CN117652304B - 蓝光及MiBBX7基因在提升芒果果实品质中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蓝光及MiBBX7基因在提升芒果果实品质中的应用，蓝光处理能够促进芒果外观品质和内在品质的提升。MiBBX7基因是芒果中响应蓝光信号的基因，通过兼并性引物将其克隆，利用强启动子驱动原理的转基因技术，将基因的超量表达载体转入拟南芥中，获得转基因拟南芥，发现过量表达（Overexpression,OE）MiBBX7基因能够促进拟南芥种子下胚轴花青苷的积累。同时，将基因的超量表达载体转入芒果果实中，发现过量表达MiBBX7基因能够促进芒果果肉类胡萝卜素积累，并促进芒果果实中MiPSY等类胡萝卜素生物合成相关基因的表达，这对利用光照提升芒果果实品质的技术开发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蓝光及MiBBX7基因在提升芒果果实品质中的应用。
背景技术
杧果（Mangifera indica L.）俗称芒果，是漆树科（Anacardiaceae）杧果属（Mangifera L.）植物，也是重要的热带果树，属于我国热带地区农业经济的支撑产业之一。芒果是常绿大乔木，树冠较大且生长能力旺盛，在果园实际生产中常出现树冠郁闭，树体内膛光照不足、通风较差的情况，导致外围果与内膛果品质出现差异，影响着果实的商品价值。
光是植物光合作用的能量来源，为植物生长发育提供物质基础。同时光作为一种环境信号，在植物整个生命周期不同阶段发挥着调控作用。蓝光处理可以促进梨、苹果果皮花青苷的积累。BBX蛋白是一组锌指蛋白，参与调节植物中各种光调控的发育和生理过程。已有研究证明，部分BBX家族成员在调控果实花青苷和类胡萝卜素生物合成和积累过程中发挥作用。目前，尚未有关蓝光在提升芒果品质的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种蓝光及MiBBX7基因在提升芒果果实品质中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种蓝光在提升芒果果实品质中的应用。
进一步地，具体为：
在芒果种植园中进行田间补光，促进芒果，特别是内膛果果肉类胡萝卜素积累，使果实品质的提升。
进一步地，所述蓝光波长为453.2nm，光照强度为110µmol/m2/s。
一种MiBBX7基因在提升芒果果实品质中的应用， MiBBX7基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；MiBBX7基因能响应蓝光光照处理，从而促进芒果果实品质的提升。
进一步地，具体为：在芒果果肉中，利用农杆菌介导的瞬时转化对MiBBX7基因进行超表达，促进芒果果肉类胡萝卜素积累，从而提升芒果果实品质。
进一步地，所述在芒果果肉中，利用农杆菌介导的瞬时转化对MiBBX7基因进行超表达具体为：将含MiBBX7基因过表达质粒的GV3101农杆菌侵染液注射于芒果果实中，使MiBBX7基因超表达。
进一步地，所述MiBBX7基因过表达质粒的载体为pCambia1301过表达载体。
进一步地，MiBBX7基因PCR扩增采用的引物如下：
MiBBX7-F（SEQ ID NO.5）：
agaacacgggggactcttgacATGGAGAAAATTTGTGAATTCTG
MiBBX7-R（SEQ ID NO.6）：
ggggaaattcgagctggtcacGGCTGTATCCAAATCATAG
一种MiBBX7基因在促进拟南芥种子下胚轴花青苷积累中的应用，MiBBX7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，在拟南芥中，利用强启动子花椰菜花叶病毒启动子（35s）驱动原理的转基因技术，将MiBBX7基因的超量表达载体转入拟南芥中，从而获得MiBBX7拟南芥转基因植株。实验证明转基因拟南芥幼苗下胚轴积累的花青苷含量更高。具体为：
将拟南芥花序浸到含MiBBX7基因过表达质粒的农杆菌侵染液中进行转染，将转染成功的拟南芥连续代筛选得到代纯合体，收取获得转基因拟南芥种子。
更进一步地，将拟南芥花序浸到含MiBBX7基因过表达的GV3101农杆菌侵染液中进行转染，将转染成功的拟南芥连续代筛选得到代纯合体，收取获得转基因拟南芥种子。
本发明提供了蓝光在促进芒果果实品质提升中的应用，同时通过植物基因工程技术，从芒果果实中克隆出蓝光响应的MiBBX7基因完整编码区段，并验证了该基因的功能，发现超量表达MiBBX7基因后，拟南芥幼苗下胚轴积累的花青苷含量更高。拟南芥中过表达MiBBX7促进了拟南芥幼苗下胚轴花青苷积累。芒果果肉中瞬时过表达MiBBX7可以促进类胡萝卜素合成相关基因（MiPSY、MiPDS和MiZDS）表达，从而促进芒果果肉中类胡萝卜素积累。研究探索MiBBX7基因在芒果果实花青苷和类胡萝卜素生物合成和积累中的作用，并将其应用于芒果栽培中，得到一种更简洁、更高效的促进芒果果实品质提升的方法，在果实品质研究领域中具有现实意义。
附图说明
图1为黑暗对照组和蓝光光照处理实验组的芒果果实表型和芒果果皮和果肉中MiBBX7基因的表达量结果图，图1中的A为黑暗对照组（Dark）和蓝光光照处理实验组（Bluelight）的芒果果实表型图，图1中的B为黑暗对照组和蓝光光照处理实验组的芒果果皮的MiBBX7基因表达量统计图；图1中的C为黑暗对照组和蓝光光照处理实验组的芒果果肉的MiBBX7基因表达量统计图；
图2为芒果果实PCR扩增产物电泳图谱；
图3为异位表达MiBBX7的拟南芥种子OE#1、OE#2和OE#4及空白对照WT的基因表达及花青苷含量结果图；其中图3中的A为qRT-PCR检测的异位表达MiBBX7的拟南芥种子OE#1、OE#2和OE#4及空白对照WT的MiBBX7基因的表达量柱状图，图3中的B为异位表达MiBBX7的拟南芥种子OE#1、OE#2和OE#4及空白对照WT的花青苷含量的柱形图，图中WT表示空白对照，是空载体；
图4为异位表达MiBBX7基因对拟南芥下胚轴花青苷积累的影响结果图；其中图4中的A为异位表达MiBBX7的拟南芥种子OE#1、OE#2和OE#4及空白对照WT的照片；图4中的B为异位表达MiBBX7的拟南芥种子OE#1、OE#2和OE#4及空白对照WT中拟南芥花青苷合成通路结构基因表达量的柱形图；
图5为对照组Empty vector和转基因组MiBBX7-OE芒果果肉中的基因表达及类胡萝卜素含量结果图；其中图5中的A为qRT-PCR检测的对照组Empty vector和转基因组MiBBX7-OE芒果果肉中MiBBX7基因的表达量柱状图，图5中的B为对照组Empty vector和转基因组MiBBX7-OE芒果果肉中中类胡萝卜素含量的柱状图；
图6为对照组Empty vector和转基因组MiBBX7-OE芒果果肉中类胡萝卜素合成通路相关基因表达量柱形图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、蓝光处理影响芒果内在和外在品质
在‘贵妃’芒果盛花期后40天选择400个幼果进行套袋，在花后100天，即果实成熟期采收套袋芒果果实，以不摘袋的形式运回实验室，从中挑选大小基本一致、无损伤的果实200个作为试验用果。将果实转移至人工气候室培养架上均分为两组：黑暗对照组和蓝光光照处理实验组；其中蓝光光照处理实验组的果实进行蓝光光照处理。蓝光光照处理所使用的光照条件为：LED蓝光(453.2nm，110µmol/m2/s)。相对湿度为70 ± 5 %，温度为17℃。黑暗对照组的果实放置在黑暗中，相对湿度和温度同蓝光光照处理实验组。持续培养6天后观察两组果实的果皮和果肉表型。由图1中的A可知，蓝光处理后的果实与黑暗对照组相比，芒果果皮和果肉都表现出差异，与黑暗相比，蓝光处理144h后，果皮红色更加明显，蓝光处理72h后，果肉黄色更加明显，果实品质更好。
二、芒果果实RNA提取及反转录
1、植物组织总RNA采用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根）提取，步骤包括：
(1)匀浆：分别取两组各100 mg芒果皮或果肉在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μL SL（含5 vol%的β-巯基乙醇），立即涡旋震荡剧烈混匀；
(2)将步骤（1）混匀后的溶液于12000 rpm离心2 min；
(3)将步骤（2）离心后的上清液转移至装有收集管的CS滤柱上，12000 rpm离心2min，将收集管中的上清液转移至新的RNase-Free离心管中，在转移过程中尽量避免吸头吸入沉淀及细胞碎片；
(4)继续在RNase-Free离心管中缓慢加入上清0.4倍体积的无水乙醇，混匀后，将得到的溶液与步骤（3）离心后的沉淀一起转入CR3吸附柱中，12000 rpm离心15 s，丢弃收集管内废液，将CR3吸附柱放回收集管中；
(5)向CR3吸附柱中加入RW1去蛋白液350 μL，12000 rpm离心15 s，丢弃收集管中的废液，将CR3吸附柱放回收集管中；
(6)配制DNaseI工作液：取DNaseI储存液10 μL放入新的RNase-Free离心管中，加入RDD溶液70 μL，缓缓混匀；
(7)向CR3吸附柱中央加入DNaseI工作液80 μL，室温放置15 min；
(8)向CR3吸附柱中加入去蛋白液RW 1350 μL，12000 rpm离心15 s，丢弃收集管中的废液，将CR3吸附柱放回至收集管中；
(9)向CR3吸附柱中加入含乙醇的漂洗液RW500 μL，12000 rpm离心15 s，丢弃收集管中的废液，将CR3吸附柱放回收集管中；
(10)重复步骤（9）；
(11) 12000 rpm离心2 min，取新的RNase-Free离心管，将CR3吸附柱放入其中，悬空滴加30-50 μL ddH2O（RNase-Free）至吸附膜的中间，室温放置2 min，12000 rpm离心1min，离心所得即为提取的RNA溶液。
2、反转录cDNA第一条链的合成
使用宝日医生物技术有限公司（北京，Takara中国）的PrimeScript™ II 1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒进行，具体如下：
(1)配制如表1所示的RNA变性体系
(1)配制如表1所示的RNA变性体系
表1 RNA变性体系
(2)将RNA变性体系轻轻混匀，65 ℃孵育5 min之后迅速冰浴；
(3)在Microtube管中配制表2所示的反转录反应液，总量为20 µL；
表2反转录反应液
(4)将步骤（3）反转录反应液缓慢混匀按下列条件进行反转录反应：42 ℃ 30min，然后在95 ℃ 加热5 min，使酶失活后立即冰浴。
三、蓝光光照处理促进MiBBX7基因表达
对蓝光光照处理实验组及黑暗对照组的芒果果皮和果肉使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，利用宝生物TB Green™ Fast qPCR Mix染料，检测MiBBX7基因的表达水平，引物如下：
PCR 正向引物（SEQ ID NO.3）：AATACACTGTCCAAGCGGCA
PCR 反向引物（SEQ ID NO.4）：GGGCATCCCATGTAACTGCT
反应体系及实验步骤如下：
在冰上配制如表3所示的PCR反应液：
表3 PCR反应液
在CFX96定量PCR仪上采用两步法进行PCR反应，反应条件如下：预变性：95℃ 30s，然后变性：95℃ 5 s，退火：60℃ 30 s，共40个循环，最后进行溶解曲线的绘制；
基因的表达量的计算：采用方法。
结果如图1中的B和图1中的C所示，与黑暗对照组相比，MiBBX7的基因表达水平在蓝光光照处理实验组的芒果果皮和果肉中显著升高，表明光信号转导转录因子MiBBX7 能够被蓝光诱导表达。
实施例2：芒果MiBBX7基因的克隆
一、cDNA全长序列获得
使用赛默飞世尔科技（中国）有限公司的Phusion DNA 聚合酶对MiBBX7基因进行PCR扩增，引物序列如下：
MiBBX7-F（SEQ ID NO.5）：
agaacacgggggactcttgacATGGAGAAAATTTGTGAATTCTG
MiBBX7-R（SEQ ID NO.6）：
ggggaaattcgagctggtcacGGCTGTATCCAAATCATAG
PCR扩增反应体系及步骤如下：
(1) 配制如表4所示的反应液（冰浴）：
表4 反应液
(2)PCR反应，反应条件为：98℃预变性30 s；98℃变性10 s；60℃退火30 s；72℃延伸1 min；变性、退火及延伸共进行34个循环；最后72 ℃终延伸10 min；
(3) 用1wt%琼脂糖凝胶对PCR结果进行凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示，获得了1536 bp大小的MiBBX7基因片段。
(4)琼脂糖凝胶电泳产物回收，采用天根生化科技（北京）有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行琼脂糖凝胶电泳产物的回收得到MiBBX7片段，操作步骤按说明书进行。
实施例3：芒果MiBBX7基因的拟南芥异位过量表达
一、MiBBX7基因表达载体的构建
为研究MiBBX7基因的功能，将实施例2克隆获得的包含有MiBBX7基因编码区在内的共1536 bp片段正确插入pCambia-1301表达载体上。具体地，首先，使用赛默飞世尔科技（中国）有限公司的FastDigest内切酶Nco I和BstE II酶切pCambia-1301表达载体质粒，酶切反应体系如表5所示。
表5酶切反应体系
在37℃下酶切20min，对酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察后切胶回收得到酶切后的pCambia-1301表达载体。
然后，将实施例2得到的MiBBX7片段与酶切后的pCambia-1301表达载体连接，在37℃，采用ClonExpress II一步克隆试剂盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit购自Vazyme公司）连接30 min，连接反应体系如表6所示。
表6 连接反应体系
再将连接产物转化DH5α，菌落PCR筛选阳性单克隆菌落，PCR反应条件为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；变性、退火及延伸共进行34个循环；最终72 ℃终延伸10 min；于青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，将测序正确的阳性单克隆菌落扩大培养，提取质粒即获得MiBBX7基因表达载体（MiBBX7-OE）；将MiBBX7基因表达载体及pCambia-1301空载体（WT）转入到农杆菌GV3101，-80 ℃保存备用。
二、异位表达MiBBX7的拟南芥的获得
1、对野生型拟南芥种子分别用70vol%酒精消毒3 min，4wt%次氯酸钠消毒8-10min（期间多次摇晃），再用灭菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干后将种子直接铺于种子萌发培养基表面上播种，然后在25-28 ℃，16 h长日照或8 h短日照10 天光培养至小苗长出，移栽到基质培养直至开花。
2、分别挑取步骤一中含MiBBX7基因表达载体、pCambia-1301空载体的农杆菌单克隆菌落接种于10 mL含 50 mg·L-1潮霉素的液体培养基中，在28 ℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.6-0.8（约48 h）；再取其中1 mL菌液加入20 mL YEP液体培养基内，28℃、200 rpm震荡培养至OD600为0.6-0.8（约5 h）然后离心收集菌体，用含0.05 g·mL-1蔗糖、体积比0.03-0.05 % 的Silweet悬浮稀释20倍获得含质粒的侵染液。
3、将拟南芥花序浸到含质粒的侵染液中15-20 s，收集果荚，25 mg·mL-1潮霉素抗性筛选，qRT-PCR检测得到阳性转基因拟南芥植株。阳性转基因植株经过连续代筛选3代得到代纯合体，收取种子，进行表型分析。经统计，异位表达MiBBX7的拟南芥种子OE#1、OE#2和OE#4中，MiBBX7基因表达量和花青苷含量显著高于空白对照，如图3所示。
4、对得到的异位表达MiBBX7的拟南芥种子和空白对照的种子进行培养，选取健康生长5 天的空白对照的拟南芥和MiBBX7异位表达的拟南芥苗，置于体式镜下，观察并提取拟南芥下胚轴花青苷。如图4中的A所示，结果发现与空白对照相比，MiBBX7异位表达的拟南芥幼苗下胚轴有明显的花青苷积累，如图4中B所示，与空白对照相比，MiBBX7异位表达的拟南芥中与花青苷合成相关的关键基因大多都显著上调，说明MiBBX7的过表达可能提高了拟南芥花青苷含量。
实施例4：芒果MiBBX7基因在芒果果实中的瞬时过量表达
一、MiBBX7基因的pCambia-1301表达载体的构建
为研究MiBBX7基因的功能，将实施例2克隆获得的包含有MiBBX7基因编码区在内的共1536 bp片段正确插入pCambia-1301载体上。pCambia-1301载体使用内切酶Nco I和BstE II酶切，基因扩增引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
经基因扩增、载体酶切、一步连接、转化大肠杆菌DH5α和阳性克隆筛选后，于杭州尚亚生物技术有限公司进行测序，将测序正确阳性单克隆菌落和pCambia-1301空载体（对照组）分别转入农杆菌GV3101，-80 ℃保存备用。
二、MiBBX7过量表达芒果果肉的获得
在‘贵妃’芒果盛花期后40天选择400个幼果进行套袋，在花后100天，即果实成熟期采收套袋芒果果实，以不摘袋的形式运回实验室，从中挑选大小基本一致、无损伤的果实200个作为试验用果并设置两组。分别挑取含有MiBBX7质粒、pCambia-1301空载体的GV3101农杆菌进行培养和收集，最终获得OD=0.8的侵染液。使用1 ml注射器将含有MiBBX7质粒、pCambia-1301空载体的侵染液分别注射到两组芒果肉中，将注射后的芒果果实转移到人工气候室，17 ℃暗培养1天，光照培养3天。之后，将芒果果实拍照并提取RNA进行检测。其中转入含pCambia-1301空载体的侵染液为对照组Empty vector，转入含MiBBX7质粒为转基因组MiBBX7-OE，每组果实数量不少于50个。
提取对照组Empty vector和转基因组MiBBX7-OE的芒果果肉总RNA，使用Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪，利用宝生物TB Green™ Fast qPCR Mix染料，检测MiBBX7基因在对照组Empty vector和转基因组MiBBX7-OE的芒果果肉中的表达量，qPCR-MiBBX7引物如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示，结果如图5中的A所示，与对照组Empty vector相比，MiBBX7的转录水平在转基因组MiBBX7-OE的芒果果肉中显著升高，表明成功在芒果果肉中瞬时过量表达了MiBBX7。
三、瞬时超表达芒果果肉的类胡萝卜素含量分析
测定了对照组Empty vector和转基因组MiBBX7-OE的芒果果肉的类胡萝卜素含量，如图5中的B所示，瞬时侵染芒果果肉后发现转基因组MiBBX7-OE芒果果肉的类胡萝卜素含量显著高于对照组Empty vector。且如图6所示，转基因组MiBBX7-OE的芒果果肉中类胡萝卜素合成通路相关基因表达量明显高于对照组，表明MiBBX7基因促进芒果果肉中类胡萝卜素的合成和积累。
综上，蓝光能够促进芒果果实内外品质的提升，并从芒果中分离到了一个响应蓝光的MiBBX7基因，通过芒果果肉中转基因功能验证分析发现，MiBBX7在促进拟南芥下胚轴花青苷积累以及芒果果肉类胡萝卜素积累方面具有显著效果，对解决由树冠郁闭导致的树体内膛光照不足情况，提升芒果果实品质的技术开发具有重要意义。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一种MiBBX7基因在提升芒果果实品质中的应用，其特征在于，MiBBX7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；应用具体为：
在芒果果肉中，对MiBBX7基因进行超表达，促进芒果果肉类胡萝卜素积累，提升芒果果实品质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在芒果果肉中，对MiBBX7基因进行超表达，具体为：将含MiBBX7基因过表达质粒的GV3101农杆菌经侵染液重悬后注射于芒果果肉中，使MiBBX7基因超表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述MiBBX7基因过表达质粒的载体为pCambia1301过表达载体。
4. 一种MiBBX7基因在促进拟南芥幼苗下胚轴花青苷的应用，其特征在于，MiBBX7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；应用具体为：
将拟南芥花序浸到含MiBBX7基因过表达的GV3101农杆菌侵染液中进行转染，将转染成功的拟南芥连续代筛选得到代纯合体，收取获得转基因拟南芥种子，所述转基因拟南芥种子下胚轴积累花青苷。
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