CN105112422A - 基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因miR408和UCL（uclacyanin）在培育高产水稻中的应用。本发明通过分析水稻谷粒和胚胎中特异性表达的miRNA，发现miR408基因在水稻谷粒发育中具有重要的调控作用，而且这一功能是通过下调其靶基因UCL实现的。本发明还分别构建了过表达miR408、UCL-RNA干涉和UCL-CRISPR敲除的水稻突变株，研究显示，三种突变株均显示出生长迅速的现象，并且在成熟期时稻穗明显比野生型下垂，而且结实率增加，穗型更大，每穗粒数显著高于野生型，千粒重和产量也有显著提高。本发明为培育高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用，且不会对环境造成污染，食用安全。

Description

基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用

技术领域

本发明属于植物育种技术领域。更具体地，涉及基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用。

背景技术

粮食问题是当今世界所面临的几个难题之一。寻找影响水稻产量相关特性的基因一直以来都是提高粮食产量的研究重点。目前已经发现了不少影响水稻产量的基因，对提高水稻产量提供了理论基础。

miRNA（microRNA）是一组非编码单链RNA，广泛存在于动物和植物等多细胞生物中，它可以通过与靶基因mRNA的特定位点结合，诱导该mRNA的降解或抑制该蛋白质的合成，在转录水平或转录后水平导致基因沉默，从而参与基因的表达调控。miRNAs参与了几乎所有的生命活动，并起着重要作用。在植物中，DCL1酶在细胞核内识别miRNA前体（pre-miRNA）的茎环结构，将其切割成miRNA：miRNA*双体，然后由HST蛋白将其转运到细胞质中进行进一步的加工。在不同的植物组织、器官和发育时期，miRNA的表达谱是不同的，并且部分miRNA在不同的外界环境下也有着不同的表达水平。因此，研究miRNA表达谱对miRNA生物功能的研究是非常重要的。

miRNA的调控广泛存在于植物发育及生长的各个生理过程，是目前分子生物学研究的热点。miRNA主要参与植物组织器官发育、生物胁迫与非生物胁迫、信号转导调控等。如miR172调控植物花发育和开花时间，miR172在花期花瓣中的过表达，引起靶基因AP2转录因子的表达下降，导致植物花期提前及花器官形态不规则；miR159在植物ABA诱导或干旱条件下表达发生变化。过表达miR159，可抑制MYB33、MYB101转录因子，使植物对ABA信号不敏感。而MYB转录水平的提高，可增强对ABA的敏感性，也可与RD22启动子的顺式元件结合后激活下游渗透调节基因表达，起到正调节干旱胁迫。生长素参与植物组织发育、形态发育、维管运输等。miR393的靶蛋白为F-box类的生长素因子（TIR1,AFB2,AFB3），这些蛋白是生长素信号的转导的重要节点，miR393的表达量提高会减少TIR1的表达，而TIR1作为转录抑制应答因子，可控制Aux/AAI的蛋白泛素化。

有趣的是，还有一些植物miRNA通过下调其靶基因而参与调控水稻产量。近期有报道，水稻miR397通过切割其靶基因LAC，而影响了油菜素内酯的信号转导通路，过表达miR397可增加水稻穗分支，增大谷粒，显著提高水稻产量；miR167可以通过调控其靶基因ARF8，来调节生长素信号通路，并最终影响植物产量；miR159切割一类受赤霉素调控的MYB家族基因，组成型表达miR159会引起短日照情况下开花的推迟和花粉的不正常发育；水稻中miR156通过对下调其靶基因OsSPL14，显著降低水稻分蘖，穗分支及种子数量，直接负调控水稻产量。

但是，为了解决不断增长的人口与逐渐减少的耕地面积的矛盾，发现更多调节水稻产量的基因仍是急需解决的大问题。因此，不断寻找新的提高水稻产量相关基因，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术缺陷和不足，提供基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用。旨在针对解决当前粮食紧缺与不断增长的人口这一主要矛盾，利用该基因，将miRNA调控技术，以及其靶基因的RNA干涉和CRISPR敲除技术引入水稻的品种改良中，从而提供miR408及其靶基因UCL在培育高产水稻中的应用。

本发明的目的是提供基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用。

本发明另一目的是提供一种高产水稻的培育方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

基因miR408在培育高产水稻中的应用，所述基因miR408的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

UCL基因在培育高产水稻中的应用，所述基因UCL的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明通过分析水稻种子和胚胎中特异表达的miRNAs，发现miR408在种子和胚胎中均高表达，并且在胚后发育时表达量显著下调，这暗示了miR408可能有调节水稻种子发育的潜在功能。为了进一步验证miR408与水稻种子的关系，本发明构建了过表达miR408的水稻突变株，该突变株生长迅速，并且在成熟期时稻穗明显比野生型下垂，具有高产的特征。

由于miRNA是通过对其靶基因的下调而实现功能的，而miR408的靶基因是UCL，所以我们又通过RNA干涉技术和CRISPR技术沉默了水稻内源UCL，对该沉默突变株进行详细的表型分析后发现，发现该突变株的水稻谷粒显著大于野生型谷粒，并且每穗粒数与千粒重都也明显高于野生型，最终每株平均产量也显著高于野生型水稻。除了对水稻产量的影响外，该突变株还具有提前抽穗的表型，非常适宜于投入生产使用。

综上所述可以得出结论：过表达miR408或者沉默水稻内源UCL基因可以显著提高水稻的产量，增大谷粒大小与千粒重，增多每穗粒数。因此miR408及其靶基因UCL可以用于培育高产水稻。

因此，基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用均在本发明的保护范围之内。

具体地利用基因miR408和UCL培育高产水稻的方法不做严格限制，可采用目前已有的各种生物学方法。

具体作为一种可实施的优选方案，利用基因miR408培育高产水稻的方法是在水稻中过表达基因miR408制备高产水稻。

具体过表达miR408基因的方法不做严格限制，可采用目前已有的各种生物学方法。作为一种可实施的方案，本发明提供了一种在水稻中过表达基因miR408制备高产水稻的方法，步骤如下：

S1.构建MiR408组成型表达质粒

S11.在载体pCAMBIA1390的酶切位点HindIII和SalI之间插入CaMV35S启动子；

S12.以野生型水稻总RNA为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示引物进行miR408基因的克隆，在扩增产物两端加上EcoRI和BglII的酶切位点；

S13.利用EcoRI和BglII双酶切步骤S11和S12的产物，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来，即构建成miR408组成型表达质粒；

S2.MiR408组成型表达质粒转化水稻愈伤组织；

S3.水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，得到过表达miR408的转基因水稻。

更具体优选地，步骤S2所述MiR408组成型表达质粒转化水稻愈伤组织的方法如下：

S21.将MiR408组成型表达质粒转化根癌农杆菌；

S22.利用利福平和卡那霉素筛选培养根癌农杆菌菌种，再刮取菌体悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的AAM液体共培养基中，使之稀释至OD550为0.25～0.35，28℃摇床140rpm培养40min，得到根癌农杆菌浸染液；

S23.用水稻的成熟种子诱导出培养愈伤组织；

S24.将S22制备好的根癌农杆菌侵染液侵染愈伤组织，然后把愈伤组织接到共培养基上26℃黑暗培养2～3天。

步骤S3所述转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化的方法如下：

S31.取出权利要求4步骤S24共培养后的愈伤组织，分别利用筛选培养基、预分化培养基和分化培养基进行依次培养，使愈伤组织进行再生分化出小苗；

S33.待小苗长到4～6cm时，将其转到生根培养基上，继续培养至小苗长10～12cm、叶片宽大、颜色深绿且根系生长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行种植，即得到过表达miR408的转基因水稻。

作为一种最优选的实施方案，在水稻中过表达基因miR408制备高产水稻的方法，步骤如下：

S1.构建MiR408组成型表达质粒

S11.在载体pCAMBIA1390的酶切位点HindIII和SalI之间插入CaMV35S启动子；

S12.以野生型水稻总RNA为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示引物进行miR408基因的克隆，在扩增产物两端加上EcoRI和BglII的酶切位点；

S13.利用EcoRI和BglII双酶切步骤S11和S12的产物，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来，即构建成miR408组成型表达质粒；

S21.将MiR408组成型表达质粒转化根癌农杆菌；

S22.将转化后的根癌农杆菌菌种在含有利福平和卡那霉素的YEP培养基上进行划线培养，28℃黑暗培养2～3天后挑取单菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培养基上，28℃黑暗培养2天，刮取菌体悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的AAM液体共培养基中，使之稀释至OD550为0.25～0.35，28℃摇床140rpm培养40分钟，制备得到根癌农杆菌浸染液；

S23.取水稻的成熟种子剥去颖壳，用75%酒精浸泡1分钟后用无菌水清洗多次，然后用1%次氯酸钠浸泡两次，每次20分钟，期间摇动多次，无菌水清洗多次后用无菌滤纸吸干水分，接到诱导培养基上，将诱导出的胚性愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上继续培养，每隔2～3个星期再挑取生长状态好的愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上进行继代培养；

S24.挑取淡黄色、颗粒状、结构致密、生长状态好的愈伤组织到无菌三角瓶中适当干燥处理后，加入S22制备好的根癌农杆菌侵染液侵染20分钟，期间适当摇动几次；侵染后将愈伤组织放在加有无菌滤纸的培养皿中，风干1～2小时，然后把愈伤组织接到加有一层滤纸的共培养基上，再风干半小时左右后，置于26℃黑暗培养2～3天；

步骤S3所述转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化的方法如下：

S31.取出S24共培养后的愈伤组织放在加有三层滤纸的无菌培养皿中，干燥1天左右，再接到筛选培养基上，置于26℃黑暗培养14～21天，共筛选两次；挑取生长状态好的抗性愈伤组织接到预分化培养基上，26℃光照培养；21天后，把生长状态好及出现绿点的抗性愈伤组织接到分化培养基上，使愈伤组织进行再生；

S32.待抗性愈伤组织分化出的小苗长到4～6cm时，将其转到生根培养基上，继续在26℃光照培养；待小苗长至10～12cm，叶片宽大、颜色深绿且根系生长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行盆栽种植，即得到过表达miR408的转基因水稻。

其中，所述YEP培养基的配方为：10g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，15g/L琼脂。

所述AAM液体共培养基的配方为：AAM大量，AAM微量，AAM有机，铁盐，30g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，PH5.2。

所述诱导培养基的配方为：N6大量，B5微量，B5有机，铁盐，2mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3.0g/L植物凝胶。

所述筛选培养基的配方为：N6培养基大量+MS培养基微量+B5培养基少量+1g/L水解酪蛋白+1g/L脯氨酸+2mg/L（2，4-D）+30g/L蔗糖+潮霉素50mg/L+头孢500mg/L+4g/L植物凝胶，筛选培养基的终PH=5.8。

所述预分化培养基的配方为：MS培养基＋1g/L水解酪蛋白＋20g/L蔗糖+1mg/L（2，4-D）+头孢500mg/L+潮霉素50mg/L＋4g/L植物凝胶，预分化培养基的终pH=5.8。

所述分化培养基的配方为：MS培养基+2mg/L（6-BA）+0.5mg/L萘乙酸＋1mg/L激动素+30g/L蔗糖+3%山梨醇+4g/L植物凝胶，分化培养基的终pH=5.8。

所述生根培养基的配方为1/2MS培养基。

另外，作为一种可实施的优选方案，利用UCL基因培育高产水稻的方法是沉默水稻中UCL基因的表达。

具体沉默UCL基因的方法不做严格限制，可采用目前已有的各种生物学方法。作为一种可实施的方案，本发明提供了一种沉默水稻中UCL基因的表达制备高产水稻的方法，是利用RNA干涉或CRISPR敲除的方法沉默水稻中UCL基因的表达。

具体地，所述RNA干涉的方法步骤如下：

S1.构建UCL-RNA干涉表达质粒

S11.利用pCAMBIA1305.2、pUC18-Pubi和pZEro-T改造得到RNA干涉载体；

S12.以野生型水稻总RNA为模板，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示引物克隆UCL基因，并且在扩增产物两端加上HimdIII和BamhI的酶切位点；

S13.利用HimdIII和BamhI双酶切步骤S11和S12的产物，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来，即构建得到中间重组质粒；

S14.用两端加有MluI和PstI酶切位点的RNAi载体特异引物扩增中间重组质粒，再经MluI和PstI双酶切后克隆到同样酶酶切的中间重组质粒中，构建得到UCL-RNA干涉质粒；

S2.UCL-RNA干涉表达质粒转化水稻愈伤组织，方法同上；

S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，方法同上，得到UCL-RNA干涉水稻突变株；

其中，所述RNAi载体特异引物的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。

所述CRISPR敲除的方法步骤如下：

S1.构建UCL-CRISPR敲除质粒

S11.确定miR408靶基因UCL的两个打靶位点T1和T2，在T1接头正向引物5’端加上GCCA四个碱基，在T2接头正向引物5’端加上GCCG四个碱基，T1接头反向引物和T2接头反向引物的5’端均加上AAAC四个碱基；

S12.将每个靶点的正反向接头引物进行退火形成双链，然后分别连接到BsaI酶切后的pYLsgRNA-OsU3和pYLsgRNA-OsU6质粒片段上，产生两个sgRNA表达盒；

sgRNA表达盒经两轮巢式PCR反应扩增，第一轮分别用U-F/接头反向引物和接头正向引物/gRNA-R分两个反应进行，第二轮用位置特异引物PT1-F/PT1-R和PT2L-F/PT2L-R分别扩增T1和T2sgRNA表达盒；

S13.对两个sgRNA表达盒的扩增产物进行纯化，并进行BsaI酶切，然后用T4连接酶将酶切产物与相同酶切的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体连接起来，即构建成靶向UCL基因的两个位点的UCL-CRISPR敲除质粒；

S2.UCL-CRISPR敲除质粒转化水稻愈伤组织，方法同上；

S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，方法同上，得到UCL-CRISPR的水稻突变株；

其中，所述T1接头正向引物、T1接头反向引物、T2接头正向引物、T2接头反向引物分别如SEQIDNO.9~12所示；

所述U-F/接头反向引物和接头正向引物/gRNA-R分别如SEQIDNO.13~14所示；

所述引物PT1-F和PT1-R，PT2L-F和PT2L-R分别如SEQIDNO.15～18所示。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现miR408在水稻谷粒发育中具有调控作用，而且这一功能是通过下调其靶基因UCL实现的，为miR408基因和其UCL靶基因的功能研究和应用，以及水稻增产研究提供了新的思路和研究基础。

本发明还分别构建了过表达miR408、UCL-RNA干涉和UCL-CRISPR敲除的水稻突变株，研究结果显示，过表达miR408或者沉默UCL基因可以显著提高水稻的产量，增加结实率，增大谷粒大小与千粒重，增多每穗粒数，这一结果为培育高产水稻提供了一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用。

另外，除了对水稻产量的影响外，沉默UCL基因突变株还具有提前抽穗的表型，非常适宜于投入生产使用。

利用本发明的研究成果，通过分子生物学技术培育高产水稻，不但水稻的产量高，而且不会对环境造成污染，食用安全。

附图说明

图1为northern杂交检测T3代过表达miR408突变株中miR408的表达水平；其中，1～6为T3代突变株系列，7为野生型对照。

图2为qRT-PCR检测UCLRNA干涉突变株中内源UCL的表达水平；其中1为WT，2，3为突变株。

图3为UCL-CRISPR水稻突变株中UCL基因部分缺失的检测；其中A为UCL基因缺失片段，B为PCR检测UCL基因缺失电泳图。

图4为野生型与突变株全株的比较；其中，左边为过表达miR408的突变株，右边为野生型。

图5为野生型与突变株的种子大小比较；其中，上排为过表达miR408的突变株谷粒，下排为野生型。

图6为野生型与突变株的穗大小比较；其中，左边为过表达miR408的突变株穗，右边为野生型。

图7为野生型与突变株千粒重和每穗粒数的统计比较；其中，左图为千粒重比较，右图为每穗粒数比较，黑色柱子1代表野生型，灰色柱子2,3,4代表过表达miR408的突变株。

图8为野生型与突变株每穗产量的统计比较；其中，黑色柱子1代表野生型，灰色柱子2,3,4代表过表达miR408的突变株。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1水稻总RNA提取方法

本发明以下实施例中采用酚氯仿异戊醇法提取水稻总RNA（包括野生型和各种突变型水稻），其具体步骤如下：

（1）称1g水稻样品液氮研磨成细粉，加入10mLRNAzol（100ml中含有异硫氰酸胍47.2g，1M柠檬酸钠(pH7.0)2.5ml，10%月桂酰基氮酸钠5ml）和1mL醋酸钠（2M，pH4.0），继续研磨；

（2）加入10mL的水饱和酚，4mL的氯仿：异戊醇（49:1，体积比）混合液，混匀后转入离心管，涡旋1min，冰上放置5分钟，然后4℃，12000rpm离心15min；

（3）离心后取上清，并向上清液中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（50：49：1，体积比）混合液，涡旋1min，冰上放置5分钟，然后4℃，12,000rpm离心15min；

（4）离心后取上清，重复步骤（3）2～3次；

（5）离心后取上清，并向上清液中加入异丙醇（异丙醇和上清液的体积比为0.6：1），冰上放置30min～1h；

（6）4℃，12,000rpm离心15min，弃上清，往管中加入1.2mLDEPC处理水溶解管底沉淀，然后每管600μl分装转入1.5mL的离心管；

（7）向上述1.5L离心管中加入600μl的酚:氯仿：异戊醇（50：49：1，体积比）混合液，上下颠倒混匀后，冰上放置5分钟，室温12,000rpm离心15min；

（8）离心后取上清，重复步骤（7）2～3次；

（9）离心后取上清，将上清液每管分装300μL分装入新的离心管中，并向分装后的离心管中加入1/10上清体积的3MNaAc（pH5.2）和3倍上清体积的无水乙醇，混匀，-20℃放置过夜；

（10）4℃，12,000rpm离心15min，弃除上清，70%乙醇洗两次，95%乙醇洗一次，晾干，用15～30μLDEPC处理水溶解，-20℃保存备用，即获得水稻总RNA。

实施例2过表达miR408水稻突变株的构建

1、MiR408组成型表达质粒的构建

（1）本实施例选择载体pCAMBIA1390（市购），并且在该载体的酶切位点HindIII和SalI之间插入CaMV35S启动子，该启动子以后可以作为控制miR408表达的组成型启动子。这里的试验操作采用本领域的常规技术。

（2）以实施例1的方法提取的野生型水稻处理样品总RNA为模板，克隆miR408基因，上游引物F1的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，下游引物R1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，并且在扩增产物两端加上EcoRI和BglII的酶切位点。PCR扩增反应条件参考PCR扩增反应试剂盒说明。

（3）PCR结束后回收扩增产物并进行EcoRI和BglII双酶切，同时对pCAMBIA1390载体也进行EcoRI和BglII双酶切，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来，即构建成miR408组成型表达质粒。

上述所涉及的扩增产物回收，双酶切反应，T4连接等反应均采用本领域的常规操作，实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。

2、MiR408组成型表达质粒转化水稻愈伤组织

（1）将上述构建的MiR408组成型表达质粒转化根癌农杆菌（市售），所述转化方法为本领域常规操作。

（2）然后将该转化有miR408过表达质粒的根癌农杆菌菌种，在含有利福平和卡那霉素的YEP培养基（10g酵母膏,10g蛋白胨，5gNaCl，15g琼脂）上进行划线培养，28℃黑暗培养2～3天后挑取单菌落涂布于含有相同抗生素的YEP培养基上，28℃黑暗培养2天，刮取适量菌体悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的AAM液体共培养基（AAM大量，AAM微量，AAM有机，铁盐，30g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖）中，使之稀释至OD550为0.3左右，28℃摇床（140rpm）培养40分钟，即制备得到根癌农杆菌浸染液，可用于浸染。

（3）取水稻的成熟种子剥去颖壳，用75%%酒精浸泡1分钟后用无菌水清洗多次，然后用1%次氯酸钠浸泡两次，每次20分钟，期间摇动多次，无菌水清洗多次后用无菌滤纸吸干水分，接到诱导培养基（N6大量，B5微量，B5有机，铁盐，2mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，300mg/L水解酪蛋白，3.0g/L植物凝胶）上，将诱导出的胚性愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上继续培养，每隔2～3个星期再挑取生长状态好的愈伤组织接到新鲜的诱导培养基上进行继代培养。

（4）挑取淡黄色、颗粒状、结构致密、生长状态好的愈伤组织到无菌三角瓶中适当干燥处理后，加入上述制备好的根癌农杆菌侵染液侵染20分钟，期间适当摇动几次。侵染后将愈伤组织放在加有无菌滤纸的培养皿中，风干1～2小时。然后把愈伤组织接到加有一层滤纸的共培养基上，再风干半小时左右后，置于26℃黑暗培养2～3天。

3、转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化

（1）取出共培养后的愈伤组织放在加有三层滤纸的无菌培养皿中，干燥1天左右，再接到筛选培养基上，置于26℃黑暗培养14～21天。共筛选两次。挑取生长状态好的抗性愈伤组织接到预分化培养基上，26℃光照培养。21天后，把生长状态好及出现绿点的抗性愈伤组织接到分化培养基上，使愈伤组织进行再生。

（2）待抗性愈伤组织分化出的小苗长到4～6cm时，将其转到生根培养基上，继续在26℃光照培养。待小苗长至10～12cm，叶片宽大、颜色深绿且根系生长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行盆栽种植，即得到过表达miR408的转基因水稻。

上述筛选培养基的配方为：N6培养基大量+MS培养基微量+B5培养基少量+1g/L水解酪蛋白+1g/L脯氨酸+2mg/L（2，4-D）+30g/L蔗糖+潮霉素50mg/L+头孢500mg/L+4g/L植物凝胶，筛选培养基的终PH=5.8。

上述预分化培养基的配方为：MS培养基＋1g/L水解酪蛋白＋20g/L蔗糖+1mg/L（2，4-D）+头孢500mg/L+潮霉素50mg/L＋4g/L植物凝胶，预分化培养基的终pH=5.8。

上述分化培养基的配方为：MS培养基+2mg/L（6-BA）+0.5mg/L萘乙酸＋1mg/L激动素+30g/L蔗糖+3%山梨醇+4g/L植物凝胶，分化培养基的终pH=5.8。

上述生根培养基的配方为1/2MS培养基。

本实施例中所采用的MS培养基、1/2MS培养基和N6培养基等的配方均采用本领域的常规配方。上述各培养基配方中所涉及的试剂均为市售。

4、miRNA的Northern杂交

（1）提取T3代过表达miR408的转基因水稻（处理样品组）总RNA和野生型水稻（对照组）总RNA进行Northernblot检测，所用方法均可参考本领域Northern杂交的常规操作。

（2）取水稻总RNA1μL进行甲醛变性胶电泳，变性电泳采用本领域的常规操作。

（3）待电泳完毕，取下电泳板后揭板，用一张和目标区域差不多大小的干滤纸覆在凝胶样品区域上，用刀片切去多余的凝胶，利用滤纸把胶翻转，剥离另一块电泳板。在胶上盖一张等面积的预先用0.5×TBE浸润的HybondN⁺尼龙膜，将滤纸-凝胶-尼龙膜放于电泳转移系统（Bio-Rad）电极之间，胶在上面，尼龙膜在下面，上下各垫10层用0.5×TBE浸湿并赶走气泡的滤纸。用0.8mA/cm²尼龙膜的电流强度，通电45分钟。之后关闭电源，取下尼龙膜。尼龙膜在253nm紫外灯下正反两面分别交联3分钟，将RNA及分子量标记固定于膜上。将交联好的尼龙膜放入杂交管中，加入5～10mL杂交液（杂交液的配制可参考本领域Northern杂交所采用的常规杂交液配制），42℃预杂交1小时，然后加入同位素标记探针20μL，42℃杂交过夜。杂交完毕，将杂交液倒出，用洗膜液（2×SSPE，0.5%SDS）于室温下洗3次，每次10分钟。将杂交膜包入保鲜膜中，压磷屏3小时以上，再用磷屏扫描仪Typhoon8600imager扫描，并保存结果。

（4）Northern杂交检测结果如附图1所示，过表达miR408的突变株中miR408表达量明显高于野生型。

实施例3UCL-RNA干涉水稻突变株的构建

1、UCL-RNA干涉表达质粒的构建

（1）本实施例所用RNA干涉载体由华南农业大学刘耀光老师提供（RNA干涉载体由载体pCAMBIA1305.2，pUC18-Pubi和pZEro-T改造而来）。

（2）以实施例1的方法提取的野生型水稻处理样品总RNA为模板，克隆UCL基因，上游引物F2的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，下游引物R2的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，并且在扩增产物两端加上HimdIII和BamhI的酶切位点。PCR扩增反应条件参考PCR扩增反应试剂盒说明。

（3）PCR结束后回收扩增产物并进行HimdIII和BamhI双酶切，同时对RNA干涉载体也进行HimdIII和BamhI双酶切，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来即构建成中间重组质粒。

再用两端加有MluⅠ和PstⅠ酶切位点的RNAi载体特异引物（SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示）将克隆的片段从中间重组质粒中再次扩增出，经PstⅠ和MluⅠ双酶切后克隆到同样酶酶切的中间重组质粒中，构建得到UCL-RNA干涉质粒。

上述所涉及的扩增产物回收，双酶切反应，T4连接等反应均采用本领域的常规操作，实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。

2、UCL-RNA干涉表达质粒转化水稻愈伤组织，方法同实施例2步骤2所述。

3、转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，方法同实施例2步骤3所述。

4、经过qRT-PCR检测，如附图2所示，UCL-RNA干涉水稻突变株中UCL基因的表达显著降低，从生物学的角度看，UCL基因被成功沉默。

实施例4UCL-CRISPR的水稻突变株的构建

1、UCL-CRISPR敲除质粒的构建

所用载体为pYLsgRNA-OsU3，pYLsgRNA-OsU6和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H（均由华南农业大学刘耀光老师提供），两个gRNA分别由水稻snRNAU3和U6的启动子驱动，Cas9p由P_Ubi驱动，这些启动子作为控制sgRNA和Cas9p表达的组成型启动子。这里的试验操作采用本领域的常规技术。

（1）确定miR408靶基因UCL的两个打靶位点（T1，T2），合成靶点接头引物，并且在T1接头正向引物（SEQIDNO.9所示）5’端加上GCCA四个碱基，在T2接头正向引物（SEQIDNO.11所示）5’端加上GCCG四个碱基，两个靶点接头反向引物（SEQIDNO.10和SEQIDNO.12所示）5’端均加上AAAC四个碱基。

（2）将每个靶点的正反向接头引物进行退火形成双链，然后分别连接到BsaI酶切后的pYLsgRNA-OsU3和pYLsgRNA-OsU6质粒片段上，产生两个sgRNA表达盒。sgRNA表达盒经两轮巢式PCR反应扩增，第一轮分两个反应进行，分别用U-F/接头反向引物（SEQIDNO.13所示）和接头正向引物/gRNA-R（如SEQIDNO.14所示），第二轮用位置特异引物PT1-F和PT1-R，PT2L-F和PT2L-R（分别如SEQIDNO.15～18所示）分别扩增T1和T2sgRNA表达盒。PCR扩增反应条件参考PCR扩增反应试剂盒说明。

（3）PCR结束后对扩增产物进行纯化，并进行BsaI酶切，同时对pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体也进行BsaI酶切，然后将两个sgRNA表达盒混合后用T4连接酶与pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体连接起来，即构建成靶向UCL基因的两个位点的UCL-CRISPR敲除质粒。

上述所涉及的扩增产物回收，酶切反应，T4连接等反应均采用本领域的常规操作，实验中所涉及的载体、试剂等均为市售。

2、UCL-CRISPR敲除质粒转化水稻愈伤组织，方法同实施例2步骤2所述。

3、转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，方法同实施例2步骤3所述。

4、经过检测，如附图3所示，UCL-CRISPR水稻突变株中UCL基因被成功敲除掉一段序列。

实施例5转基因水稻种植和表型分析

1、表型分析

将上述构建的3种突变株持续传代培育，所有表型分析均使用T3代水稻植株。水稻种子用水萌发，在平盘上种植一周后，转种于大田中长至谷粒成熟。其中，种子大小，千粒重比较使用完全成熟并烘干后的种子；每穗粒数统计使用完全成熟并烘干的完整的穗；所有统计数据均为多于60棵的水稻苗的平均值。每穗产量计算是用单颗谷粒重量乘以每穗粒数。

3、统计分析结果

（1）过表达miR408水稻突变株分析结果：如附图4～8所示，过表达miR408可以增加水稻的生长速度，显著提高水稻的产量，增加结实率，增大谷粒的大小与千粒重，增多每穗粒数。

（2）另外，对UCL-RNA干涉水稻突变株和UCL-CRISPR的水稻突变株的统计结果显示，沉默UCL基因可以增加水稻的生长速度，显著提高水稻的产量，增加结实率，增大谷粒的大小与千粒重，增多每穗粒数。

另外，除了对水稻产量的影响外，沉默UCL基因突变株还具有提前抽穗的表型，非常适宜于投入生产使用。

SEQUENCELISTING

<110>中山大学

<120>基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用

<130>

<160>18

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>213

<212>DNA

<213>基因miR408的核苷酸序列

<400>1

gggagttctgtgattggagaggagaggagacagggatgaggcagagcatgggatggggct60

atcaacagatgtagattattccttgcacaagagatgatgatgagctgtgaatgagttctg120

agagatggctggtgttgttgttgctccctcccctgcactgcctcttccctggctcccctg180

cacacctctctctctctctctctctctctgtgt213

<210>2

<211>1042

<212>DNA

<213>基因UCL的核苷酸序列

<400>2

ggcattggcaaccagccagcctccagctacacactgacactgcactccagcctccgtagg60

agtacttcagctcactatagaatggcaacggcaatggcatcgttacctccaggccccagc120

tagtgcagagatttctcttcctttgcccagtttccaggcagaagcatcaggccaagagct180

caagacccaaccagtgtagtggttgcagtcagtgagtgagtgagtgaccagtgagatagt240

ggcatcgatggctcggggaagaggcagtgcaatgcgaggcgccgtcgccgtcgcgtttct300

cgccgtcgtcgtgagctgcatcttcctctccggctgcggcgtcgccgacgccgccaccta360

ctacgtcggcgacagcctcggctggtccctcggcagcgggagctggcccagcggcaagaa420

gttccacgccggcgacatcctcggtaaatcataggagtacttatctctgaacatttcgat480

caatctctgaacatttttctcatcgatcagacaaagccagctgtaactgaaaccgttttg540

cggacatggcagtgttcaggtacttgccgtggatgcacaacgtggtggccgtcgacgaag600

acgggtacgccgactgcaacccgccgccgttctcgaggtactacacctccggctccgaca660

gcgtcaggctcgccaggggggacaacttcttcgtctgcacccgctacggccactgcaacc720

tcggcatgaagatggtcgtcaccgccgtgtgactgagggagaaacatgtcaagactgttt780

cgtacgtctcgatcgagcgaaaatgctgtgaaatgtcacactctctctatcttgttccat840

ccggttcgttctcagtttttagcattttggatgattgattagaggattctctagctgttc900

tatgccggtgtgacacgactcggtttgccaattgtgtgtgcattgttgacgctgacaaga960

tgcgtttgttctgaaatctgaagagaagtccctgtctttgccactgatgatgatatctac1020

tgcaaattctttagcgaagata1042

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>上游引物F1的核苷酸序列

<400>3

cggaattcttgggacaggtcagcatc26

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>下游引物R1的核苷酸序列

<400>4

gaagatcttgcaacagcccttgaagtg27

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>上游引物F2的核苷酸序列

<400>5

cttcaagcttatggctcggggaagaggca29

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>下游引物R2的核苷酸序列

<400>6

gcagggatcctcacacggcggtgacga27

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>RNAi载体特异引物1

<400>7

caccctgacgcgtggtgttacttctgaagagg32

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>RNAi载体特异引物2

<400>8

actagaactgcagcctcagatctaccatggtcg33

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>T1接头正向引物

<400>9

gccagcatcgatggctcggggaag24

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>T1接头反向引物

<400>10

aaaccttccccgagccatcgatgc24

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>T2接头正向引物

<400>11

gccgagtactcctatgatttaccg24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>T2接头反向引物

<400>12

aaaccggtaaatcataggagtact24

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>U-F/接头反向引物

<400>13

ctccgttttacctgtggaatcg22

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>接头正向引物/gRNA-R

<400>14

cggaggaaaattccatccac20

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>PT1-F引物

<400>15

ttcagaggtctctctcgactagtggaatcggcagcaaagg40

<210>16

<211>37

<212>DNA

<213>PT1-R引物

<400>16

agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc37

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>PT2L-F引物

<400>17

ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg38

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>PT2L-R引物

<400>18

agcgtgggtctcgaccgacgcgtccatccactccaagctc40

Claims (10)

1.基因miR408在培育高产水稻中的应用，其特征在于，所述基因miR408的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，应用的方法是在水稻中过表达基因miR408制备高产水稻。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，在水稻中过表达基因miR408制备高产水稻的方法如下：

S1.构建MiR408组成型表达质粒

S11.在载体pCAMBIA1390的酶切位点HindIII和SalI之间插入CaMV35S启动子；

S12.以野生型水稻总RNA为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示引物进行miR408基因的克隆，在扩增产物两端加上EcoRI和BglII的酶切位点；

S13.利用EcoRI和BglII双酶切步骤S11和S12的产物，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来，即构建成miR408组成型表达质粒；

S2.MiR408组成型表达质粒转化水稻愈伤组织；

S3.水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，得到过表达miR408的转基因水稻。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，步骤S2所述MiR408组成型表达质粒转化水稻愈伤组织的方法如下：

S21.将MiR408组成型表达质粒转化根癌农杆菌；

S22.利用利福平和卡那霉素筛选培养根癌农杆菌菌种，再刮取菌体悬浮于含有100μM乙酰丁香酮的AAM液体共培养基中，使之稀释至OD550为0.25～0.35，28℃摇床140rpm培养40min，得到根癌农杆菌浸染液；

S23.用水稻的成熟种子诱导出培养愈伤组织；

S24.将S22制备好的根癌农杆菌侵染液侵染愈伤组织，然后把愈伤组织接到共培养基上26℃黑暗培养2～3天。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，步骤S3所述转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化的方法如下：

S31.取出权利要求4步骤S24共培养后的愈伤组织，分别利用筛选培养基、预分化培养基和分化培养基进行依次培养，使愈伤组织进行再生分化出小苗；

S33.待小苗长到4～6cm时，将其转到生根培养基上，继续培养至小苗长10～12cm、叶片宽大、颜色深绿且根系生长健全后，洗掉培养基及其基部附着的愈伤组织，在室外进行种植，即得到过表达miR408的转基因水稻。

6.UCL基因在培育高产水稻中的应用，其特征在于，所述基因UCL的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，应用的方法是沉默水稻中UCL基因的表达制备高产水稻。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，沉默水稻中UCL基因的表达的方法是利用RNA干涉或CRISPR敲除的方法沉默水稻中UCL基因的表达。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述RNA干涉的方法步骤如下：

S1.构建UCL-RNA干涉表达质粒

S11.利用pCAMBIA1305.2、pUC18-Pubi和pZEro-T改造得到RNA干涉载体；

S12.以野生型水稻总RNA为模板，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示引物克隆UCL基因，并且在扩增产物两端加上HimdIII和BamhI的酶切位点；

S13.利用HimdIII和BamhI双酶切步骤S11和S12的产物，然后将两个双酶切产物用T4连接酶连接起来，即构建得到中间重组质粒；

S14.用两端加有MluI和PstI酶切位点的RNAi载体特异引物扩增中间重组质粒，再经MluI和PstI双酶切后克隆到同样酶酶切的中间重组质粒中，构建得到UCL-RNA干涉质粒；

S2.UCL-RNA干涉表达质粒转化水稻愈伤组织；

S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，得到UCL-RNA干涉水稻突变株；

其中，所述RNAi载体特异引物的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。

10.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述CRISPR敲除的方法步骤如下：

S1.构建UCL-CRISPR敲除质粒

S11.确定miR408靶基因UCL的两个打靶位点T1和T2，在T1接头正向引物5’端加上GCCA四个碱基，在T2接头正向引物5’端加上GCCG四个碱基，T1接头反向引物和T2接头反向引物的5’端均加上AAAC四个碱基；

S12.将每个靶点的正反向接头引物进行退火形成双链，然后分别连接到BsaI酶切后的pYLsgRNA-OsU3和pYLsgRNA-OsU6质粒片段上，产生两个sgRNA表达盒；

sgRNA表达盒经两轮巢式PCR反应扩增，第一轮分别用U-F/接头反向引物和接头正向引物/gRNA-R分两个反应进行，第二轮用位置特异引物PT1-F/PT1-R和PT2L-F/PT2L-R分别扩增T1和T2sgRNA表达盒；

S13.对两个sgRNA表达盒的扩增产物进行纯化，并进行BsaI酶切，然后用T4连接酶将酶切产物与相同酶切的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体连接起来，即构建成靶向UCL基因的两个位点的UCL-CRISPR敲除质粒；

S2.UCL-CRISPR敲除质粒转化水稻愈伤组织，方法同上；

S3.转基因水稻阳性愈伤组织的筛选与分化，方法同上，得到UCL-CRISPR的水稻突变株；

其中，所述T1接头正向引物、T1接头反向引物、T2接头正向引物、T2接头反向引物分别如SEQIDNO.9~12所示；

所述U-F/接头反向引物和接头正向引物/gRNA-R分别如SEQIDNO.13~14所示；

所述引物PT1-F和PT1-R，PT2L-F和PT2L-R分别如SEQIDNO.15～18所示。