本发明中的组织特异性启动子和目标基因构成的表达框，获得具有理想的目标基因表达强度和表达区域的植物品系。

本发明提供的基因表达框的载体也可以同时包含一个选择标记基因表达框。这个选择标记基因可以用来选择转化了的细胞，常用的基因包括抗生素抗性基因，如neomycin phosphotransferase II(NEO)和hygromycin phosphotransferase(HPT)、抗除草剂基因，如抗草甘膦基因EPSPS等。其他选择标记基因同样可以用作本发明转化的选择标记基因。

本发明提供的基因可以导入植物从而获得转基因高产作物品系，这些植物包括但不限于玉米、小麦、大麦、高粱、水稻、大豆、胡萝卜、马铃薯、棉花、向日葵、油菜、橡树、草坪草、牧草。

目前本领域的一般技术人员能够利用已有的技术将本发明提供的多核苷酸导入到植物中表达。比较常用的方法是基因枪方法(Klein et al,1987,Nature(London)327:70-73；U.S.Pat.No.4,945,050))或农杆菌介导方法((De Blaere et al,1987,Meth.Enzymol.143:277)。但是本发明不限于以上这些方法。

不同植物的转化方法和步骤有所不同。但是，通常通过农杆菌或基因枪将外源基因导入到植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。然后用相应的筛选培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，经过生根培养基培养就可以获得可以种植的转基因苗。进一步，抗除草剂转基因植物可以通过喷施除草剂筛选，例如喷施烟嘧磺隆可以杀灭非转基因的水稻。本发明涉及的植物包括但不限于水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、油菜、草坪草或牧草。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明首次揭示了组织特异性启动子调控TEL基因在植物中过表达能有效避免组成型启动子带来的一系列负面影响，有效改良作物产量相关性状，使其“源、流、库”形成一个新的平衡，提高作物产量。我们意外发现用组成型启动子调控TEL基因在植物中过表达会导致植物可育性严重下降、成熟严重推迟、“源、流、库”不协调，根发育之后或受阻等畸形表型，而通过用组织特异性启动子调控TEL基因在特定时间、空间上特定程度的表达，则能避免上述影响，获得产量提高的作物。

(四)附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1：包含组织特异性启动子和TEL基因连接构成的表达框的T-DNA结构示意图。其中组织特异性启动子为表1中所列出的或者具有类似表达模式的基因的启动子；TEL基因为来源于不同物种的TEL基因(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069)；pZmUbi为玉米泛素启动子；EPSPS为本研究组克隆到的抗草甘膦基因1174(中国专利，CN102146371A，SEQ IDNO:26-SEQ ID NO:30中任意一种)。

图2：包含有增强子调控组织特异性启动子和TEL基因连接构成的表达框的T-DNA结构示意图。其中组织特异性启动子为表1中所列出的或者具有类似表达模式的基因的启动子；TEL基因为来源于不同物种的TEL基因(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069)；pZmUbi为玉米泛素启动子；EPSPS为本研究组克隆到的抗草甘膦基因(中国专利，CN102146371A)；p35S为花椰菜花叶病毒35S启动子，在此有增强子功能。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的JohnWiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology，和J.Sambrook等编写Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例1.组织特异性启动子的克隆

1、生殖组织特异性启动子的克隆

玉米(Zea mays)赤霉素合成酶基因ZmGA20ox1启动子(pZmGA20ox1)的获得：设计PCR引物pZmGA20ox1-F(5’TAAGCTTCTGCCATGACGTGATTGTCCCTGGC)和pZmGA20ox 1-R(5’GGGATCCAGGAGGGAGGAAGCAGAGGAGGAG)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得pZmGA20ox1。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子pZmGA20ox1，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：1)。

水稻(Oryza sativa)GA生物合成关键酶基因OsGA20ox1启动子(pOsGA20ox1)的克隆：设计PCR引物pOsGA20ox1-F(5’CAAGCTTCTCTCTTCTATGCCACCAGTTC)和pOsGA20ox1-R(5’TGGATCCTGTTGATAATCTAGCTATCAATCAATTA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA20ox1的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：2)。

水稻(Oryza sativa)GA生物合成关键酶基因OsGA3ox1启动子(pOsGA3ox1)的克隆：设计PCR引物pOsGA3ox1-F(5’CAAGCTTAATTTGCCACAAAGTATGAAATTCGTCC)和pOsGA3ox1-R(5’GGGATCCAACTCGTTGGCTAACGCACA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsGA20ox1的5’端的序列。进一步使用引物pOsGA3ox1-MF(5’GAACAAAGCATGATCCGATCCTATCCATTTCTGA)和pOsGA3ox1-MR(5’GGATCGGATCATGCTTTG TTCTAATTTAGTTCATTG)进行点突变，去除启动子内部HindIII位点。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：3)。

玉米(Zea mays)auxin import carrier1(AUX1)基因启动子(pAUX1)的克隆：人工合成的AUX1基因启动子，序列为SEQ ID NO：4，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子pAUX1。

水稻(Oryza sativa)ARGOS基因OsARGOS启动子(pOsARGOS)的克隆：设计PCR引物pOsARGOS-F(5’CAAGCTTCGGCAGCAACGGACTGAGAG)和pOsARGOS–R(5’TGGATCCAGCGAGCTTGAGCTAGCTTAGCTC)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsARGOS的5’端的序列。进一步使用引物pOsARGOS-MF(5’CTATGCGTAAGCTATACGTAGGACAGGTCACATTAT)和pOsARGOS-MR(5’GTGACCTGTCCTACGTATAGCTTACGCATAGATAGATAG)进行点突变，去除启动子内部HindIII位点。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：6)。

玉米(Zea mays)CYP78A1基因的启动子片段pCYP78A1通过PCR获得。设计PCR引物：pCYP78A1-F(5’AAGCTTCTCCAAGCGAGTGCTAACACTC)和pCYP78A1-R(5’AGATCTTTCTGGCTAGCTGCTTCTAGTAGC)。以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得CYP78A1基因的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BglII双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：8)。

玉米(Zea mays)HD-Zip基因ZmHDZ18启动子(pZmHDZ18)的克隆：设计PCR引物pZmHDZ18-F(5’AGGATCCGTACATGGATCACGTTGAGAAAGCCCT)和pZmHDZ18-R(5’CGGGATCCTATATAAGCGCCGGGCAGAGAAAGAT)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得ZmHDZ18基因的5’端的序列。进一步使用引物pZmHDZ18-MR(5’GCGCTTGGATGCAAAATATCGTCTCGGGAGGTC)和pZmHDZ18-MF(5’CGATATTTTGCATCCAAGCGCACCACTTTGGTGA)进行点突变，去除启动子内部BamHI位点。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。最后，通过BamHI单酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：9)。

玉米(Zea mays)HD-Zip基因ZmHDZ20启动子(pZmHDZ20)的克隆：设计PCR引物pZmHDZ20-F(5’GAAGCTTGTGGTGGCTCGGGCGCATATCTAGGT)和pZmHDZ20-R(5’CCAGATCTAAGCTGAGCCCCAACTCCATCCTGCC)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得ZmHDZ20基因的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃130秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.1kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BglII双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：10)。

玉米(Zea mays)HD-Zip基因ZmHDZ26启动子(pZmHDZ26)的克隆：设计PCR引物pZmHDZ26-F(5’GCAAGCTTCCTTGTATGGTTGCAATGCCGACCACTC)和pZmHDZ26-R(5’AGGATCCGGGCAGGATTAAAAAAACCGCATGGCGAT)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得ZmHDZ26基因的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：13)。

玉米(Zea mays)HD-Zip基因ZmHDZ32启动子(pZmHDZ32)的克隆：设计PCR引物pZmHDZ32-F:CGGATCCTTCTGATCTTGCGTAGGAGATAGTTTAATTTC)和pZmHDZ32-R:AAAGCTTAGCAAGCAATGGATCAGCTACCACTTGAGAAT)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得ZmHDZ32基因的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃130秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.1kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：15)。

水稻(Oryza sativa)HD-Zip基因OsHDZ3启动子(pOsHDZ3)的克隆：设计PCR引物pOsHDZ3-F(5’CCGGGATCCGACGAGTCTAGTGTCCATATAGGAA)和pOsHDZ3-R(5’TGGATCCTGCAGAAGCGGCTCAGCAAGAGAA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsHDZ3的5’端的序列。进一步使用引物pOsHDZ3-MF(5’CAGGAGCCAAGCATCCACCATTCCAACAAGTT)和pOsHDZ3-MR(5’GAATGGTGGATGCTTGGCTCCTGATTTGAACC)进行点突变，去除启动子内部BamHI位点。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.9kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。最后，通过BamHI单酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：17)。

水稻(Oryza sativa)HD-Zip基因OsHDZ12启动子(pOsHDZ12)的克隆：设计PCR引物pOsHDZ12-F(5’CCGAAGCTTGCTCTTCTCTCTCATCGTTTATC)和pOsHDZ12-R(5’CGGGATCCAACCCAAAAGAGCAAAAACA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsHDZ12基因的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：18)。

水稻(Oryza sativa)HD-Zip基因OsHDZ20启动子(pOsHDZ20)的克隆：设计PCR引物pOsHDZ20-F(5’CCAAGCTTCATGTAGCACGATCATGTCTATTAGAGT)和pOsHDZ20-R(5’CCGGATCCCTACTGTCTCACGACGTGAAATTC)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsHDZ20基因的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：19)。

水稻(Oryza sativa)HD-Zip基因OsHDZ25启动子(pOsHDZ25)的克隆：设计PCR引物pOsHDZ25-F(5’GGAAGCTTATAGGAGAGCTTAGTCACAGTGTCTTAG)和pOsHDZ25-R(5’AGGATCCCCTACACGTTCACACACGTAAGCA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsHDZ25基因的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：20)。

2、根特异性启动子的克隆

水稻(Oryza sativa)COS9基因OsCOS9启动子(pOsCOS9)的克隆：设计PCR引物pOsCOS9-F(5’AAATAAGCTTGTTTGGTGCTCCATGGTGC)和pOsCOS9-R(5’GGAGATCTAGCCTCTGTCCTACTATGTATCTG)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsCOS9的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃100秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约1.5kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BglII双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ IDNO：22)。

水稻(Oryza sativa)Os03g01700基因启动子(pOs03g01700)的克隆：设计PCR引物pOs03g01700-F(5’AAAGCTTCGTGTCGATCATGTCGCAGTTGC)和pOs03g01700-R(5’TTCGGATCCTTCGATCGACCACCACCTAGC)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得Os03g01700的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃160秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.6kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：23)。

水稻(Oryza sativa)RCc3基因OsRCc3启动子(pOsRCc3)的克隆：设计PCR引物pOsRCc3-F(5’AGGATCCGACAACTGGTAAGCAACCCAGCTTC)和pOsRCc3-R(5’ACGCAGATCTCCGAGATCGATCGATCACAAGC)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsRCc3的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃130秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.1kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BglII双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ IDNO：24)。

水稻(Oryza sativa)NAC10基因OsNAC10启动子(pOsNAC10)的克隆：设计PCR引物pOsNAC10-F(5’CCAAGCTTCCCGTCAAACGCTGCCATTATAC)和pOsNAC10-R(5’ATGTTGGATCCTTCAATCGGCTCGCCTAGCT)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsNAC10的5’端的序列。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃150秒，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.4kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：25)。

3、TEL基因自身组织特异性启动子的克隆

玉米(Zea mays)Mei2-like基因启动子(pZmTE1)的获得：设计PCR引物pZmTE1-FAAGCTTGCGGTTGCCCAGGGCATGTGTCTA)和pZmTE1-R(5’GGATCCCCCCCACCCTCCATGGCTAGAG)，以商业玉米品种郑单958基因组为模板，通过PCR扩增获得pZmTE1。进一步使用引物pZmTE1-MF(5’TTGCAGAGGATGCGAGCTAAAACAATCCAGCACA)和pZmTE1-MR(5’TGTTTTAGCTCGCATCCTCTGCAACGACAGCAC)进行点突变，去除启动子内部BamHI位点。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子pZmTE1，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQID NO：26)。

水稻(Oryza sativa)Mei2-like基因启动(pOsTE1)子的克隆：设计PCR引物pOsTE1-F(5’AAGCTTGAAACTAGTACTAGACATTACTCTTCCAATGCA)和pOsTE1-R(5’AGAGGATCCTGCAGCAGCACTTACCTACCCTACCA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得pOsTE1。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克到T-载体pMD19中。进一步使用引物OsTE-PRO-DELF(5’AGATCCGAGCAAAAAACAGGGCC)和OsTE-PRO-DELR(5’TCTATAGCGATAGAACTGTTTGATCTGGGTAGC)进行点突变，去除启动子内部BamHI位点。最后，通过HindIII和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：27)。

大豆(Giycine max)Mei2-like基因启动子(pGmTE1)的克隆：设计PCR引物pGmTE1-F(5’AGGAAGCTTGAAAGAACGTAGTCCCTTCTTAAAAATGGTG)和pGmTE1-R(5’AGGGGATCCTCAAATCTCACTCACTCGCCTCTTTTCCTCA)，以商业大豆品种天隆1号基因组为模板，通过PCR扩增获得pGmTE1。PCR反应条件为：：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2.5分钟，重复30个循环；然后72℃10分钟。将获得的大约2.5kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。通过HindIII和BamHI酶切以后，获得一个2.5kb的启动子。启动子的DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：28)。表1：组织特异性启动子的范例及其核苷酸序列

实施例2.TEL基因的克隆

玉米(Zea mays)TE1基因cDNA的克隆：设计PCR引物ZmTE1-F(5’GAGGATCCAACAGAATTCATGGGTGGGTTC)和ZmTE1-R(5’GCGGTCTAGATTACTAGTCGTCGTAGCCAAGC)，以商业玉米品种郑单958的总cDNA为模板，通过PCR扩增获得大小约为2kb的TE1的cDNA片段。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复33个循环；72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。然后，通过BamHI和XbaI双酶切得到ZmTE1，并且DNA序列测定表明其核苷酸序列正确(SEQ ID NO：29)。之后，把酶切获得的cDNA以及合成的终止子ter1(核苷酸序列为SEQ IDNO：33)通过XbaI连接，获得结构为(BamHI)ZmTE1-ter1(KpnI)结构的核苷酸序列，用于和本发明中的组织特异性启动子连接。

水稻(Oryza sativa)OsTEL基因cDNA的克隆：设计PCR引物OsTEL-F(5’GGATCCACCATGGAGGAAGGAGGTGGGA)和OsTEL-R(5’ACTCGAGCTAGTCAGTGTAGCCTAGGCGCT)，以商业玉米品种郑单958的总cDNA为模板，通过PCR扩增获得大小约为2kb的TE1的cDNA片段。PCR反应条件为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃15秒，72℃2分钟，重复33个循环；72℃10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。最后，通过BamHI和XhoI双酶切得到OsTEL，并且DNA序列测定表明其的核苷酸序列正确(SEQ ID NO：30)。之后，把酶切获得的cDNA以及合成的终止子ter2(核苷酸序列为SEQ ID NO：34)通过XhoI连接，获得结构为(BamHI)OsTEL-ter1(KpnI)结构的核苷酸序列，用于和本发明中的组织特异性启动子连接。

大豆(Giycine max)TEL基因GmTEL1和GmTEL2通过人工合成，它们的核苷酸序列分别为SEQID NO：31和SEQ ID NO：32，5’和3’端的酶切位点分别为BamHI和XhoI。之后，把酶切获得的cDNA以及合成的终止子ter2(核苷酸序列为SEQ ID NO：34)通过XhoI连接，获得结构为(BamHI)OsTEL-ter1(KpnI)结构的核苷酸序列，用于和本发明中的组织特异性启动子连接。

实施例3.组织特异性启动子调控的TEL基因的表达载体的构建

双元载体pCambia1300-G10载体(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069:SEQ ID NO.49)包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)(作为转化的标记基因)和连入目标基因表达框的多克隆位点。

可以把实施例1中克隆到的组织特异性启动子和实施例2中克隆到的TEL基因通过BamHI和BamHI，或者同位酶BamHI和BglII连接，形成“组织特异性启动子-TEL基因-终止子-pZmUbi-EPSPS-终止子”(图1)的T-DNA结构，通过上述方法获得的T-DNA载体如表2。

表2：组织特异性启动子和TEL基因组成的T-DNA载体

启动子	基因	T-DNA载体名称
			pZmGA20ox-1	ZmTE1	pCambia1300-pZmGA20ox-1-ZmTE1-pZmUbi-1174
pZmAUX1	ZmTE1	pCambia1300-pZmAUX1-ZmTE1-pZmUbi-1174
			pOsARGOs	ZmTE1	pCambia1300-pOsARGOs-ZmTE1-pZmUbi-1174
pZmCYP78A1	ZmTE1	pCambia1300-pZmCYP78A1-ZmTE1-pZmUbi-1174
			pZmhdz18	ZmTE1	pCambia1300-pZmhdz18-ZmTE1-pZmUbi-1174
pZmhdz20	ZmTE1	pCambia1300-pZmhdz20-ZmTE1-pZmUbi-1174
			pZmhdz26	ZmTE1	pCambia1300-pZmhdz26-ZmTE1-pZmUbi-1174
pZmhdz32	ZmTE1	pCambia1300-pZmhdz26-ZmTE1-pZmUbi-1174
			pOsCOS9	ZmTE1	pCambia1300-pOsCOS9-ZmTE1-pZmUbi-1174

pOsRCc3	ZmTE1	pCambia1300-pOsRCc3-ZmTE1-pZmUbi-1174
			pZmTE1	ZmTE1	pCambia1300-pZmTE1-ZmTE1-pZmUbi-1174
pOsGA20ox-1	OsTEL	pCambia1300-pOsGA20ox-1-OsTEL-pZmUbi-1174
			pOsGA3ox-1	OsTEL	pCambia1300-pOsGA3ox-1-OsTEL-pZmUbi-1174
pOsARGOs	OsTEL	pCambia1300-pOsARGOs-OsTEL-pZmUbi-1174
			pOshdz3	OsTEL	pCambia1300-pOshdz3-OsTEL-pZmUbi-1174
pOshdz12	OsTEL	pCambia1300-pOshdz12-OsTEL-pZmUbi-1174
			pOshdz20	OsTEL	pCambia1300-pOshdz20-OsTEL-pZmUbi-1174
pOshdz25	OsTEL	pCambia1300-pOshdz25-1-OsTEL-pZmUbi-1174
			pOsCOS9	OsTEL	pCambia1300-pOsCOS9-OsTEL-pZmUbi-1174
pOsRCc3	OsTEL	pCambia1300-pOsRCc3-OsTEL-pZmUbi-1174
			pOs03g01700	OsTEL	pCambia1300-pOs03g01700-OsTEL-pZmUbi-1174
pOsNAC10	OsTEL	pCambia1300-pOsNAC10-OsTEL-pZmUbi-1174
			pOsTEL1	OsTEL	pCambia1300-pOsTEL1-OsTEL-pZmUbi-1174
pGmTEL1	GmTEL1	pCambia1300-pGmTEL1-GmTEL1-pZmUbi-1174
			pGmTEL1	GmTEL2	pCambia1300-pGmTEL1-GmTEL2-pZmUbi-1174
pZmAUX1	GmTEL1	pCambia1300-pZmAUX1-GmTEL1-pZmUbi-1174

最后，通过电转的方法把上述表2中的T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。

实施例4.具有增强子的组织特异性启动子调控的TEL基因的表达载体的构建

双元载体pCambia1300-p35S-G10载体(Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069:SEQ ID NO.47)包含一个耐草甘膦基因(EPSPS)(作为转化的标记基因)，p35S启动子(作为目标基因的增强子)与连入目标基因表达框的多克隆位点。

可以把实施例1中克隆到的组织特异性启动子和实施例2中克隆的TEL基因通过BamHI和BamHI，或者同位酶，BamHI和BglII连接，形成“组织特异性启动子-TEL基因-终止子p35S-pZmUbi-EPSPS-终止子”(图2)的T-DNA结构。通过上述方法获得的T-DNA载体如表3。

表3：受增强子调控的组织特异性启动子和TEL基因组成的T-DNA载体

启动子	基因	T-DNA载体名称
			pZmGA20ox-1	ZmTE1	pCambia1300-pZmGA20ox-1-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
pZmAUX1	ZmTE1	pCambia1300-pZmAUX1-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
			pOsARGOs	ZmTE1	pCambia1300-pOsARGOs-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
pZmCYP78A1	ZmTE1	pCambia1300-pZmCYP78A1-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
			pZmhdz18	ZmTE1	pCambia1300-pZmhdz18-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
pZmhdz20	ZmTE1	pCambia1300-pZmhdz20-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
			pZmhdz26	ZmTE1	pCambia1300-pZmhdz26-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
pZmhdz32	ZmTE1	pCambia1300-pZmhdz26-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
			pOsCOS9	ZmTE1	pCambia1300-pOsCOS9-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
pOsRCc3	ZmTE1	pCambia1300-pOsRCc3-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
			pZmTE1	ZmTE1	pCambia1300-pZmTE1-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174
pOsGA20ox-1	OsTEL	pCambia1300-pOsGA20ox-1-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
			pOsGA3ox-1	OsTEL	pCambia1300-pOsGA3ox-1-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
pOsARGOs	OsTEL	pCambia1300-pOsARGOs-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
			pOshdz3	OsTEL	pCambia1300-pOshdz3-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
pOshdz12	OsTEL	pCambia1300-pOshdz12-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
			pOshdz20	OsTEL	pCambia1300-pOshdz20-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
pOshdz25	OsTEL	pCambia1300-pOshdz25-1-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
			pOsCOS9	OsTEL	pCambia1300-pOsCOS9-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
pOsRCc3	OsTEL	pCambia1300-pOsRCc3-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
			pOs03g01700	OsTEL	pCambia1300-pOs03g01700-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
pOsNAC10	OsTEL	pCambia1300-pOsNAC10-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
			pOsTEL1	OsTEL	pCambia1300-pOsTEL1-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174
pGmTEL1	GmTEL1	pCambia1300-pGmTEL1-GmTEL1-p35S-pZmUbi-1174
			pGmTEL1	GmTEL2	pCambia1300-pGmTEL1-GmTEL2-p35S-pZmUbi-1174
pZmAUX1	GmTEL1	pCambia1300-pZmAUX1-GmTEL1-p35S-pZmUbi-1174

最后，通过电转的方法把上述表3中的T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50μg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。

实施例5、玉米的转化

玉米的转化技术已经比较成熟。参考文献如:Vladimir Sidorov&David Duncan(in M.Paul Scott(ed.),Methods in MolecularBiology:TransgenicMaize,vol:526；Yuji Ishida,Yukoh Hiei&Toshihiko Komari(2007)Agrobacterium-mediated transformation of maize.Nature Protocols 2:1614-1622。基本方法如下：

取授粉后8-10天的Hi-II玉米穗，收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将含有T-DNA载体(表2和表3中ZmTE1基因与不同启动子连接构成的载体及含有筛选标记基因EPSPS的空载体)转化农杆菌获得的重组农杆菌与未成熟胚在共培养培养基上(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma7921)+40mg/L乙酰丁香酮)共培养2-3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(MS+2mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+5mg/L AgNO₃+200mg/L乙酰丁香酮)，28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基(与愈伤诱导培养基相同)上，28℃暗培养2-3周。转移所有的组织到新鲜含2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基(MS+30g/L蔗糖+0.5mg/L kinetin+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基(1/2MS+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite+200mg/L乙酰丁香酮)上，26℃光照培养直到根发育完全。分别获得含上述转化载体以及只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株。

实施例6、转基因玉米的鉴定

我们使用的转基因受体植株为容易转化，但是农艺性状很差的品种Hi-II。为了准确的研究转化载体对玉米品系的影响，我们把获得的对照品系和目标载体转基因品系分别与以商业玉米品种郑单958的母本进行1次杂交和连续回交8次再挑选近等位基因系自交2次，获得稳定的近等位基因自交系。然后，把对照品系和目标载体转基因品系分别与郑单958的父本杂交，获得的杂交种子用于比较和分析。

将实施例5获得的转基因玉米植株和空载体对照植株的产量相关性状进行比较分析。

我们获得的85个转pCambia1300-pZmAUX1-ZmTE1-pZmUbi-1174载体的转基因品系(命名为AU)中有15个品系和对照相比生长势增强、株高显著增加、棒子变大、粒重增加、生物量增加且产量增加。

其中两个典型品系的产量相性状的表型如下如表4。

表4：两个典型品系与对照品系的比较

	AU-18	AU-46
			株高	10.5％	9.5％
千粒重	25.4％	16.4％
			生物量	13.1％	11.2％
产量	12.1％	10.8％

*表格中的参数都经过F-Test检验(P≤0.05)且都是和对照相比大于5％的。CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株；AU为载体pCambia1300-pZmAUX1-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中AU后面的编号(18，46)是对不同品系随机编号，用于区分不同的转化事件。

表2中ZmTE1基因与不同启动子连接构成的载体转基因玉米植株的表型变化和AU类似，15％以上的转基因植株和空载体对照植株相比产量相关性状都有显著改良且产量增加。另外的品系和对照相比表型变化都比较小。

我们获得的94个转pCambia1300-pZmAUX1-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174载体的转基因品系(命名为SAU)中有65个品系和对照相比生长势增强、株高显著增加、棒子变大、粒重增加、生物量增加且产量增加。其中两个典型品系的产量相性状的表型如下如表5。

表5：两个典型品系与对照品系的比较

	SAU-3	SAU-85
			株高	16.5％	25.3％
千粒重	25.9％	30.2％
			生物量	14.1％	18.5％
产量	13.2％	14.6％

*表格中的参数都经过F-Test检验(P≤0.05)且都是和对照相比大于5％的。其中CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因玉米植株；AU为载体pCambia1300-pZmAUX1-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中AU后面的编号(3，85)是对不同品系随机编号，用于区分不同的转化事件。

表3中ZmTE1基因与不同启动子连接构成的载体转基因玉米植株的表型变化和SAU类似，65％以上的转基因植株和空载体对照植株相比产量相关性状都有显著改良且产量增加。另外的品系和对照相比表型变化都比较小,还有个别品系的表型出现了畸形。

作为对照，我们获得了组成型表达启动子花椰菜花叶病毒35S启动子(p35S)调控ZmTE1的表达载体pCambia1300-p35S-ZmTE1-p35S-pZmUbi-1174，通过实施例5的方法获得了82个转基因品系，其中65个品系和空白载体对照相比没有表型变化的，17个品系和空白载体对照相比出现了如严重不育、开花严重延迟、株型不协调等畸形表型。

实施例7、水稻的转化

转基因水稻的获得方法是采用现有技术(卢雄斌，龚祖埙(1998)生命科学10：125-131；刘凡等(2003)分子植物育种1：108-115)。选取成熟饱满的“秀水-134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取含表2和表3中OsTEL基因与不同启动子连接构成的载体以及含标记基因EPSPS的空载体分别进行农杆菌划板。挑单菌落接种，即为含OsTEL基因与不同启动子的重组农杆菌及其含有标记基因EPSPS的空载体的重组农杆菌，准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD为0.6左右的重组农杆菌菌液中(重组农杆菌菌液的制备：将重组农杆菌接种至培养基，28℃培养至OD为0.6左右；培养基组成：3g/L K₂HPO₄、1g/L NaH₂PO₄、1g/L NH₄Cl、0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.15g/LKCl、0.01g/L CaCl₂、0.0025g/L FeSO₄·7H₂O、5g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，溶剂为水，pH＝5.8)，让重组农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮)中，28℃共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L琼脂(sigma 7921)+20mg/L乙酰丁香酮+2mM草甘膦(Sigma))上，28℃筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基(MS+0.1g/L肌醇+5mg/L ABA+1mg/L NAA+5mg/L 6-BA+20g/L山梨醇+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上28℃培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基上，每天14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/LNAA+20g/L蔗糖+2.5g/L gelrite)上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，选择产量高、种子大或者生物量高等能够提高水稻产量的转基因株系，培育新品种。分别获得含上述转化载体以及只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻植株。

实施例8、转基因水稻的鉴定

水稻是自交系，我们用获得的目标基因转基因水稻品系和空载体对照品系的纯合子用于表型的分析和比较。

将实施例7获得的转基因水稻品系和空载体对照品系的产量相关性状进行比较分析。

我们获得的210个转pCambia1300-pOsGA20ox-1-OsTEL-pZmUbi-1174载体的转基因品系(命名为G20O1)中有36个品系和对照相比生长势增强、株高显著增加、粒重增加、生物量增加且产量增加。

其中两个典型品系的产量相性状的表型如下如表6。

表6：两个典型品系与对照品系的比较

	G20O1-54	G20O1-112
			株高	12.5％	14.2％
千粒重	19.9％	22.4％
			生物量	10.8％	12.8％
产量	10.2％	13.2％

*表格中的参数都经过F-Test检验(P≤0.05)且都是和对照相比大于5％的。其中CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻品系；G20O1为载体pCambia1300-pOsGA20ox-1-OsTEL-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中G20O1后面的编号(54，112)是对不同品系随机编号，用于区分不同的转化事件。

表2中OsTEL基因与不同启动子连接构成的载体获得的转基因水稻品系的表型变化和G20O1类似，16％以上的转基因植株和空载体对照植株相比产量相关性状都有显著改良且产量增加。另外的品系和对照相比表型变化都比较小。

我们获得的245个转pCambia1300-pOsGA20ox-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174载体的转基因品系(命名为SG20O1)中有182个品系和对照相比生长势增强、株高显著增加、粒重增加、生物量增加且产量增加。其中两个典型品系的产量相性状的表型如下如表7。

表7：两个典型品系与对照品系的比较

	SG20O1-14	SG20O1-125
			株高	24.1％	30％
千粒重	26.2％	35.2％
			生物量	14.2％	24.1％
产量	13.8％	18.8％

*表格中的参数都经过F-Test检验(P≤0.05)且都是和对照相比大于5％的。其中CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因水稻品系；SG20O1为载体pCambia1300-pOsGA20ox-1-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中SG20O1后面的编号(14，125)是对不同品系随机编号，用于区分不同的转化事件。

表3中OsTEL基因与不同启动子连接构成的载体转化获得的转基因水稻品系的表型变化和SG20O1类似，70％以上的转基因植株和空载体对照植株相比产量相关性状都有显著改良且产量增加。另外的品系和对照相比表型变化都比较小,还有个别品系的表型出现了畸形。

作为对照，我们获得了组成型表达启动子花椰菜花叶病毒35S启动子(p35S)调控OsTEL的表达载体pCambia1300-p35S-OsTEL-p35S-pZmUbi-1174，通过实施例7的方法获得了191个转基因品系，其中153个品系和空白载体对照相比没有表型变化的，38个品系和空白载体对照相比出现了如严重不育、开花严重延迟、株型不协调等畸形表型。

实施例9、大豆的转化

大豆的遗传转化技术目前比较成熟。例如Kan Wang(2006)Agrobacterium transformation ProtocalsSecond Edition Volume 1Humana Press就有详细的说明。马丽萍等也发表了详细的转化方法(马丽萍等(2008)一种快速、高效的大豆农杆菌转化技术，中国农业科学41:661-668)。下面是大豆转化的方法描述：

挑选饱满健康的成熟大豆种子，放入含有氯气(5％NaOCl和3.5ml 12N HCl反应生成)的密闭容器内，消毒24h。将消毒后的大豆种子播种于发芽培养基(B5培养基)(Gamborg O L,Miller R A,Ojima K.(1968)Experimental cell research,50:151-158)中，于25℃环境下光照18小时/暗6小时培养，催芽，至子叶变绿，而第一片真叶尚未完全长出，去掉种皮、根、原叶，保留3-5mm下胚轴将子叶从中竖直切开，得到两片各含有一片子叶，半个下胚轴和半个上胚轴外植体材料。子叶，胚尖朝上垂直接种于共培养培养基(1/10B5大量和微量元素，1/10MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，1mg/L BA，200μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.4)培养基中，进行预培养。

挑含表2和表3中GmTEL1和GmTEL2基因与不同启动子连接构成的载体的单克隆，接种至培养基(组分为：3g/L K₂HPO₄、1g/L NaH₂PO₄、1g/L NH₄Cl、0.3g/L MgSO₄·7H₂O、0.15g/L KCl、0.01g/L CaCl₂、0.0025g/L FeSO₄·7H₂O、5g/L蔗糖，溶剂为水，pH＝5.8)，28℃摇菌到OD600＝0.8-1.0，离心10min，收集菌体，重悬于液体共培养培养基(1/10的B5大量和微量元素；1/10的MS铁盐，B5维生素，3％蔗糖，1mg/L的BA，200μmol/L的乙酰丁香酮，pH 5.4)，获得农杆菌工程菌液。从预培养基(MS+30g/L蔗糖+2.5g/L gelrite,pH 5.8)上取预培养24h的外植体转移到事先制备好的农杆菌工程菌液中，侵染30分钟。侵染后的外植体转到共培养培养基中25度共培养3天。三天后将外植体上的菌洗去，转到芽诱导培养基上(B5大量和微量，MS铁盐，3％蔗糖，1.68mg/L BAP，400mg/Ltimentin，2.5g/L gelrite，pH 5.6)，25度培养14天，转移外植体到含有2mM的草甘膦的芽诱导培养基上，25度培养14天。然后切去子叶和死掉的组织，转移外植体到含有1mM草甘膦的芽伸长培养基上(MS大量、微量和铁盐，B5维生素，3％蔗糖，0.1mg/L IAA，0.5mg/L GA3，1mg/L ZR，200mg/Ltimentin，2.5g/L gelrite，pH 5.6)培养14天。将健康的至少有3片叶子的芽转到生根培养基(1/2B5，MS铁盐，2％蔗糖，1mg/L IBA，pH 5.6)上进行生根培养。获得含表2和表3中GmTEL1和GmTEL2基因与不同启动子连接构成的载体和只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因大豆植株。

实施例10、转基因大豆的鉴定

大豆是自交系，我们用获得目标基因转基因大豆品系和空载体对照品系的纯合子用于表型的分析和比较。

将实施例9获得的转基因大豆品系和空载体对照品系的产量相关性状进行比较分析。

我们获得的45个转pCambia1300-pZmAUX1-GmTEL1-pZmUbi-1174载体的转基因品系(命名为AUGmTEL1)中有8个品系和对照相比生长势增强、株高显著增加、粒重增加、生物量增加且产量增加。其中两个典型品系的产量相性状的表型如下如表8。

表8：两个典型品系与对照品系的比较

	AUGmTEL1-5	AUGmTEL1-36
			株高	11.5％	15％
千粒重	11.2％	14.1％
			生物量	8.9％	12.5％
产量	8.5％	11.8％

*表格中的参数都经过F-Test检验(P≤0.05)且都是和对照相比大于5％的。其中CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因大豆品系；AUGmTEL1为载体pCambia1300-pZmAUX1-GmTEL1-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中AUGmTEL1后面的编号(5，36)是对不同品系随机编号，用于区分不同的转化事件。

表3中GmTEL基因与不同启动子连接做构成的载体载体转基因水稻品系的表型变化和AUGmTEL1类似，16％以上的转基因品系和空载体对照品系相比产量相关性状都有显著改良且产量增加。另外的品系和对照相比表型变化都比较小。

我们获得的49个转pCambia1300-pZmAUX1-GmTEL1-p35S-pZmUbi-1174载体的转基因品系(命名为SAUGmTEL1)中有25个品系和对照相比生长势增强、株高显著增加、粒重增加、生物量增加且产量增加。其中两个典型品系的产量相性状的表型如下如表9。

表9：两个典型品系与对照品系的比较

	SAUGmTEL1-9	SAUGmTEL1-42
			株高	14.3％	17.1％
千粒重	13.6％	16.5％
			生物量	11.6％	14.6％
产量	10.9％	13.1％

*表格中的参数都经过F-Test检验(P≤0.05)且都是和对照相比大于5％的。其中CK为只含有筛选标记基因EPSPS的空载体的转基因大豆品系；SAUGmTEL1为载体pCambia1300-pZmAUX1-GmTEL1-p35S-pZmUbi-1174的T-DNA转化植株，其中SAUGmTEL1后面的编号(9，42)是对不同品系随机编号，用于区分不同的转化事件。

表3中OsTEL基因与不同启动子连接做构成的载体载体转基因水稻品系的表型变化和SG20O1类似，50％以上的转基因品系和空载体对照品系相比产量相关性状都有显著改良且产量增加。另外的品系和对照相比表型变化都比较小,还有个别品系的表型出现了畸形。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种组织特异性启动子在调控农作物产量中的应用，其特征在于所述的应用是利用组织特异性启动子调控农作物TEL基因的表达，实现农作物产量的提高；所述组织特异性启动子包括对农作物茎尖分生区、花尖分生区、花原基、花序、穗子、种子和根中至少一个或者一个以上的组织或器官有转录活性的启动子。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述组织特异性启动子包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述组织特异性启动子为下列之一：SEQ ID NO.1、SEQID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述利用组织特异性启动子调控TEL基因的表达过程中还包括至少引入一个增强子。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述增强子引入到组织特异性启动子和TEL基因及其终止子构成的表达框任意一端30kb以内的位置。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述增强子是CaMV 35S增强子。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述农作物包括玉米、水稻、小麦、高粱、大麦、甘蔗、大豆、棉花、油菜和向日葵。