CN115820721B - 提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法和一种启动子核心序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及作物育种技术领域，具体涉及精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法和一种启动子核心序列及应用。本方法为对大白果糯的D14基因的启动子区域进行用于降低D14基因的表达水平的基因编辑。直接对独脚金内酯通路关键基因的编码区进行操作会导致水稻分蘖数过高，不利于水稻单株产量的提高。本方案对D14基因的启动子区域进行基因编辑，可以适当降低基因表达量，进而实现对分蘖数的控制。本发明可以应用于水稻分蘖和产量的精确提高及贵州地方优质水稻的分子育种实践，从而实现对优质稻米分蘖和产量的协同提高，解决贵州地方优质稻分蘖少、产量较低，难以推广种植导致种质资源难以保存的问题。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及作物育种技术领域，具体涉及精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法和一种启动子核心序列及应用。
背景技术
水稻是最重要的粮食作物，中国65%的人口以稻米为主食。分蘖是水稻等单子叶植物基部的特殊分枝，与水稻产量密切有关。一般情况下，粳稻中花11野生型的分蘖数在10-15个，其分蘖数增加到20-30个有利于单株产量的提高。粳稻日本晴野生型的分蘖数在20-25个，其分蘖数提高到30-40个有利于水稻单株产量的提高。这是因为一定数量的水稻分蘖数与单株产量呈正相关，但分蘖过多又会产生无效分蘖，导致产量降低。因此，如何精准增加水稻分蘖数使其保持在合理、有效的范围，提高分蘖较少的水稻的单产，已成为制约水稻品种在农业生产上应用的关键限制因素。
“大白果糯”是贵州的优质特色种质资源，本方案的实验材料收集于贵州省盘州市旧营乡旧营村，“大白果糯”在贵州兴仁、遵义和黔东南地区也种植较多。“大白果糯”种质资源保存于贵州大学水稻产业技术研究院和云贵高原特色作物省级种质资源圃。其米饭天然清香，口感绵软、粘性适中、适口性好，为米中精品。但“大白果糯”分蘖数较少（4个左右），导致其单产较低，亩产平均两百多公斤，品质好但产量不高限制了其推广和应用，如何提高“大白果糯”的产量是当下亟待解决的问题。
大量研究表明独脚金内酯途径调控水稻分蘖的效果非常明显，其合成途径及其信号转导中多个关键基因的编码区突变均导致水稻分蘖数成倍增加。例如：植物激素独脚金内酯（SLs）途径调控水稻分蘖非常明显。独脚金内酯由下向上运输，抑制水稻分蘖芽的伸长，其中D27、D17、D10位于SLs合成途径中，D14、D3和D53位于SLs信号传导途径中。SLs的受体D14基因编码一个水解酶/酯酶，负调控水稻分蘖，日本晴背景的d14突变体分蘖数达到了116个，而日本晴野生型对照分蘖数只有22个。除了d14外，D27、D17、D10、D14、D3、D53和OsTB1/FC1（水稻TCP家族基因，抑制水稻分蘖）对水稻分蘖的调控均非常明显。但过高的分蘖数并不利于水稻单株产量的提高。如果对这些基因的编码区进行敲除，会导致其基因功能完全丧失，使得水稻分蘖数大幅度增加，最终不利于单株产量提高。
如何协调水稻特别是“大白果糯”的品质和产量，保持水稻相对较高的分蘖数且不改变其品质（即分蘖数适当），既是提高水稻产量的现实需要，也是农业可持续发展的需要。
发明内容
本发明意在提供精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，以解决现有技术中的贵州优质特色稻大白果糯分蘖数少以及产量低的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，对大白果糯的D14基因的启动子区域进行用于降低D14基因的表达水平的基因编辑。
本方案还提供了一种精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法在水稻分子育种中的应用。
本方案的原理及优点是：
经研究发现植物激素独脚金内酯调控水稻分蘖的效果非常明显，其合成途径及其信号转导中多个关键基因的编码区突变均导致水稻分蘖数成倍增加，但过高的分蘖数并不利于水稻单株产量的提高。如果对这些基因的编码区进行敲除，会导致其基因功能完全丧失，使得水稻分蘖数大幅度增加，最终不利于单株产量提高。本发明利用基因编辑技术在“大白果糯”中对独脚金内酯的受体基因D14基因启动子序列多个区段进行了敲除，发现其ATG上游一个特殊区段敲除后，D14基因表达适度下降，“大白果糯”分蘖数从4个增加到9个左右，单株产量从6g提高到17g左右。本发明可以应用于水稻分蘖和产量的精确提高和贵州地方优质稻的分子育种实践中。本发明提供了通过适度降低D14基因的表达提高大白果糯分蘖和产量的方法。本发明的具体实施例证明通过编辑D14基因的启动子序列，可实现精确提高贵州地方优质稻“大白果糯”的分蘖和产量，方便该品种的推广种植，便于优质种质资源的保存。
上述方法中，所述基因编辑可采用锌指核酸酶技术(Zincfingernuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶技术(Transcriptionactivator-likeeffector nuclease，TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统技术(Clusteredregularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9系统)，以及其它能实现基因组定点编辑的技术实现的。
进一步，所述启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述D14基因编码的蛋白质为：
A1：序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质；
或者A2：如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、与SEQ ID No.3具有80％以上的同一性且功能相同的蛋白质；
或者A3：在A1或者A2的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述方法中，序列表中的SEQ ID No.3由107个氨基酸残基组成。同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existencecost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11.1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述80％以上的同一性可为至少81％、85％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
进一步，所述基因编辑采用CRISPR/Cas9系统，其sgRNA的靶序列位于所述启动子区域中，且靶序列的3’端连接的序列为NGG；靶序列的长度为19-20bp，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。基因组编辑具体可借助CRISPR/Cas9系统实现。所述CRISPR/Cas9方法，其靶序列为位于D14基因中任一包括XXXNGG的核苷酸序列上的XXX序列。在所述启动子区域中设计CRISPR/Cas9系统的sgRNA的靶序列，可以有效保证目的基因的表达量适度降低。
进一步，所述靶序列位于D14基因的起始密码子上游1176-1154bp的区域以及D14基因的起始密码子上游1026-1004bp的区域；经基因编辑后，获得突变型大白果糯植株，所述大白果糯植株上的一个或者两个所述靶序列发生突变。
采用上述技术方案，经过基因编辑的大白果糯为满足如下条件的植株：D14基因的启动子区域碱基序列在一个或者两个sgRNA的靶点区域发生突变。经过基因改造的大白果糯理解为不仅包含第一代到第二代转基因水稻，也包括其子代。对于转基因水稻，可以在该物种中遗传该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因水稻包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本方案还提供了一种精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的试剂，其用于抑制D14基因的表达，和/或用于降低D14蛋白的丰度，和/或用于敲除D14基因；经所述试剂处理后获得突变植株，所述突变植株的D14基因表达量是野生型的0.3-0.7倍（基因表达量是指转录水平，mRNA）。
本方案还提供了一种精确提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的试剂在水稻分子育种中的应用。
本方案的原理及优点是：
研究表明，由于适度降低D14基因的表达可以促进水稻有效分蘖，所以采用相关试剂，用于抑制D14基因的表达，和/或用于降低D14蛋白的丰度，和/或用于敲除D14基因，可以有效促进大白果糯有效增产。
进一步，所述试剂包括CRISPR/Cas9系统，包括整合在CRISPR/Cas9载体上的sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；所述sgRNA1的靶序列如SEQ ID No.4所示，所述sgRNA2的靶序列如SEQ ID No.5所示。
在本发明的具体的实施方式中，CRISPR/Cas9系统的重组载体包括重组载体CRISPR-OsD14-2Target；重组载体CRISPR-OsD14-2Target含有sgRNA1表达盒pOsU3-OsD14gRNA、sgRNA2表达盒pOsU6a-OsD14gRNA和Cas9蛋白编码基因，能表达sgRNA1和sgRNA2以及Cas9。
本方案还提供了独脚金内酯受体D14基因的启动子核心序列，其序列为CT，其位于独脚金内酯受体D14基因的起始密码子上游1011—1010bp的区域。
本方案还提供了独脚金内酯受体D14基因的启动子核心序列在水稻分子育种中的应用。
本方案的原理及优点是：发明人通过对大白果糯D14基因的启动子序列进行大量基于CRISPR/Cas9系统的敲除实验，发现了影响D14基因表达的关键核心启动子，在今后的大白果糯育种实践中，我们可以定点对这个关键核心启动子序列进行操作，提升育种效率。
附图说明
图1为实施例1的不同水稻品种的表型、分蘖数、株高、直链淀粉、碱消值和胶稠度对比。
图2为实施例1的D14基因的启动子序列敲除靶标设计示意图。
图3为实施例1的载体骨架图。
图4为D14基因的启动子不同位点序列敲除后测序情况示意图。
图5为D14基因的启动子不同位点序列敲除突变体的D14基因的相对表达量（mean±SD，n=4）；D14基因的启动子不同位点序列敲除突变体的分蘖数（mean±SD，n=20）；D14基因的启动子不同位点序列敲除突变体的单株产量（mean±SD，n=20）。
图6为实施例2的D14基因启动子序列突变体株系D14-3-2的测序情况。
图7为实施例2的D14基因启动子序列突变体株系D14-3-17的测序情况。
图8为实施例2的D14基因启动子序列突变体株系D14-3-18的测序情况。
图9为实施例2的D14基因启动子序列突变体株系D14-3-19的测序情况。
图10为实施例2的D14基因启动子序列突变体4个株系整体植株表型。
图11为实施例2的D14基因启动子序列突变体4个株系D14基因的相对表达量（mean±SD，n=4）；实施例2的D14基因启动子序列突变体4个株系分蘖数比较（mean±SD，n=20）；实施例2的D14基因启动子序列突变体4个株系单株产量比较（mean±SD，n=20）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；MaXetal，Arobust CRISPR/Cas9 system forconvenient ,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants.MolPlant.2015,8(8):1274-1284.)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
表达载体pYLsgRNA-OsU3、pYLsgRNA-OsU6a（详见文献附图Figure 1.C：Overallstructure of the sgRNA intermediate vectors.）、双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H（详见文献附图Figure 1.B：Structures of the pYLCRISPR/Cas9 binary vectors based onthe pCAMBIA1300 backbone）以及CRISPR敲除载体构建方法可参见文献“Ma ,X .,et al.A robust CRISPR/Cas9 systemfor convenient ,high-efficiency multiplex genomeediting in monocot and dicot plants.Molecular Plant 8,1274-1284.(2015) .”。公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得上述载体。
以下实施例中所用转录本为D14-3，仅作为一个例子，不限制应用中的编辑位点。如未特别指明，实例均按照常规实验条件或产品说明书条件进行。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3’末端核苷酸。
实施例1：启动子敲除载体的构建
申请人前期已收集了贵州省优质稻“大白果糯”材料（材料种植于贵州贵阳），与常见粳稻中花11、糯稻贵州小红糯、籼稻美香粘二号、糯稻苟黄岗等相比，发现“大白果糯”的分蘖数较低（图1A-B，C），株高较高（图1A-B，D），而直链淀粉较低（图1E），碱消值较低（图1F），胶稠度较高（图1G），说明“大白果糯”品质较好，但分蘖过少和株高过高限制了其在农业上的应用。其中，在图1中， A和B分别为水稻“大白果糯”和中花11单株；C为分蘖数统计；D为株高统计；E为直链淀粉测定；F为碱消值测定，G为胶稠度测定；图中的标尺为15 cm，C-D统计数据为：mean±SD，n=20。E-G统计数据为：mean±SD，n=4；结果使用Duncan检验进行差异显著性分析，数据上方标记有小写字母，同一图中，不同小写字母表示之间有显著性差异，p＜0.05，下同。
一、靶序列的选择
“大白果糯”的内部植物激素独脚金内酯的受体基因D14编码链的编码序列是序列表中的SEQ ID No.2所示序列，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；D14基因的启动子序列是序列表中的SEQ ID No.1所示的序列。
SEQ ID No.1（5’-3’，下划线表示Target 4和Target 5）：
GTCTAAGACCTTTATGCGTTTGAAAATTATTACCAGTTTGATCATTAACTTTAATACCAACATGACCACCTTGAATAAAAGAGGCAATCCACTCACACCATTTAGTAGAGAAGCCTTTCATCCTCAAAGTCTGTTGTACAAATGACCATTTAACCTTATCATAAGCTTTCTCAAAATCAATCTTAAAAATTACAGCACTTTTGTTTTTACGATGTAACTCATGCAAAGTTTCATGCAAAATAACCACACCTTCCATAATATTTCTCCCAGGAATGAAAGCAGTTTGAGTAGGACTAATTGCCTTTTGGGCAACCGTCATGACTCTATTTGTGGCAACTTTGGTAAAGATCTTAAAACTAACATTAAGTAAGCAAATAGGCCTATATTGCTGGATTTTCATGGCCTCAACATACTTAGGTAAAAGAATGATCGTACCAAAATTAAGAGAGTATAAAGGCAAAGTATCATTATGAAATTCTTTAAAAAGATCTAATAAGTCACATTTTATGACATTCCAGAAAACTTGATAAAATTCAGCAGGAAATCCATCAGGACCCGGTGCTTTGTTATGTTCCATTTGGAAGATCGCCTCATTAATCTGTTTTTCAGTAAAAACATGCGTTAAAGCCTCATTCTCCAACTGAGAAACTTGAGGAATGTCAGCAAATTTATTCTCATCAAACTGAAGAGTAGAATCATTAGGAGGCCCAAATAAACCTTTATAATAAGTGGTAATATGCGATTTCAAATTCGCATCACCATTTATTAATTGGTCACCATCATGTAATTGAAAAATTCTAGTCTTCCTATGTTTTCCATTTGCAACCAAATGAAAATATTTTGTGTTAGAATCACCCTCTAAAATATCCTTAGATTTCACCCTCTGATACCATTTAACTTCCTCTTCTCTCAGAATTGTAGATAATCTATTTCTACAAAACCATCTAAAATCCAACTCCTCCTGACTCAAAAGCATAGTTTCTGCCTTTTTATCTAGCAAATCCAACTTATCTAAAATCTCCTTTTTTTTCTTTTTTGTACAAGCCACTAGTATGTTTAGACCAACCCCTAAGATGCTGTCTTAAACGACGAATTTTCGCCTGCCACCGCTCCATGGCAGAATTGCGTTCATCAACACTAGACCATATCTCCTTTACCATATCAACAAAGCCATCACGTAAAAGCCAACCAAATTCAAACTTGAAACTATGTTGAGCATTACTCAAAGAAGAAGTGTTTGTATTTAAAAGTAAAGGAGTATGATCAGAAATATCTCTATTAAGAGCCACCACAGAAGATAAAGGAAATTTATGTTCCCACTCCGTGAACATTAAAACCCTATCAAGTTTCTCATATGTTGGATTCACTAAATTGTTTGCCCAAGTAAATTTCCTACCAGACATCTGTAACTCCCGGAGACATAACCCATCAATAATAGCATTAAAAAGGAATGGCCATCTATCATCATAATTATCATTATTCTTTTCATCAGGGCTACGTACGTAGAATATTAAAATCACCACCAATAAGAATTGGTAAGGTTTCATGACTGCACATATTAACTAATTCAGCAAGGAATTGATCCTTA AATTCACTTTGTACTGGCCCATACACCAGAACTAAAGCCCACTTAAACTTATCAACTTTATTACATAAATGAAACTTAATGTAGAAATCTCCCTCATCAATCAAACCAATATCAACATTAATTAAATTGATGCCCAAAAGCAAACCACCGGA CCTACCTCTATGAGGCTTGCAATGCCACAAAAATTATTTGCCAGCACACAGATTTTTAAGAACAGCCGGACTAAAATCTTTCTTAATAGTCTCTGACAAAGCAATAAAATCAAGGTGATGTTCCTTTGTTAAATCAGAAATAAACTTATGTTTTTTCGGGACCTTAAACCCATCACAATTCCAGAACAACCCTTTCATTTAAAAATATTCTTTTTTTTCTTTCCCCTTTTAGTCTTTTTCTTACTATTAGGAGAGGTATCTAAAGAATATAAAGTGGTCTAAGAATAATTATCATCCACACCACTAAAATCCATCACCTCCTCCATTAATTCACCACACAAATGTTGAAGTAGAGAATTATCATCCACCTGATCATCCAATATCTCGCTATCAACATTTGAAGTATGTACCTGATTAACAGAAGAACTAACATATTCACTTAACATCTTTTCCTCTATACTCTTTAAATCATTTATAACATCATCTAATATGTCTACAACGTTTGCTGCAAAAATTCCCTTAACGCTGATAATCAAACGCTACATTACAGACACTAACAGCGACGTTCTTAGCTTGTCAAAACTCTCAACTACGAGTAATATTAATTGCAGTGGCATCTCTGGTTGGGATTGTGAAGTCAAAAAAAAATAAAACAAAACGATAAGAGAAAAAAAAACTTCTCCTGAGAAAAAAAAATCCAGAGAATTATAGGTGCCTCACTGCCTCTCCTTTTTATCTGCTGTGGATTGGATAATTGGAC；
SEQ ID No.2（5’-3’）：
ATGCTGCGATCGACGCATCCGCCGCCCAGTAGCCCGAGCAGCAGCAGCAGCGGCGGCGGCGGGGGCGGGGGGTCGTCGGCGTCGTCGAGCTCGGAGAAGACGATGGTGGGCGGCGGGGGAGGAGGGGGAGGAGGGAGCGGGTCGGCGGCGCCGAGCGGGGCGAAGCTGCTGCAGATCCTGAACGTGCGGGTGGTGGGGAGCGGCGAGCGGGTGGTGGTGCTGTCGCATGGCTTCGGGACGGACCAGTCGGCGTGGAGCCGCGTGCTGCCGTACCTCACCCGCGACCACCGCGTCGTGCTCTACGACCTCGTCTGCGCCGGCAGCGTCAACCCGGACCACTTCGACTTCCGCCGCTACGACAACCTCGACGCCTACGTCGACGACCTGCTCGCCATCCTCGACGCGCTCCGCATCCCGCGCTGCGCCTTCGTCGGCCACTCCGTCTCCGCCATGATCGGCATCCTCGCCTCCATCCGACGACCTGACCTCTTCGCCAAGCTTGTCCTCATCGGCGCCTCTCCCCGGTTCTTGAACGACAGCGACTACCACGGCGGGTTCGAGCTGGAGGAGATACAGCAGGTGTTCGACGCGATGGGGGCGAACTACTCGGCGTGGGCGACGGGGTACGCGCCTCTGGCGGTGGGCGCCGACGTGCCGGCGGCGGTGCAGGAGTTCAGCCGCACCCTCTTCAACATGCGCCCGGACATCTCCCTCCACGTCTGCCAGACCGTCTTCAAGACCGACCTCCGCGGCGTGCTCGGCATGGTCCGCGCCCCCTGCGTCGTCGTCCAGACCACCCGCGACGTCTCCGTCCCGGCCTCCGTCGCCGCCTACCTCAAGGCCCACCTCGGCGGCCGCACCACCGTCGAGTTCCTCCAGACCGAGGGTCACCTCCCCCACCTCAGCGCCCCCAGCCTCCTCGCCCAGGTGCTCCGCCGCGCTCTCGCCCGACGATGTGGGCAATCTTGA；
SEQ ID No.3：
MLR STH PPP SSP SSS SSG GGG GGG SSA SSS SEK TMV GGG GGG GGG SGS AAPSGA KLL QIL NVR VVG SGE RVV VLS HGF GTD QSA WSR VLP YLT RDH RVV LYD LVC AGSVNP DHF DFR RYD NLD AYV DDL LAI LDA LRI PRC AFV GHS VSA MIG ILA SIR RPD LFAKLV LIG ASP RFL NDS DYH GGF ELE EIQ QVF DAM GAN YSA WAT GYA PLA VGA DVP AAVQEF SRT LFN MRP DIS LHV CQT VFK TDL RGV LGM VRA PCV VVQ TTR DVS VPA SVA AYLKAH LGG RTT VEF LQT EGH LPH LSA PSL LAQ VLR RAL ARR CGQ S*。
前期已对“大白果糯”中受体基因D14的启动子序列进行了扩增及测序，对基因的启动子序列顺式元件较为集中的区域设计了CRISPR载体的双靶标，构建了启动子序列敲除载体，具体参见图2。Target 1和Target 2组合的载体及获得的材料命名成D14-1，Target 2和Target 3组合的载体及获得的材料命名成D14-2，Target 4和Target 5组合的载体及获得的材料命名成D14-3，Target 6和Target 7组合的载体及获得的材料命名成D14-4。
其中，D14-3为例进行说明，其靶序列如下:
Target 4：5’-TCCTTAAATTCACTTTGTACTGG-3’(SEQ ID No.4，如SEQ ID No.1上与D14基因起始密码子ATG距离1176—1154bp的区段所示，PAM为TGG)；
Target 5：5’-CCACCGGACCTACCTCTATGAGG-3’(SEQ ID No.5，如SEQ ID No.1上与D14基因起始密码子ATG距离1026-1004bp的区段所示，PAM为AGG)。
将CRISPR/Cas9方法中靶向Target 4的sgRNA记为sgRNA1，将CRISPR/Cas9方法中靶向Target 5的sgRNA记为sgRNA2。
二、sgRNA表达盒的构建
1、sgRNA1表达盒pOsU3-D14gRNA的构建
以U-F、gRNA-R、U3-OsD14-F、U3-OsD14-R为引物，以pYLsgRNA-OsU3质粒为模板做融合PCR扩增出pOsU3-D14gRNA表达盒。pOsU3-D14gRNA表达盒能编码sgRNA1，即为sgRNA1表达盒，进行菌液PCR。选取条带大小为1.2kb左右的阳性单克隆进行测序，测序引物为SP1，所用引物序列具体如下：
U3-OsD14-F:5’-TCCTTAAATTCACTTTGTACTGGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’(SEQ IDNo.6，波浪线指示的序列为Target 4，下划线指示的序列为接头序列)；
U3-OsD14-R:5’-CCAGTACAAAGTGAATTTAAGGATGCCACGGATCATCTGC-3’(SEQ IDNo.7，波浪线指示的序列与Target 4反向互补，下划线指示的序列为接头序列)；
U-F:5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’（SEQ ID No.8）；
gRNA-R:5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’（SEQ ID No.9）。
将PCR产物进行稀释10倍，作为第二轮PCR扩增模板。以B-L、B2为引物进行第二轮PCR扩增，引入的BsaI酶识别位点。所用引物序列具体如下：
B-L:5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID No.10，下划线指示的序列为BsaI酶识别位点)；
B2:5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID No.11，下划线指示的序列为BsaI酶识别位点)。
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收目的片段。
2、sgRNA2表达盒pOsU6a-SD1gRNA的构建
以U-F、gRNA-R、U6a-SD1-F、U6a-SD1-R为引物，以pYLsgRNA-OsU6a质粒为模板做融合PCR扩增出pOsU6a-SD1gRNA表达盒。pOsU6a-SD1gRNA表达盒能编码sgRNA2，即为sgRNA2表达盒。所用引物序列具体如下：
U6a-OsSD1-F:5’-CCACCGGACCTACCTCTATGAGGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’(SEQ IDNo.12，波浪线指示的序列为Target 5，下划线指示的序列为接头序列)；
U6a-OsSD1-R:5’-CCTCATAGAGGTAGGTCCGGTGGCGGCAGCCAAGCCAGCA-3’(SEQ IDNo.13，波浪线指示的序列与Target 5反向互补，下划线指示的序列为接头序列)；
U-F:5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’（SEQ ID No.8）；
gRNA-R:5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’（SEQ ID No.9）。
将PCR产物进行稀释10倍，作为第二轮PCR扩增模板，作为第二轮PCR扩增模板。以B2’、B-R为引物进行第二轮PCR扩增，引入的BsaI酶识别位点。所用引物序列具体如下：
B2’:5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID No.14，下划线指示的序列为BsaI酶识别位点)；
B-R:5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID No.15，下划线指示的序列为BsaI酶识别位点)。
扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收目的片段。
3、重组表达载体CRISPR-OsD14-2Target的构建
以限制性内切酶BsaI和连接酶T4ligase，将步骤1得到的第二轮PCR纯化产物和步骤2得到的第二轮PCR纯化产物按照常规分子实验操作“边切边连”的方法构建到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(载体骨架图见图3)上。之后转化DH5α，挑取单克隆。
对重组质粒进行测序，已确定获得正确表达载体，其中，测序引物为：
SP1：5’-CCGACATAGATGCAATAACTTC-3’（SEQ ID No.16）。
将测序正确的重组质粒命名为CRISPR-OsD14-2Target，为了便于识别以及与其他质粒区别，我们将其简称为D14-3质粒。CRISPR-OsD14-2Target含有sgRNA1表达盒pOsU3-D14gRNA、sgRNA2表达盒pOsU6a-D14gRNA和cas9编码基因，能表达sgRNA1和sgRNA2以及Cas9。以同样的方法获得D14-1、D14-2、D14-4质粒，他们与D14-3质粒的不同在于靶标序列的不同，详见前文的阐述。
实施例2、D14基因启动子特殊区段敲除的“大白果糯”植株的构建与表型鉴定
1、培育D14基因启动子特殊区段敲除的“大白果糯”植株
将实施例1得到的D14-1、D14-2、D14-3、D14-4质粒分别通过本领域常规的电激方法转化农杆菌EHA105，利用农杆菌侵染“大白果糯”的愈伤组织，利用潮霉素50mg/L筛选愈伤，并对愈伤组织进行分化，4个月左右获得转化苗。炼苗1-2周后，移入土中，待苗生长约3个月后，提取转化苗的基因组DNA，以特异引物扩增OsD14-1、OsD14-2、OsD14-3、OsD14-4系列株系。
其中用于扩增OsD14-3引物对由OsD14-3-F和OsD14-3-R构成：
OsD14-3-F:5’-TTTCCTACCAGACATCTGTAACTC-3’，（SEQ ID No.17）；
OsD14-3-R:5’-AATGAAAGGGTTGTTCTGGA-3’，（SEQ ID No.18）。
选择基因组编辑材料，扩增其片段得到产物，送产物进行测序确定突变类型。本实施例建立了“大白果糯”遗传转化体系且获得了一系列突变体分蘖增加或株高降低的植株，并进行了测序鉴定，结果发现4种质粒均已获得片段敲除的突变体植株，图4展示了不同突变植株的基因突变情况。单株收取种子后，继续种植获得T1代材料。提取T1代各个材料的水稻叶片RNA，反转录成cDNA并进行D14基因的实时荧光定量PCR实验，结果表明D14-3材料中的D14基因相对表达量比野生型大白果糯下降到了0.7左右，而D14-1，D14-2，D14-4材料中D14基因相对表达量比野生型大白果糯未出现明显下降（图5左）。统计各材料的分蘖数，发现D14-3材料中的分蘖数最高，达到了10个左右，比野生型大白果糯有明显提高，而D14-1和D14-2分蘖数只提高了1-2个，D14-4的分蘖数未明显提高，野生型大白果糯分蘖数为4个左右（图5中）。进一步统计各材料的单株产量，发现只有D14-3的单株产量有明显提高，比野生型大白果糯提高三倍以上，而其他材料单株产量比野生型大白果糯均未有明显提高（图5右）。
2、D14基因启动子特殊区段敲除的“大白果糯”的表型
对D14-3不同敲除材料种植于田间，对D14基因启动子序列靶标4和5双靶标敲除的四个株系D14基因重测序具体测序结果如图6-9所示。T1代不同位点突变的株系植株编号为D14-3-2、D14-3-17、D14-3-18、D14-3-19。图6展示了对D14-3-2突变体的测序结果与野生型比对情况，其敲除了靶标5（target 5）上的一小段序列；图7展示了D14-3-17突变体的测序结果与野生型比对情况，其敲除了包括靶标5在内的一段序列；图8展示了D14-3-18突变体的测序结果与野生型比对情况，其敲除了包括两个靶标在内的一大段序列；图9展示了D14-3-19突变体的测序结果与野生型比对情况，其敲除了靶标5上的CT两个碱基。图6-9测序图中前后序列不匹配的情况为测序反应刚开始存在的测序错误碱基。
对这些材料观察田间表型，以第一张图“大白果糯”野生型为对照，可以明显看出D14突变体四个株系分蘖数显著增加（图10)。为了更为准确地鉴定表型，对“大白果糯”野生型和四个D14突变体株系的单株分蘖数、单株产量以及D14基因在各个株系中的相对表达量进行了测量统计，发现D14基因在四个D14突变体株系中的相对表达量显著低于野生型株系，（图11左）。图11左仅为示例，实际上发明人对大量D14-3的株系进行了D14基因相对表大量的检测，D14-3的株系D14基因的表达量为野生型株系的0.3-0.7倍之间。4个D14突变体株系的分蘖数和单株产量均显著高于野生型材料，分蘖数从4个增加到了10个左右，单株产量从5g增加到17g左右，统计结果见图11中和图11右。4个株系均出现了分蘖数和单株产量明显增加，说明靶标5序列特别是靶标5上的CT碱基是D14基因启动子序列上调控分蘖的关键位点。可见靶标5所在的启动子区域是D14基因的核心启动子区域，其中，靶标5上的CT碱基（D14基因起始密码子ATG距离1011—1010bp的区段）是起到最关键调控作用的核心启动子区域。
因此，在贵州地方优质稻“大白果糯”中，可以通过编辑独脚金内酯受体D14基因的启动子特殊区段，实现分蘖和产量的精确提高，使“大白果糯”的分蘖和产量均显著增加，解决贵州地方优质稻“大白果糯”分蘖少、产量较低，难以推广种植导致其优质种质资源难以保存的问题。
对比例1：D14等基因编码区突变后导致水稻分蘖非常高，但单株产量很低
有研究表明，独脚金内酯途径中基因编码区突变的d突变体d3、d14、d10等因为分蘖增加太显著，比对照产生更多的穗数，但产量没有增加，结实率下降。在d突变体中，d3和d53突变体的籽粒产量最低（Yamada Y, Otake M, Furukawa T, et al. Effects ofstrigolactones on grain yield and seed development in rice[J]. Journal ofPlant Growth Regulation, 2019, 38(3): 753-764.）。即现有技术文献中制备了独脚金内酯途径中相关基因的突变体，不能对水稻的产量进行有效提升。所以如何利用独脚金内酯途径中基因，适度提高分蘖和并增加产量显得格外重要，不能够直接对基因编码区域进行操作而是需要采用其他手段。本发明从基因编辑D14基因的启动子（而不是就基因编码序列本身）出发，通过大量位点找到了一个特殊位点，仅仅对基因表达造成一定程度的降低，能够显著提高分蘖数，并显著提高单株产量。
对比例2：通过D14启动子其他转录因子结合位点并没有获得水稻分蘖和单株产量提高的水稻材料
有研究表明，转录因子OsMADS57通过CarG盒结合D14基因启动子上的序列CTTTAAAAAG和CATTAAAAAG抑制D14基因的转录调控水稻分蘖（Guo S, Xu Y, Liu H, MaoZ, Zhang C, Ma Y, Zhang Q, Meng Z, Chong K. The interaction between OsMADS57and OsTB1 modulates rice tillering via DWARF14. Nature Communication, 2013, 4(3): 1566.）。但论文没有提供出OsMADS57抑制D14基因表达后水稻分蘖和单株产量提高的任何材料，且该论文表明了D14的表达下降是需要OsMADS57转录因子参与的，此外，也未提供D14启动子两段序列任何碱基删除后可以降低D14的表达量。而本发明只需要通过基因编辑技术删除特殊序列的碱基就可以实现D14的降低表达，并达到分蘖和单株产量显著提高的目的。可见，本发明有独创性，是发明人通过D14基因启动子的相关大量实验并反复比较找到的一个特殊位点，并且只有该特殊位点删除后显著提高了水稻分蘖和单株产量。
Claims (4)
1.提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法，其特征在于：对大白果糯的D14基因的启动子区域进行用于降低D14基因的表达水平的基因编辑；
所述启动子区域的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述基因编辑采用CRISPR/Cas9系统，其包括sgRNA1和sgRNA2；sgRNA1的靶序列为：5’-TCCTTAAATTCACTTTGTAC-3’；sgRNA2的靶序列为：5’-CCACCGGACCTACCTCTATG-3’。
2.根据权利要求1所述的提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的方法在水稻分子育种中的应用。
3.一种提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的试剂，其特征在于：
所述试剂包括CRISPR/Cas9系统；CRISPR/Cas9系统包括整合在CRISPR/Cas9载体上的sgRNA；所述sgRNA为sgRNA1和sgRNA2；所述sgRNA1的靶序列为：5’-TCCTTAAATTCACTTTGTAC-3’，所述sgRNA2的靶序列为：5’-CCACCGGACCTACCTCTATG-3’。
4.根据权利要求3所述的一种提高贵州优质特色稻大白果糯分蘖和产量的试剂在水稻分子育种中的应用。
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Non-Patent Citations (4)
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Also Published As
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