CN111411123A - 一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体，属于水稻改良技术领域。本发明所述方法利用CRISPR/Cas9系统抑制水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的表达；所述CRISPR/Cas9系统中，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明方法能够在后代中分离获得无转基因标记的，带有香味且白叶枯病抗性显著提高的突变体，为优质抗病水稻育种提供了新的种质资源和创制方法。
Description
技术领域
本发明涉及水稻改良技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体。
背景技术
水稻(Oryzasativa L.)是世界约一半人口的主要粮食作物，随着人们生活水平的提高，人们对稻米品质的要求越来越高。稻米的香味是食味品质的重要指标，香米具有特殊的香味，广泛受到市场和消费者的亲睐。
由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻致病变种所引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产中危害最严重的细菌性病害之一，严重时可导致高达50％的产量损失。
在常规杂交育种过程中，其分离后代香味(隐性性状)纯合基因型的单株较少，按传统检测方法会使含有香味基因的优良杂合个体在选择过程中被淘汰，最终导致香味基因的丢失。随着分子标记技术的发展，一般利用分子标记辅助选择的方法开展香味和抗白叶枯病水稻品种的选育。但是多基因的聚合操作起来有一定的难度，而且在创建导入系的过程中存在不良性状的连锁累赘，需要回交多代或者扩大分离群体的规模，才有可能打破这种连锁，延长了育种周期。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体。本发明方法能够在后代中分离获得无转基因标记的，带有香味且白叶枯病抗性显著提高的突变体，为优质抗病水稻育种提供了新的种质资源和创制方法。
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法，包括以下步骤：
利用CRISPR/Cas9系统抑制水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的表达；所述CRISPR/Cas9系统中，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
优选的是，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的接头正向引物32870-Gf和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的接头反向引物32870-U6Ar；所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的接头正向引物31190pro-Gf和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的接头反向引物31190pro-U6Br。
优选的是，所述CRISPR/Cas9系统中，靶点gRNA表达盒的构建方法包括以下步骤：
分别以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒和pYLsgRNA-OsU6b/LacZ质粒作为模版，进行二轮的巢式PCR扩增，构建含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA；
第一轮包括两个独立的扩增反应：用引物对U-F/接头反向引物进行反应1，和引物对接头正向引物/gR-R进行反应2；反应的程序均为：94℃10s，60℃15s，68℃20s，28个循环；所述接头反向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的接头反向引物32870-U6Ar或核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的接头反向引物31190pro-U6Br；所述接头正向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的接头正向引物32870-Gf或核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的接头正向引物31190pro-Gf；
第二轮为Overlapping PCR，用特异引物扩增表达盒产物：将第一轮反应1和反应2中的PCR产物稀释10倍混合分别作为模版；使用引物对U-GAL/Pgs-GA2，扩增产物为U6a-Badh2-gRNA；使用引物对U-GA2/Pgs-GAR扩增产物为U6b-SWEET14-gRNA；反应程序均为：95℃10s，58℃15s，68℃20s，20个循环；
所述U-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述gR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述U-GAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述Pgs-GA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述U-GA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述Pgs-GAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
优选的是，所述CRISPR/Cas9系统中，含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体的构建方法包括以下步骤：
将含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA用重组酶连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上。
本发明还提供了水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点序列，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体，其特征在于，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法。水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14在隐性状态下分别具有香味和白叶枯病抗性，对这两个水稻内源基因进行编辑或定点突变，在第二代即能获得无转基因成分的纯和突变体植株，提高了育种效率，而且避免了传统转基因导致的生物安全评价问题。本发明利用CRISPR/Cas9系统同时对水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14进行编辑，水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的设定可以实现方便、高效的水稻基因组编辑，本发明方法能够在后代中分离获得无转基因标记的，带有香味且白叶枯病抗性显著提高的突变体，为优质抗病水稻育种提供了新的种质资源和创制方法。
附图说明
图1为本发明提供的靶位点示意图，其中，A为香味基因Badh2靶位点序列示意图；B为白叶枯病感病基因SWEET14启动子靶位点序列示意图；
图2为本发明提供的香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的CRISPR/Cas9载体构建图；
图3为本发明提供的纯合突变体的抗白叶枯病接种鉴定图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法，包括以下步骤：
利用CRISPR/Cas9系统抑制水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的表达；所述CRISPR/Cas9系统中，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(AGTGGCGCGCCCCCGCGCT)，本发明位于第1外显子上的水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点序列经过基因编辑后产生的突变体能产生香味的表型，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(CCCCCTCCAACCAGGTGC)，本发明白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的设计和选择，后续使突变后确实能产生抗病的效果。
传统的育种方法效率不高，育种周期比较长。已有的CRISPR/Cas9系统针对的大多是单个基因进行编辑，本发明同时编辑两个基因，其中，香味基因的靶位点和已有报道不一样，白叶枯感病基因的靶位点也是特异的，未见报道的，利用本发明方法通过两年就能够获得无转基因成分的突变体植株，综合农艺性状与受体一致，但是香味和白叶枯抗性明显提高，改良效果显著，能够提高育种效率。
本发明根据香味基因Badh2的基因组序列和水稻白叶枯病感病基因SWEET14启动子特异结合元件，设计香味基因Badh2靶位点接头引物，其核苷酸序列为：
水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的接头正向引物32870-Gf：
5’-AGTGGCGCGCCCCCGCGCTgttttagagctagaaat-3’(SEQ ID NO.3)；
水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的接头反向引物32870-U6Ar：
5’-AGCGCGGGGGCGCGCCACTCggcagccaagccagca-3’(SEQ ID NO.4)；
设计白叶枯病感病基因SWEET14启动子靶位点接头引物，其核苷酸序列为：
白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的接头正向引物31190pro-Gf：
5’-TATATAAACCCCCTCCAACCgttttagagctagaaat-3’(SEQ ID NO.5)；
白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的接头反向引物31190pro-U6Br：
5’-GGTTGGAGGGGGTTTATATAcaacacaagcggcagc-3’(SEQ ID NO.6)。
在本发明中，所述CRISPR/Cas9系统中，靶点gRNA表达盒的构建方法包括以下步骤：
分别以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒和pYLsgRNA-OsU6b/LacZ质粒作为模版，进行二轮的巢式PCR扩增，构建含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA。本发明所述pYLgRNA-OsU6a/LacZ质粒已被现有技术报道，详见Xingliang M.ARobust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing inMonocot and Dicot Plants[J].MOLECULAR PLANT,2015,8(8):1274-1284.的来源没有特殊限定，在本发明中，所述pYLgRNA-OsU6b/LacZ质粒为将pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒中的启动子OsU6a替换成OsU6b得到的，本发明对所述替换的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规基因替换方法即可。本发明所述pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒稳定性高，能够避免在农杆菌或者植物基因组中sgRNA表达盒之间发生同源重组。
第一轮包括两个独立的扩增反应：用引物对U-F/接头反向引物进行反应1，和引物对接头正向引物/gR-R进行反应2；反应的程序均为：94℃10s，60℃15s，68℃20s，28个循环；所述接头反向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的接头反向引物32870-U6Ar或核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的接头反向引物31190pro-U6Br；所述接头正向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的接头正向引物32870-Gf或核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的接头正向引物31190pro-Gf；
第二轮为Overlapping PCR，用特异引物扩增表达盒产物：将第一轮反应1和反应2中的PCR产物稀释10倍混合分别作为模版；使用引物对U-GAL/Pgs-GA2，扩增产物为U6a-Badh2-gRNA；使用引物对U-GA2/Pgs-GAR扩增产物为U6b-SWEET14-gRNA；反应程序均为：95℃10s，58℃15s，68℃20s，20个循环；
所述U-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；
所述gR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；
所述U-GAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；
所述Pgs-GA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：5’-CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3’；
所述U-GA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示：5’-GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；
所述Pgs-GAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示：5’-TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’。
在本发明中，所述CRISPR/Cas9系统中，含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体的构建方法包括以下步骤：
将含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA用重组酶连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上。本发明对所述重组酶没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规连接用重组酶即可。本发明对pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体市售产品即可。得到重组载体后，本发明优选转化感受态细胞，之后于LB(Kan 50μg/mL)固体培养基上培养至克隆长出后，用引物1300F/1300R测序验证(1300-F：GCGGTGTCATCTATGTTACTAG(SEQ ID NO.13)；1300-R：GGCTGTATCTACGTTATTGAAG(SEQ ID NO.14))。
本发明上述技术方案获得的重组载体(含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体)优选通过农杆菌介导水稻遗传转化的方法进行转化，具体的，本发明将构建好的CRISPR/Cas9-gRNA载体(含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体)优选转化到粳稻品种沪旱61中，获得不含转基因成分的，香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14同时突变的纯合突变体植株。
本发明还提供了水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点序列，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体，其特征在于，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
利用CRISPR/Cas9系统创制香味抗白叶枯病水稻
1.双基因编辑载体构建
1.1靶位点选择和接头引物设计：
分别根据香味基因Badh2(LOC_Os08g32870)的基因组序列和水稻白叶枯病感病基因SWEET14(LOC_Os11g31190)启动子特异结合元件，设计靶点序列，20nt的核苷酸sgRNA靶点序列按照5’-N20-NGG-3’序列进行设计。
香味基因Badh2靶位点选择在第一个外显子区(图1中的A，香味基因Badh2靶位点序列示意图)，其核苷酸序列为：
接头正向引物32870-Gf：
5’-AGTGGCGCGCCCCCGCGCTgttttagagctagaaat-3’(SEQ ID NO.3)
接头反向引物32870-U6Ar：
5’-AGCGCGGGGGCGCGCCACTCggcagccaagccagca-3’(SEQ ID NO.4)
白叶枯病感病基因SWEET14启动子靶位点在起始密码子上游25bp(图1中的B，白叶枯病感病基因SWEET14启动子靶位点序列示意图)，其核苷酸序列为：
接头正向引物31190pro-Gf：
5’-TATATAAACCCCCTCCAACCgttttagagctagaaat-3’(SEQ ID NO.5)
接头反向引物31190pro-U6Br：
5’-GGTTGGAGGGGGTTTATATAcaacacaagcggcagc-3’(SEQ ID NO.6)
1.2 sgRNA表达盒的构建
以2～5ng pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒(1μL)为模版，进行二轮的巢式PCR扩增。
第一轮扩增包括两个独立反应：U-F/32870-U6Ar(反应1)，和32870-Gf/gR-R(反应2)。
以2～5ng pYLsgRNA-OsU6b/LacZ质粒(1μL)为模版，进行二轮的巢式PCR扩增。
第一轮扩增包括两个独立反应：U-F/31190pro-U6Br(反应1)，和31190pro-Gf/gR-R(反应2)。反应程序均为：94℃10s，60℃15s，68℃20s(28个循环)。
第二轮为Overlapping PCR，用特异引物扩增表达盒产物。具体为：分别将第一轮反应1和2中的PCR产物稀释10倍混合作为模版，使用引物对U-GAL/Pgs-GA2，扩增产物为U6a-Badh2-gRNA；使用引物对U-GA2/Pgs-GAR扩增产物为U6b-SWEET14-gRNA。
反应程序均为：95℃10s，58℃15s，68℃20s(20个循环)。
表1 PCR反应体系
所用引物序列为
U-F:5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’(SEQ ID NO.7)；
gR-R:5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’(SEQ ID NO.8)；
U-GAL：
5’-ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ IDNO.9)；
Pgs-GA2:
5’-CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3’(SEQ IDNO.10)；
U-GA2:
5’-GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO.11)；
Pgs-GAR：
5’-TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’(SEQ IDNO.12)。
1.3靶点gRNA表达盒与CRISPR/Cas9载体的组装
将1.2得到的靶点gRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和U6b-SWEET14-gRNA用重组酶连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，反应条件为37℃，30min，构建成含有双基因靶位点的CRISPR表达载体(图2，香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的CRISPR/Cas9载体构建图；注：潮霉素(HPT)由2×CaMV35S启动子(2×P35s)启动表达；Cas9由玉米Ubiquitin(Ubi)启动子启动表达；靶标sg RNA由水稻小核RNA启动子(U6a和U6b)启动表达。NLS：核定位信号区；Tnos：基因终止子)，然后转化感受态细胞TOP10，之后于LB(Kan 50μg/mL)固体培养基上培养至克隆长出后，用引物1300F/1300R测序验证。
1300-F：GCGGTGTCATCTATGTTACTAG(SEQ ID NO.13)
1300-R：GGCTGTATCTACGTTATTGAAG(SEQ ID NO.14)
表2重组酶连接反应体系
2.农杆菌介导水稻遗传转化
将1.3构建好的CRISPR/Cas9-gRNA表达载体转化到农杆菌感受态EHA105中，在遗传转化到粳稻品种沪旱61的愈伤组织中，经过诱导、继代、预培养、共培养、筛选、分化、生根、移苗等过程最终获得转基因植株54株。
3.转基因株系靶位点突变分析
3.1 T0代转基因植株的PCR鉴定
采用CTAB法提取转基因水稻植株的基因组DNA，利用引物HptF/R对54个T0代转基因植株进行潮霉素阳性检测，结果有50株阳性T0代转基因植株。用靶点测序引物32870-ce-F/R对Badh2基因突变位点进行PCR扩增；用引物31190pro-ce-F/R对SWEET14基因启动子突变位点进行PCR扩增测序；反应体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10uL Taq PCR Mastermix(天根生化科技(北京)有限公司)，10uM的前后引物各1uL，补充dd H2O至20uL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；然后按95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s进行30个循环；最后72℃延伸5min。对PCR扩增产物进行的测序结果分析表明，50个阳性转基因植株中，有12个植株在Badh2基因靶位点和SWEET14基因启动子靶位点同时发生突变，选取两个基因突变类型均为纯合的2个T0代转基因植株收种继续种植，其余收种保存(表3)。
其中鉴定引物为：
Hpt-F：TGCGCCCAAGCTGCATCAT(SEQ ID NO.15)
Hpt-R：TGAACTCACCGCGACGTCTGT(SEQ ID NO.16)
32870-ce-F：CTCCCACCACCACTCCACA(SEQ ID NO.17)
32870-ce-R：TTCCTCTTCAGCGCCTCC(SEQ ID NO.18)
31190pro-ce-F:GCCTATTGGTGTCCAGGGTC(SEQ ID NO.19)
31190pro-ce-R:GCCCAGGGATGCTGAAGA(SEQ ID NO.20)
表3转基因株系靶位点突变分析
4.无转基因成分badh2和sweet14突变体的获得
为了了解CRISPR/Cas9诱导的靶位点纯合突变能否从T0代传递到T1代，对编号7和编号12的T1代badh2和sweet14纯合突变体株系进一步分析，每个株系种植28株，所有植株靶位点突变进行PCR扩增测序，结果显示，所有T1代双基因编辑株系的突变类型与对应的T0代一致，且均为纯合突变，证明CRISPR/Cas9诱导的靶位点纯合突变能稳定遗传给后代。
为了进一步获得无转基因成分的badh2和sweet14纯合突变体，利用潮霉素引物HptF/R和基因特异引物Cas9p F/R对编号7和编号12的T1代株系进行阳性检测，检测出编号7的28个T1代单株中有6株不含有潮霉素Hpt和Cas9标记，编号12的28个T1代单株中有7株不含有潮霉素Hpt和Cas9标记，根据综合农艺性状选择单株自交繁殖2-3代，最终获得无转基因成分badh2和sweet14纯合突变体株系2份，命名为WDR61-cas-1和WDR61-cas-2，其中WDR61-cas-1的badh2突变类型是单碱基缺失造成移码突变，导致氨基酸序列发生改变使目的基因失去功能，sweet14启动子突变类型是缺失7个碱基无法被病原菌识别，SWEET14基因无法被诱导表达。WDR61-cas-2的badh2突变类型是单碱基插入突变，sweet14启动子突变类型是缺失5个碱基。
5.WDR61-cas-1和WDR61-cas-2突变体的香味测定
采用氢氧化钾法(Amarawathi et al,2008)进行香味的鉴定。方法是把10粒糙米，放入小玻璃培养皿中，加10mL 1.7％的KOH溶液处理，并盖上培养皿，将其置于25～30℃下10min，然后嗅其气味，结果发现，野生型沪旱61不具有香味，而WDR61-cas-1和WDR61-cas-2突变体具备香味。
6.WDR61-cas-1和WDR61-cas-2突变体的白叶枯病抗性鉴定
在水稻分蘖盛期根据剪叶方法对两个突变体株系进行白叶枯病人工接种，接种白叶枯病菌为PX086，每个单株接种3-4片叶，接种后14d调查病斑长度。结果发现，野生型沪旱61发病明显，平均病斑长度为13.5cm，而WDR61-cas-1和WDR61-cas-2突变体株系的平均病斑长度分别为1.7cm和2.6cm，达到抗病水平(图3，纯合突变体的抗白叶枯病接种鉴定图)。
表型鉴定结果表明利用CRISPR/Cas9技术对水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14进行编辑，可以获得了稳定遗传、带有香味且白叶枯病抗性显著提高的不含转基因成分的突变体株系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市农业生物基因中心
<120> 一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法及表达载体
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtggcgcgc ccccgcgct 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccccctccaa ccaggtgc 18
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtggcgcgc ccccgcgctg ttttagagct agaaat 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcgcggggg cgcgccactc ggcagccaag ccagca 36
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tatataaacc ccctccaacc gttttagagc tagaaat 37
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggttggaggg ggtttatata caacacaagc ggcagc 36
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctccgtttta cctgtggaat cg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cggaggaaaa ttccatccac 20
<210> 9
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accggtaagg cgcgccgtag tgctcgacta gtatggaatc ggcagcaaag g 51
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagggagcgg ataacaattt cacacaggca catccactcc aagctcttg 49
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgcctgtgt gaaattgtta tccgctccct ggaatcggca gcaaagg 47
<210> 12
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tagctcgaga ggcgcgccaa tgataccgac gcgtatccat ccactccaag ctcttg 56
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcggtgtcat ctatgttact ag 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggctgtatct acgttattga ag 22
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgcgcccaag ctgcatcat 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgaactcacc gcgacgtctg t 21
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctcccaccac cactccaca 19
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcctcttca gcgcctcc 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcctattggt gtccagggtc 20
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcccagggat gctgaaga 18
<210> 21
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
agtggcg 7
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccccctccac acggtgc 17
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agtggcgcgc ccccgct 17
<210> 24
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccccctcccc gtgc 14
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agtggcgcgc ccccgcggt 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccccctccaa accaggtgc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agtggcgcgc ccccgcggc 19
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccccctcaac caggtgc 17
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agtggcgcgc ccccgcacc 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccccctccat accaggtgc 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agtggcgcgc ccccgccgct 20
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccccctccac caggtgc 17
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agtggcgcgc cccgcgct 18
<210> 34
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccccctccgt gc 12
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agtggcgccg cccccccgcc 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccccctccac accgtgtgc 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agtggcgcgc ccccgctggg 20
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccccctccat accaggtgc 19
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agtggcgcgc ccccgcgt 18
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccccctccat accaggtgc 19
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agtggcgcgc ccccgccgct 20
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccccctccac aacgtgc 17
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
agtggcgcgc ccccgctgct 20
<210> 44
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ccccctcccc gtgc 14
Claims (6)
1.一种利用CRISPR/Cas9系统同时改良水稻香味和白叶枯病抗性的方法，包括以下步骤：
利用CRISPR/Cas9系统抑制水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的表达；所述CRISPR/Cas9系统中，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的接头正向引物32870-Gf和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的接头反向引物32870-U6Ar；所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的接头引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的接头正向引物31190pro-Gf和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的接头反向引物31190pro-U6Br。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统中，靶点gRNA表达盒的构建方法包括以下步骤：
分别以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ质粒和pYLsgRNA-OsU6b/LacZ质粒作为模版，进行二轮的巢式PCR扩增，构建含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA；
第一轮包括两个独立的扩增反应：用引物对U-F/接头反向引物进行反应1，和引物对接头正向引物/gR-R进行反应2；反应的程序均为：94℃10s，60℃15s，68℃20s，28个循环；所述接头反向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的接头反向引物32870-U6Ar或核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的接头反向引物31190pro-U6Br；所述接头正向引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的接头正向引物32870-Gf或核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的接头正向引物31190pro-Gf；
第二轮为Overlapping PCR，用特异引物扩增表达盒产物：将第一轮反应1和反应2中的PCR产物稀释10倍混合分别作为模版；使用引物对U-GAL/Pgs-GA2，扩增产物为U6a-Badh2-gRNA；使用引物对U-GA2/Pgs-GAR扩增产物为U6b-SWEET14-gRNA；反应程序均为：95℃10s，58℃15s，68℃20s，20个循环；
所述U-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述gR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述U-GAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述Pgs-GA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述U-GA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述Pgs-GAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统中，含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体的构建方法包括以下步骤：
将含水稻香味基因Badh2靶位点序列的sgRNA表达盒U6a-Badh2-gRNA和含白叶枯病感病基因SWEET14基因靶位点序列的sgRNA表达盒U6b-SWEET14-gRNA用重组酶连接到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上。
5.水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点序列，其特征在于，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.含水稻香味基因Badh2和白叶枯病感病基因SWEET14靶位点的CRISPR表达载体，其特征在于，所述水稻香味基因Badh2的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述白叶枯病感病基因SWEET14的引导RNA靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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| GR01 | Patent grant | ||
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