CN110791524A - 一种通过编辑OsSWEE14基因外显子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过编辑OsSWEE14基因外显子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，所述方法为通过编辑OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域的靶序列，使靶序列产生插入或者缺失若干碱基的突变，得所述广谱抗白叶枯病水稻；所述第一外显子区域的靶序列如SEQ ID No.1所示，所述第三外显子区域的靶序列如SEQ ID No.2所示。通过本发明方法培育得到的抗白叶枯病水稻可抵抗数十种白叶枯病菌，具有抗谱很广的优点。

Description

一种通过编辑OsSWEE14基因外显子培育广谱抗白叶枯病水稻 的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过编辑OsSWEE14基因外显子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法。
背景技术
水稻白叶枯病是由黄单胞杆菌引起的维管束病害，受黄单胞杆菌侵染的稻区轻则减产10％-20％，重则减产50％以上，严重时颗粒无收。目前的防治手段主要依靠化学防治和农业防治。传统化学防治通常依赖于农药的使用；农业防治主要是通过种植抗病品种来抵抗白叶枯病，在农业上多选用水稻自身携带的白叶枯病抗性基因来培育抗病品种，也是目前比较经济有效的方法。目前也有采用基因编辑技术CRISPR/Cas9系统破坏水稻白叶枯病感病基因OsSWEET14启动子区域，导致感病基因不能被激活，从而获得具有白叶枯病抗性的水稻。
水稻白叶枯病为维管束病害，农药的使用只能暂时减轻白叶枯病的危害，且成本大、污染重、安全性低。白叶枯病菌在长期面对抗性基因的压力，必定会发生变异，使得原有抗性品种降低或丧失抗性。
发明内容
基于此，本发明提供一种通过编辑OsSWEE14基因外显子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，通过本发明方法培育出的抗白叶枯病水稻可抵抗数十种白叶枯病菌株，对白叶枯病抗谱很广。
具体技术方案为：
一种通过编辑OsSWEE14基因外显子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，所述方法为通过编辑OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域的靶序列，使靶序列产生插入或者缺失若干碱基的突变，得所述广谱抗白叶枯病水稻；所述第一外显子区域的靶序列如SEQID No.1所示，所述第三外显子区域的靶序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1：5’-CATGTCTCTTCAGCATCCC-3’
SEQ ID No.2：5’-GTCGACGCAGGGGTTCCAGT-3’
在其中一些实施例中，所述方法为利用CRISPR/Cas9系统编辑OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域的靶序列，使靶序列产生插入或者缺失若干碱基的突变。
在其中一些实施例中，针对OsSWEET14基因第一外显子区域靶序列的sgRNA1序列如SEQ ID No.3所示，针对OsSWEET14基因第三外显子区域靶序列的sgRNA2序列如SEQ IDNo.4所示。
SEQ ID No.3：
5’-TAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGGCTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCACATGTCTCTTCAGCATCCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’
SEQ ID No.4：
5’-GGCAGCAAAGGATGCAAGAACGAACTAAGCCGGACAAAAAAAAAAGGAGCACATATACAAACCGGTTTTATTCATGAATGGTCACGATGGATGATGGGGCTCAGACTTGAGCTACGAGGCCGCAGGCGAGAGAAGCCTAGTGTGCTCTCTGCTTGTTTGGGCCGTAACGGAGGATACGGCCCACGAGCGTGTACTACCGCGCGGGATGCCGCTGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTGGGTCGCGGGAGCGTTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACCGAACAATGAAGAACCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTGGTCGACGCAGGGGTTCCAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’
在其中一些实施例中，针对OsSWEET14基因第一外显子区域靶序列的sgRNA1由水稻snRNA OsU3启动子驱动，针对OsSWEET14基因第三外显子区域靶序列的sgRNA2由水稻snRNA OsU6b启动子驱动。
在其中一些实施例中，所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法包括以下步骤：
(1)菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体菌种在含有卡那霉素的平板培养基上划线培养过夜，将携带pYLsgRNA1-OsU3/LacZ载体和pYLsgRNA2-OsU6b载体的菌种在含有氨苄青霉素的平板培养基上划线培养过夜，分别挑取单菌落培养种子液，再扩大培养用于提取质粒；
(2)构建sgRNA1表达盒：
1)第一轮PCR反应：pYLsgRNA1-OsU3/LacZ质粒为模板，做两个PCR反应，一个PCR反应使用引物U-F和OsU3-S14E1，产物为a；另一个PCR反应使用引物gR-R和gR-S14E1，产物为b；两个PCR反应程序如下：25-28个循环：98℃10s，55℃15s，72℃20s；所述引物U-F序列如SEQ ID No.5所示，引物OsU3-S14E1序列如SEQ ID No.6所示，引物gR-R序列如SEQ ID No.7所示，引物gR-S14E1序列如SEQ ID No.8所示；
2)第二轮PCR反应：将第一轮PCR反应获得的产物a和b混合作为模板，Pps-GGL和Pgs-GG2作为引物，用高保真酶进行扩增；PCR反应程序如下：25-28个循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s；所述引物Pps-GGL序列如SEQ ID No.9所示，引物Pgs-GG2序列如SEQ IDNo.10所示；
(3)构建sgRNA2表达盒：
1)第一轮PCR反应：pYLsgRNA2-OsU6b质粒为模板，做两个PCR反应，一个PCR反应使用引物U-F和U6b-S14E3，产物为c；另一个PCR反应使用引物gR-R和gR-S14E3，产物为d；两个PCR反应程序如下：25-28个循环：98℃10s，55℃15s，72℃20s；所述引物U-F序列如SEQ IDNo.5所示，引物U6b-S14E3序列如SEQ ID No.11所示，引物gR-R序列如SEQ ID No.7所示，引物gR-S14E3序列如SEQ ID No.12所示；
2)第二轮PCR反应：将第一轮PCR反应获得的产物c和d混合作为模板，Pps-GG2和Pgs-GGR为引物，用高保真酶进行扩增；PCR反应程序如下：25-28个循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s；所述引物Pps-GG2序列如SEQ ID No.13所示，引物Pgs-GGR序列如SEQ ID No.14所示；
(4)pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体与sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒进行酶切-连接反应，得连接产物；
(5)将步骤(4)中的连接产物转化E.coli感受态细胞，然后加入1ml LB培养基，37℃培养1-1.5h后涂平板，挑选阳性克隆；
(6)将步骤(5)获得的阳性克隆扩大培养后提取质粒转化农杆菌，挑选阳性农杆菌；
(7)将步骤(6)获得的阳性农杆菌浸染水稻，得广谱抗白叶枯病水稻。
SEQ ID No.5：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’
SEQ ID No.6：5’-GGGATGCTGAAGAGACATGTGCCACGGATCATCTGC-3’
SEQ ID No.7：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’
SEQ ID No.8：5’-CATGTCTCTTCAGCATCCCGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’
SEQ ID No.9：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’
SEQ ID No.10：5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’
SEQ ID No.11：5’-ACTGGAACCCCTGCGTCGACCAACACAAGCGGCAGC-3’
SEQ ID No.12：5’-GTCGACGCAGGGGTTCCAGTGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’
SEQ ID No.13：5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’
SEQ ID No.14：5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’
所述pYLsgRNA1-OsU3/LacZ载体为携带sgRNA1序列、OsU3启动子序列和LacZ基因序列的PUC18载体；所述pYLsgRNA2-OsU6b载体为携带sgRNA2序列和OsU6b启动子序列的PUC18载体。两种载体可通过本领域常规技术构建。
在其中一些实施例中，所述步骤(4)中pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体、sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒的质量比为(6-8)：1：1；酶切-连接反应的条件为：先3个循环：37℃10min，10℃5min，20℃5min；再10个循环：37℃3min，10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。
在其中一些实施例中，所述步骤(5)中转化方法为热激法，且热激条件为：取连接产物加入E.coli感受态细胞，冰浴30min后，42℃热激90s，再冰浴3min；所述E.coli感受态细胞为DH5α。
在其中一些实施例中，所述步骤(6)中转化方法为冻融法，且冻融条件为：取阳性克隆扩大培养后提取质粒加入农杆菌感受态中，冰浴30min后，液氮速冻5min，室温化冻，加入1mL YEB培养基，28℃培养3-4h后涂平板，挑选阳性克隆；所述农杆菌为农杆菌EHA105。
在其中一些实施例中，所述水稻为中花11号水稻野生株。
在其中一些实施例中，所述方法还包括以下步骤：(8)转基因抗白叶枯病水稻T0植株的打靶效果检测：PCR扩增OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域靶序列，然后将扩增产物进行测序。
在其中一些实施例中，针对OsSWEET14基因第一外显子区域靶序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID No.15所示的上游引物和SEQ ID No.16所示的下游引物；针对OsSWEET14基因第三外显子区域靶序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID No.17所示的上游引物和SEQ IDNo.18所示的下游引物。
SEQ ID No.15：5’-CCCATGCATTGAGGACAGAGT-3’
SEQ ID No.16：5’-TGGCAACAAAAGTGGAACAT-3’
SEQ ID No.17：5’-TTATAACGTCCGTCGCATTTT-3’
SEQ ID No.18：5’-TTGGGGGCGTAGACGAGGTAGA-3’
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、发明人经过研究发现，通过同时编辑本发明提供的如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域靶序列，使靶序列产生插入或者缺失若干碱基的突变，可获得广谱抗白叶枯病水稻。通过本发明方法培育得到的抗白叶枯病水稻能抵抗白叶枯病菌PXO86、HB17、AUST2031/IV24、HLJ72、NX42、AUST2031/GD14、AUST2031、LC-4、PX079、1947、HB21、GD1358、JS49-6、IV-1和HN1-2，具有抗谱很广的优点。
2、本发明采用多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统编辑OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子的特定区域靶序列，可在靶点位置产生插入或者缺失若干碱基的突变，打靶效果效率更高。且针对OsSWEET14基因第一外显子区域靶序列的sgRNA1由水稻snRNAOsU3启动子驱动，针对OsSWEET14基因第三外显子区域靶序列的sgRNA2由水稻snRNA OsU6b启动子驱动，能有效避免在农杆菌或者水稻基因组中sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒之间发生同源重组，使所述CRISPR/Cas9载体系统具有很好的稳定性。
附图说明
图1为OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域靶序列信息。
图2为实施例2中各株系对白叶枯病菌PXO86的抗性研究结果。
图3为实施例3中CR-S14-6对各白叶枯病菌株的抗性研究结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例一种通过编辑OsSWEE14基因外显子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化和质粒提取制备：将携带pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体的菌种(TOP10F’)在含有卡那霉素(25μg/ml)的平板培养基上划线培养过夜，将携带pYLsgRNA1-OsU3/LacZ载体和pYLsgRNA2-OsU6b载体的菌种(DH10B)在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的平板培养基上划线培养过夜，分别挑取单菌落培养种子液，再扩大培养用于提取质粒；
(2)构建sgRNA1表达盒：
1)第一轮PCR反应：取2-5ng pYLsgRNA1-OsU3/LacZ质粒为模板，做两个PCR反应，一个PCR反应使用引物U-F和OsU3-S14E1，引物在反应体系中的浓度为0.2μM，产物为a；另一个PCR反应使用引物gR-R和gR-S14E1，，引物在反应体系中的浓度为0.1μM，产物为b；两个PCR反应程序如下：28个循环：98℃10s，55℃15s，72℃20s；所述引物U-F序列如SEQ ID No.5所示，引物OsU3-S14E1序列如SEQ ID No.6所示，引物gR-R序列如SEQ ID No.7所示，引物gR-S14E1序列如SEQ ID No.8所示；
2)第二轮PCR反应：分别取1μl第一轮PCR反应获得的产物a和b，用H2O稀释10倍，然后各取1μl混合作为模板，Pps-GGL和Pgs-GG2作为引物(预先将引物混合成10×工作液，每种引物1.5μM)，用高保真酶PRIMESTAR MAXPCR酶进行PCR扩增；PCR反应程序如下：28个循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s；所述引物Pps-GGL序列如SEQ ID No.9所示，引物Pgs-GG2序列如SEQ ID No.10所示；
(3)构建sgRNA2表达盒：
1)第一轮PCR反应：取2-5ng pYLsgRNA2-OsU6b质粒为模板，做两个PCR反应，一个PCR反应使用引物U-F和U6b-S14E3，引物在反应体系中的浓度为0.2μM，产物为c；另一个PCR反应使用引物gR-R和gR-S14E3，引物在反应体系中的浓度为0.1μM，产物为d；两个PCR反应程序如下：28个循环：98℃10s，55℃15s，72℃20s；所述引物U-F序列如SEQ ID No.5所示，引物U6b-S14E3序列如SEQ ID No.11所示，引物gR-R序列如SEQ ID No.7所示，引物gR-S14E3序列如SEQ ID No.12所示；
2)第二轮PCR反应：分别取1μl第一轮PCR反应获得的产物c和d，用H2O稀释10倍，然后各取1μl混合作为模板，Pps-GG2和Pgs-GGR为引物(预先将引物混合成10×工作液，每种引物1.5μM)，用高保真酶PRIMESTAR MAXPCR酶进行PCR扩增；PCR反应程序如下：28个循环：98℃10s，55℃10s，72℃10s；所述引物Pps-GG2序列如SEQ ID No.13所示，引物Pgs-GGR序列如SEQ ID No.14所示；
(4)pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体与sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒进行酶切-连接反应，得连接产物：
连接反应体系如表1所示：
表1酶切-连接反应体系
Figure BDA0002309024460000081
酶切-连接反应的条件为：先3个循环：37℃10 min，10℃5min，20℃5min；再10个循环：37℃3min，10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。
(5)将步骤(4)中的连接产物转化E.coli感受态细胞：
取5μl连接产物加入E.coli DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激90 s，再冰浴3min，然后加入1ml LB培养基，37℃培养1-1.5h后涂平板(涂板培养基为LB+25μg/ml Kan，0.3～0.5 mM IPTG，适量X-gal)，挑选蓝斑阳性克隆；
(6)步骤(5)获得的阳性克隆质粒冻融转化农杆菌(EHA105)，挑选阳性农杆菌(EHA105)：取阳性克隆扩大培养后提取质粒加入农杆菌感受态中，冰浴30min后，液氮速冻5min，室温化冻，加入1 mL YEB培养基，28℃培养3-4 h后涂平板，挑选阳性克隆；
(7)将步骤(6)获得的阳性农杆菌(EHA105)浸染中花11号水稻野生株，得抗白叶枯病水稻；
(8)转基因T0抗白叶枯病水稻植株的打靶效果检测：PCR扩增OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域靶序列，然后将扩增产物进行测序；针对OsSWEET14基因第一外显子区域靶序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID No.15所示的上游引物和SEQ ID No.16所示的下游引物；针对OsSWEET14基因第三外显子区域靶序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID No.17所示的上游引物和SEQ ID No.18所示的下游引物。
本实施例编辑的OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域靶点位置如图1(TargetⅠ位于第一外显子区域；和TargetⅡ位于第三外显子区域)所示。经测序检测，本实施例获得的转基因T0抗白叶枯病水稻植株可在OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子靶点位置产生如表1所示的插入或者缺失若干碱基的突变，相应编号为CR S14-2、CR S14-6、CR S14-9-Ⅰ、CR S14-9-Ⅱ、CR S14-10-Ⅰ和CR S14-10-Ⅱ株系。
表1本实施例打靶产生的抗白叶枯病水稻突变类型
Figure BDA0002309024460000091
实施例2
本实施例研究CR S14-2、CR S14-6、CR S14-9-Ⅰ、CR S14-9-Ⅱ、CR S14-10-Ⅰ和CRS14-10-Ⅱ株系对白叶枯病菌PXO86的抗性。
通过剪叶法对CR S14-2、CR S14-6、CR S14-9-Ⅰ、CR S14-9-Ⅱ、CR S14-10-Ⅰ、CRS14-10-Ⅱ株系和中花11号水稻野生株接种PXO86菌株，于接种后第14天测量病斑并统计。
结果如图2所示，由图2可知，接种了PXO86菌株的CR S14-2、CR S14-6、CR S14-9-Ⅰ、CR S14-9-Ⅱ、CR S14-10-Ⅰ和CR S14-10-Ⅱ株系病斑显著小于对照组中花11号水稻野生株(对应图2中的zhonghua 11)，说明上述各株系对白叶枯病菌PXO86均具有抗性。
实施例3
本实施例研究CR S14-6株系对不同白叶枯病菌的抗性。
通过剪叶法对CR-S14-6株系和中花11号水稻野生株接种以下白叶枯病菌株：PXO86、HB17、AUST2031/IV24、HLJ72、NX42、AUST2031/GD14、AUST2031、LC-4、PX079、1947、HB21、GD1358、JS49-6、IV-1和HN1-2，于接种后第14天测量病斑并统计。
结果如图3所示，由图3可知，接种了上述白叶枯病菌株的CR-S14-6株系病斑显著小于接种了上述白叶枯病菌株的中花11号水稻野生株(对应图3中的zhonghua 11)，说明CR-S14-6株系对上述白叶枯病菌株均具有抗性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种通过编辑OsSWEE14基因外显子培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，所述方法为通过编辑OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域的靶序列，使靶序列产生插入或者缺失若干碱基的突变，得所述广谱抗白叶枯病水稻；所述第一外显子区域的靶序列如SEQ ID No.1所示，所述第三外显子区域的靶序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，所述方法为利用CRISPR/Cas9系统编辑OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域的靶序列，使靶序列产生插入或者缺失若干碱基的突变。
3.根据权利要求2所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，针对OsSWEET14基因第一外显子区域靶序列的sgRNA1序列如SEQ ID No.3所示，针对OsSWEET14基因第三外显子区域靶序列的sgRNA2序列如SEQ ID No.4所示。
4.根据权利要求3所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，针对OsSWEET14基因第一外显子区域靶序列的sgRNA1由水稻snRNA OsU3启动子驱动，针对OsSWEET14基因第三外显子区域靶序列的sgRNA2由水稻snRNA OsU6b启动子驱动。
5.根据权利要求4所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)菌种活化和质粒提取制备：将携带pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体的菌种在含有卡那霉素的平板培养基上划线培养过夜，将携带pYLsgRNA1-OsU3/LacZ载体和pYLsgRNA2-OsU6b载体的菌种在含有氨苄青霉素的平板培养基上划线培养过夜，分别挑取单菌落培养种子液，再扩大培养用于提取质粒；
(2)构建sgRNA1表达盒：
1)第一轮PCR反应：pYLsgRNA1-OsU3/LacZ质粒为模板，做两个PCR反应，一个PCR反应使用引物U-F和OsU3-S14E1，产物为a；另一个PCR反应使用引物gR-R和gR-S14E1，产物为b；两个PCR反应程序如下：25-28个循环：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 20s；所述引物U-F序列如SEQID No.5所示，引物OsU3-S14E1序列如SEQ ID No.6所示，引物gR-R序列如SEQ ID No.7所示，引物gR-S14E1序列如SEQ ID No.8所示；
2)第二轮PCR反应：将第一轮PCR反应获得的产物a和b混合作为模板，Pps-GGL和Pgs-GG2作为引物，用高保真酶进行扩增；PCR反应程序如下：25-28个循环：98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 10s；所述引物Pps-GGL序列如SEQ ID No.9所示，引物Pgs-GG2序列如SEQ ID No.10所示；
(3)构建sgRNA2表达盒：
1)第一轮PCR反应：pYLsgRNA2-OsU6b质粒为模板，做两个PCR反应，一个PCR反应使用引物U-F和U6b-S14E3，产物为c；另一个PCR反应使用引物gR-R和gR-S14E3，产物为d；两个PCR反应程序如下：25-28个循环：98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 20s；所述引物U-F序列如SEQ IDNo.5所示，引物U6b-S14E3序列如SEQ ID No.11所示，引物gR-R序列如SEQ ID No.7所示，引物gR-S14E3序列如SEQ ID No.12所示；
2)第二轮PCR反应：将第一轮PCR反应获得的产物c和d混合作为模板，Pps-GG2和Pgs-GGR为引物，用高保真酶进行扩增；PCR反应程序如下：25-28个循环：98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 10s；所述引物Pps-GG2序列如SEQ ID No.13所示，引物Pgs-GGR序列如SEQ ID No.14所示；
(4)pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体与sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒进行酶切-连接反应，得连接产物；
(5)将步骤(4)中的连接产物转化E.coli感受态细胞，然后加入1ml LB培养基，37℃培养1-1.5h后涂平板，挑选阳性克隆；
(6)将步骤(5)获得的阳性克隆扩大培养后提取质粒转化农杆菌，挑选阳性农杆菌；
(7)将步骤(6)获得的阳性农杆菌浸染水稻，得广谱抗白叶枯病水稻。
6.根据权利要求5所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，所述步骤(4)中pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体、sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒的质量比为(6-8)：1：1；酶切-连接反应的条件为：先3个循环：37℃ 10min，10℃ 5min，20℃ 5min；再10个循环：37℃3min，10℃ 5min，20℃ 5min；最后37℃ 5min。
7.根据权利要求5所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，所述步骤(5)中转化方法为热激法，且热激条件为：取连接产物加入E.coli感受态细胞，冰浴30min后，42℃热激90s，再冰浴3min；所述E.coli感受态细胞为DH5α。
8.根据权利要求5所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，所述步骤(6)中转化方法为冻融法，且冻融条件为：将阳性克隆扩大培养后提取质粒加入农杆菌感受态中，冰浴30min后，液氮速冻5min，室温化冻，加入1mL YEB培养基，28℃培养3-4h后涂平板，挑选阳性克隆；所述农杆菌为农杆菌EHA105。
9.根据权利要求5所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：(8)转基因T0抗白叶枯病水稻植株的打靶效果检测：PCR扩增OsSWEET14基因第一外显子和第三外显子区域靶序列，然后将扩增产物进行测序。
10.根据权利要求9所述的培育广谱抗白叶枯病水稻的方法，其特征在于，针对OsSWEET14基因第一外显子区域靶序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID No.15所示的上游引物和SEQ ID No.16所示的下游引物；针对OsSWEET14基因第三外显子区域靶序列的PCR扩增引物包括如SEQ ID No.17所示的上游引物和SEQ ID No.18所示的下游引物。
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