CN110923231B - 一种果实高固形物含量的番茄材料的创制方法 - Google Patents

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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体公开了一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法。包括步骤：（1）对控制番茄固形物的基因SIVPE5进行序列分析，确定特异的sgRNA序列；（2）构建含有sgRNA和Cas9蛋白的表达载体；（3）利用农杆菌侵染法将重组载体转化到果实低固形物含量的番茄中，获得T0代转基因番茄植株；（4）将SIVPE5基因序列发生突变的T0代植株种植于温室，自交获得T1代植株，从T1代中筛选不含有外源转基因成份但SIVPE5基因发生纯合突变且果实固形物含量高的植株，即为果实高固形物含量的番茄材料。本方法成本低，缩短创制周期，一年之内即可获得果实高固形物含量的番茄材料，且该番茄材料不含有外源基因，安全无风险。

Description

一种果实高固形物含量的番茄材料的创制方法
技术领域
本发明属于植物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种果实高固形物含量的番茄材料的创制方法。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)是重要的蔬菜和经济作物，在世界范围内广受欢迎。我国是鲜食番茄第一大生产国，也是加工番茄的第三大生产国，在世界番茄市场中具有举足轻重的地位。近年来，由于经济原因及品质问题，我国番茄酱的出口量有所大幅减少，加工番茄栽培面积也萎缩严重。可溶性固形物(TSS,Total Soluble Solids)含量是衡量番茄果实品质的重要指标，其主要成分为可溶性糖，还有少量有机酸和氨基酸等。由于甜度是果实重要的风味特性，而甜味主要是由含糖量决定，因此，TSS也成为决定鲜食番茄风味品质的重要指标。除影响风味外，TSS含量也是影响加工番茄番茄酱的生产成本。研究表明，生产浓度为28％的番茄酱，如果加工番茄的TSS含量从4％提高到5％，将减少原料消耗约25％。我国加工番茄现有品种的TSS含量大部分在4.0-5.0％，多数地区还使用老品种，而美国等发达国家早已使用新品种，平均TSS含量可达到5.5％。因此，提高番茄TSS含量，不仅可以改善鲜食番茄的风味品质，还可提高加工番茄的生产效率，增强我国番茄加工产品在国际市场上的竞争力。
目前，通过传统回交的方法将一个低固形物含量的自交系改良成高固形物含量的自交系，一般需要至少7代才能转育成功，包括1代杂交，至少5代的回交和1次自交，按一年种植2代计算，至少需要3年半的时间才能完成。基因靶向编辑技术(gene targetedediting)是一种可以在全基因组水平对DNA序列进行改造编辑的遗传操作技术。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继TALEN基因编辑技术之后又一重大突破。该技术通过RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA编辑。CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并已应用在各物种中，是目前使用广泛的基因编辑技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，以克服现有技术制备高固形物番茄耗时耗力的不足。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，在SIVPE5基因(如SEQ ID NO.1所示)的第一个外显子和第二个外显子上设计两个gRNA靶位点，第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCGGAAGCTTCCAGATTCTT-3’如SEQ ID NO.2所示；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-TGCGTATCAGCTATTGAGAA-3’，如SEQ ID NO.3所示。
二、一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，包括以下步骤：(1)通过酶切-连接，将两个gRNA，如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA载体；(2)将pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体导入农杆菌中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；(3)以含SIVPE5基因的低固形物含量的番茄为材料，用pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染其外植体下胚轴组织；(4)诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；(5)获得阳性转基因株系后，经基因靶位点PCR扩增、测序、外援基因插入分析和突变体表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SIVPE5功能且无外援基因插入的果实高固形物含量的突变体。优化设计，步骤(2)中所述的CRISPR/Cas9骨架载体为pCGR1301。优化设计，步骤(3)中所述的农杆菌为根瘤杆菌GV3101。优化设计，步骤(5)中所述的检测靶位点突变的PCR引物为，第一个靶位点的引物序列为：SIVPE1-F：5’-GCGTAAGATAGCACGAAGGGAT-3’如SEQ ID NO.4所示；SIVPE1-R：5’-AAACGAACTAGATCGGAAGAA-3’如SEQ ID NO.5所示；第二个靶位点的引物序列为：SIVPE2-F：5’-AGAATGGAATAAACCGGCTCT-3’如SEQ ID NO.6所示；SIVPE2-R：5’-CATCTCCCGTGTAATCCTGAC-3’如SEQ ID NO.7所示。
三、一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，所创制的果实高固形物含量的番茄材料在番茄育种中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过设计SIVPE5突变靶位点，构建pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体，利用农杆菌介导法导入含有SIVPE5基因的低固形物含量的自交系材料中，以卡纳霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植株；经基因测序和表型观察确定的纯合突变且不含外源基因插入的株系，即为完全丧失SIVPE5功能、固形物含量高的番茄突变体。本发明可以显著提高番茄果实中固形物的含量，在番茄高品质分子育种中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为SIVPE5基因的结构和CRISPR/Cas9基因编辑sgRNA靶位点的信息，其中E1-E9为1-9号外显子；图2为T0代植株SIVPE5基因编辑的测序结果，与野生型相比，有4个单株发生了突变，其中单株4为突变纯合体。
具体实施方式
实施例一：SIVPE5基因具有9个外显子，利用CRISPR/Cas9系统对果实低固形物含量的番茄材料基因组中调控果实固形物含量的基因SIVPE5进行编辑，进而使所述抑制固形物含量提高的基因SIVPE5功能丧失，得到果实固形物含量高的材料。CRISPR/Cas9系统中包括两个sgRNA，分别命名为sgRNAl和sgRNA2，识别的靶序列均为所述果实低固形物含量番茄材料基因组中编码SIVPE5蛋白的DNA序列。sgRNAl和sgRNA2分别特异靶向SIVPE5基因的第1个外显子和第2个外显子；第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCGGAAGCTTCCAGATTCTT-3’；(位于SEQ ID NO.1中自5’端第85～104位)；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-TGCGTATCAGCTATTGAGAA-3’；(位于SEQ ID NO.1中自5’端第1589～1608位)。
实施例二、创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，(1)通过酶切-连接，将两个gRNA整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA载体；(2)将pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体导入农杆菌中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；(3)以低固形物含量的番茄(含SIVPE5基因)为材料，用pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染其外植体(下胚轴)组织；(4)诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；(5)获得阳性转基因株系T0代后，提取基因组DNA，在靶位点的两侧设计引物，对目的片段进行PCR扩增，纯化PCR扩增产物后进行测序，根据测序结果筛选纯合突变体，并检测T0代突变体果实的固形物含量进行验证；收取T0代纯合突变体的自交种子，即T1代，再筛选T1代植株中不含外源基因插入的株系；经基因靶位点测序、外援基因插入分析和突变体表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SIVPE5功能且无外援基因插入的高固形物含量的突变体。
实施例三、具体的，选择所述SIVPE5纯合突变且无外援基因插入的高固形物含量的突变体为材料，通过杂交等育种技术进行高固形物含量的番茄育种。SIVPE5基因序列如SEQ ID NO.1所示(5050bp)；其中，SIVPE5基因的编码序列(CDS)由SEQ ID NO.1中自5’端第1位～186位碱基、第1575位～1739位碱基、第1813位～1969位碱基、第2913位～2998位碱基、第3098位～3297位碱基、第3673位～3721位碱基、第3951位～4160位碱基、第4570位～4776位碱基、第4868位～5050位碱基组成。CRISPR/Cas9骨架载体为pCGR1301。农杆菌为根瘤杆菌GV3101。
实施例四、人工合成sgRNA序列，通过酶切-连接的方式，将两个gRNA整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA重组载体。将连接正确的pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA质粒转化农杆菌GV3101，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；以野生型番茄M82的下胚轴为外植体进行农杆菌介导转化，诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性单株4个，分别为单株1、单株2、单株3、单株4。转基因番茄中SIVPE5基因突变体的检测：根据目的基因，在两个靶位点序列的上游和下游分别设计引物，第一个靶位点的引物序列为：SIVPE1-F：5’-GCGTAAGATAGCACGAAGGGAT-3’；SIVPE1-R：5’-AAACGAACTAGATCGGAAGAA-3’。第二个靶位点的引物序列为：SIVPE2-F：5’-AGAATGGAATAAACCGGCTCT-3’；SIVPE2-R：5’-CATCTCCCGTGTAATCCTGAC-3’。
分别提取所获得的4个转基因阳性植株和野生型植株M82的基因组DNA。以上述DNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系：DNA模板1μL，Pfu PCR MasterMix(2×)12.5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，ddH2O 9.5μL；PCR反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。PCR产物回收纯化，进行测序。通过测序结果判断突变为纯合突变还是杂合突变。4个转基因阳性单株中，单株1、单株2和单株3均为杂合突变，单株4为纯合突变(图2)。
将获得的纯合突变单株4种植于温室，当果实成熟时检测果实固形物含量，经检测发现单株4果实固形物的含量明显高于野生型M82果实固形物的含量(表1)。然后，将单株4的T0代植株进行自交，获得了T1代的种子。为了在T1代中获得不含外源转基因片段的株系，通过PCR方法扩增T1代植株中的CRISPR/Cas9载体序列(正向引物：5’-cttcatcaagagacagctggtg-3’如SEQ ID NO.8所示；反向引物：5’-cttagggtcccagtccttcttt-3’如SEQ ID NO.9所示)。结果发现，本实施例中单株4的T1代植株中1/4的植株(29/115)不含外源转基因Cas9片段。
表1单株4与野生型M82间果实固形物含量比较
Figure BDA0002309319890000061
随后，检测SIVPE5的突变是否稳定遗传到不含外源转基因成份的T1植株中。由于单株4的突变发生在第二个靶位点上(图2)，所以利用第二个靶位点的引物(SIVPE2-F：5’-AGAATGGAATAAACCGGCTCT-3’；SIVPE2-R：5’-CATCTCCCGTGTAATCCTGAC-3’)PCR扩增SIVPE5基因片段。然后对PCR产物进行纯化、测序，将测序结果与野生型SIVPE5基因进行序列比对，检测在第二个靶位点的靶区位置存在的碱基突变(如图2中的单株4)，说明CRISPR/Cas9产生的突变可以从T0代稳定地遗传到T1代。不含外源转基因成份且SIVPE5发生纯合突变的T1代植株即为新的高固形物材料。
本发明方法中，从构建CRISPR/Cas9载体，将其转化到低固形物含量的M82下胚轴中，再生获得T0代转基因番茄植株这段过程需要6个月，T0代植株进行自交，获得了T1代的种子所需时间为4个月，对T1代进行筛选需时为1个月，完成整个过程需11个月，即1年以内完成了高固形物新材料的创制，大大缩短了改良过程。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
SEQUENCE LISTING
<110> 新疆农业科学院园艺作物研究所
<120> 一种果实高固形物含量的番茄材料的创制方法
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5050
<212> DNA
<213> 番茄SIVPE5基因序列
<400> 1
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ggtaagtact tttggacatt gagaattagg ttatctagct gatgtggtag ttagaaagta 3780
aaatgataac aaaataagga atttagaatg ctaaagcaaa tgtattggtg ttcttaaaag 3840
ggaaaagaac aagggtttca caagtaccga tccaatgata tagtttctct ctatccttta 3900
ttatgatgac ataattgtgt attttgcatc tctactgctg ttttttgcag gtcaaaaaga 3960
gaactgcaaa tggaaatact gcctatggtt cccatgtcat gcaatttggt gatctacaac 4020
tgagtatgga gtctctattc aggtttatgg gtacaaatcc tgcaaatgat aactacactt 4080
atgtagatga caattccttg ttggcatcat caaaggctgt caaccagcgt gatgcagatc 4140
ttttacattt ctgggacaag gtatgcccca acaaacgccc cctttcctga gtttgcgcta 4200
aacataagaa gcaaaaatat caaatactac ataacaaatc agcaggaaat aaagctgttg 4260
aatcttaaag aacatattag ttaacagtat gtcctcttta aacaatatct ttgcaccatc 4320
ttgccaccat tgatggtttc ataaccatat taatgtggta tagctggttt ccaaaaagac 4380
actaacatta catttatgaa tggtagcaat gctaaacagg cgggtaactt gtgctaagct 4440
gcaagagtta tttttagtaa gccacatgtt gtaattcgtg ggtctttatg tgtttatgta 4500
ttaattggct tgtgcctctg atgtgaaatg ccttcttatt gattttctat tcttcctcaa 4560
tgctggcagt tccgcaaggc tcctgaaggc tctgctcgga aagttgaagc tcagaaacaa 4620
ttcactgaag ctatgtcaca cagaatgcac ctagatgaac gcattgccct tgttggtaag 4680
cttctgtttg gaattcaaaa aggtcctgag gtgctgaagc atgttcgatc tgcgggtcag 4740
cctcttgttg atgattgggc ctgccttaaa tcttttgtaa gcacctcata gaactcttaa 4800
ttgttaagat ttggttcatc atcgtagttt gacaattgtc tttttgcaac ttctatcata 4860
tctgcaggta agaacatttg agtcgcactg cggatcgtta tcccaatatg gaatgaaaca 4920
catgcgttcc attgccaata tctgcaatgc tggaattcag atggagcaga tggtggaggc 4980
atcagcacaa gcttgtccta gcatcccttc caatatttgg agttccctcc acaggggctt 5040
tagtgcgtaa 5050
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> sgRNA1
<400> 2
tcggaagctt ccagattctt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> sgRNA2
<400> 3
tgcgtatcag ctattgagaa 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgtaagata gcacgaaggg at 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaacgaacta gatcggaaga a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agaatggaat aaaccggctc t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
catctcccgt gtaatcctga c 21
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cttcatcaag agacagctgg tg 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cttagggtcc cagtccttct tt 22

Claims (2)

1.一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，其特征在于：在SIVPE5基因如SEQ ID NO.1所示的第一个外显子和第二个外显子上设计两个gRNA靶位点，第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCGGAAGCTTCCAGATTCTT-3’如SEQ ID NO.2所示；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-TGCGTATCAGCTATTGAGAA-3’，如SEQ ID NO.3所示。
2.一种运用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制果实高固形物含量的番茄材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）通过酶切-连接，将两个gRNA，如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA载体；
（2）将pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体导入农杆菌中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌，所述的CRISPR/Cas9骨架载体为pCGR1301
（3）以含SIVPE5基因的低固形物含量的番茄为材料，用pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染其外植体下胚轴组织，所述的农杆菌为根瘤杆菌GV3101；
（4）诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；
（5）获得阳性转基因株系后，经基因靶位点PCR扩增、测序、外源基因插入分析和突变体表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SIVPE5功能且无外源基因插入的果实高固形物含量的突变体；其中第一个靶位点的引物序列为：SIVPE1-F：5’-GCGTAAGATAGCACGAAGGGAT-3’如SEQ ID NO.4所示；SIVPE1-R：5’-AAACGAACTAGATCGGAAGAA-3’ 如SEQ ID NO.5所示；第二个靶位点的引物序列为：SIVPE2-F：5’-AGAATGGAATAAACCGGCTCT-3’ 如SEQ ID NO.6所示；SIVPE2-R：5’-CATCTCCCGTGTAATCCTGAC-3’ 如SEQ ID NO.7所示。
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