CN112342220A

CN112342220A - 水稻糖转运基因OsMST1及其糖转运体、应用和扩增引物

Info

Publication number: CN112342220A
Application number: CN202011371727.2A
Authority: CN
Inventors: 张振华; 刘冬; 罗劲松
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112342220B

Abstract

本发明公开了一种水稻糖转运基因OsMST1和该水稻糖转运基因OsMST1编码得到的糖转运体，该水稻糖转运基因OsMST1在水稻中过量表达可显著增加水稻单株产量，小区产量增加15‑16％，突变/敲除后可显著降低水稻的结实率和产量，小区产量减少20‑22％；通过影响光合产物的运输与分配，进而对水稻的产量造成影响，对育性没有产生影响；为通过品种遗传改良增强光合产物运输与分配能力，持续提高水稻单产提供现实依据。本发明还公开了该水稻糖转运基因OsMST1和其糖转运体在培育高产量作物中的应用，能够快速、有效提高作物的产量。本发明还公开了几种水稻糖转运基因OsMST1的PCR扩增引物，可以有效、快捷地把基因OsMST1从水稻的cDNA中扩增出来。

Description

水稻糖转运基因OsMST1及其糖转运体、应用和扩增引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻糖转运基因OsMST1及其糖转运体、应用和扩增引物。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的第一大粮食作物。其播种面积约占我国粮食作物播种面积28％，稻谷产量占我国粮食总产量的40％以上，全国约有60％的人口以稻米为主食(程式华，2005)。面对人口膨胀、耕地锐减、资源紧缺等多重压力，我国水稻生产形势严峻。据官方预计，到2030年我国人口基数将达16亿，按人均每年公斤谷物的基本温饱需求计算，粮食总产必须达到6.4亿多吨；而目前我国粮食产量仅为5亿吨，尚存在1.4～1.8亿吨的巨大缺口(顾铭洪，2010)。因此，持续提高水稻单产仍然是水稻遗传育种的首要方向。

继矮化育种和杂种优势利用相继促成水稻单产的第一次和第二次飞跃后，如何进一步提高产量成为了水稻超高产育种研究的重要课题。1959年黄耀祥等将水稻矮化育种成功，使水稻的耐肥抗倒性大为加强，水稻产量由当时的亩产150-250公斤迅速提高到亩产350-400公斤，实现了水稻产量的第一次大飞跃，为中国用世界约7％的土地，养活世界1/4的人口发挥了重大作用，在世界农业发展史上被誉为“第一次绿色革命”。杂交水稻在我国的成功推广，为维护我国的粮食安全做出了突出贡献。但目前部分大穗型水稻品种，特别是一些亚种间大穗、大粒型杂交稻存在好粒充实度不高、基部结实较差的问题，严重制约了其产量潜力的进一步发挥(董习华等，2007)。杂种优势的利用以及水稻形态改良己大幅提高了水稻的光合效率，大糖型、重穗型品种也大幅增加了水稻库容。

目前“源”和“库”己不是水稻高产的主要限制因子，源到库的运输不畅才是水稻生产上籽粒灌浆不足以及空秕率高的主要原因。因此，通过品种遗传改良增强光合产物运输与分配能力，持续提高水稻单产是解决这一问题的有效途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种水稻糖转运基因OsMST1及其糖转运体、应用和扩增引物。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种水稻糖转运基因OsMST1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种由上述的水稻糖转运基因OsMST1编码得到的糖转运体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的水稻糖转运基因OsMST1或所述的糖转运体在培育高产量水稻中的应用。

上述的应用，优选的，其应用的方法包括如下步骤：将所述水稻糖转运基因OsMST1通过PCR法扩增，然后通过同源重组的方法克隆至表达载体中，得到含有基因OsMST1的目标载体，再将所述目标载体通过热击转化法转入农杆菌中，最终通过遗传转化克隆至水稻中进行表达，得到含有所述水稻糖转运基因OsMST1的过表达株系，即为高产量水稻；也可以得到用于组织定位的GUS材料，过表达株系还可以用于进一步探究基因功能。

优选的，所述表达载体为P1300；所述PCR法扩增采用的扩增引物为OE::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

基于一个总的发明构思，本发明还提供以下PCR法扩增水稻糖转运基因OsMST1所采用的扩增引物：

第一对扩增引物为G::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。该扩增引物G::OsMST1用于扩增水稻糖转运基因OsMST1的CDS序列，适合用于建立基因表达模式的应用。

第二对扩增引物为OE::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。该扩增引物OE::OsMST1用于扩增水稻糖转运基因OsMST1的CDS序列，适合用于转化过表达材料OE::OsMST1的应用。

第三对扩增引物为GUS::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示。该扩增引物GUS::OsMST1用于扩增水稻糖转运基因OsMST1的启动子序列，适合用于转化组织表达材料GUS::OsMST1的应用。

第四对扩增引物为Y::OsMST1，其正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO：9和SEQID NO：10所示。该扩增引物Y::OsMST1用于扩增水稻糖转运基因OsMST1的CDS序列，适合用于糖转运体OsMST1的酵母吸收实验。

本发明通过CRISPRE-CAS9技术，植物分子遗传和生理生化方法，发现了一种水稻糖转运基因OsMST1，其编码得到的糖转运体，预测为单糖转运体，该糖转运体主要在水稻节点实现功能，不同于以往的研究，可用于提高水稻的产量，通过植物分子遗传和生理生化等方法将该水稻糖转运基因OsMST1敲除，使其失去功能，导致结实率和单株产量显著下降。将这种水稻糖转运基因OsMST1过量表达，从而增强水稻结实率和单株产量显著增加，为通过生物技术的手段进一步提高水稻的单产提供了优异的基因资源。在调控糖的运输、提高水稻结实率、提高水稻单株产量中具有很好的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的水稻糖转运基因OsMST1，在水稻中过量表达可显著增加水稻单株产量，突变/敲除后可显著降低水稻的结实率和产量；通过影响光合产物的运输与分配，进而对水稻的产量造成影响，对育性没有产生影响；为通过品种遗传改良增强光合产物运输与分配能力，持续提高水稻单产提供现实依据。

2、本发明还提供了该水稻糖转运基因OsMST1和其糖转运体在培育高产量水稻中的应用，能够快速、有效提高水稻的产量。

3、本发明还提供了几种水稻糖转运基因OsMST1的PCR扩增引物，可以有效、快捷地把基因OsMST1从水稻的cDNA中扩增出来。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中得到的OsMST1的时空表达模式结果；

图2是实施例1中得到的OsMST1的组织定位结果(其中，a.h.i.j：节点，b.d：叶鞘，c.e.m.n：茎，f.g.k.l：叶片)；

图3是实施例1中得到的OsMST1的亚细胞定位结果；

图4是实施例2中得到的OsMST1的不同突变类型结果；

图5是实施例2中得到的灌浆期各材料的可溶性糖对比结果；

图6是实施例2中得到的灌浆期各材料的淀粉含量对比结果；

图7是实施例2中得到的¹³C同位素标记的结果；

图8和图9是实施例2中得到的成熟期表型结果；

图10-图13是实施例2中得到的成熟期性状分析结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种水稻糖转运基因OsMST1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码得到的糖转运体(以下称为“糖转运体OsMST1”)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该糖转运基因OsMST1及糖转运体OsMST1是通过CRISPRE-CAS9技术，以及植物分子遗传和生理生化方法，在水稻中发现的。经过研究，我们还发现其过量表达能显著增加水稻的单产，而其基因OsMST1的突变显著降低了水稻的结实率和单产，这为通过品种遗传改良增强光合产物运输与分配能力，持续提高水稻单产提供了现实依据。

为了验证本发明的糖转运基因OsMST1及其糖转运体OsMST1的功能，进行了如下实验：

1、本发明的糖转运基因OsMST1的时空表达模式

为了获得水稻糖转运基因OsMST1的表达模式，在水稻的不同生育期对各个部位取样进行RNA提取，其中每个样本设置三次重复。使用TRIzol提取总RNA，将总RNA(1μg)通过Hiscript II Q RT SuperMix试剂盒(Vazyme)合成第一链cDNA。采用qPCR预混液(Vazyme)系统(Analytik Jena AG)在ChanQTM SYBR在StepOnePlus仪器上进行实时荧光定量PCR分析。PCR扩增引物为G::OsMST1，其正向引物和反向引物分别为5'-AACACCGTCGAGGCAATCGG-3'(如SEQ ID NO：3所示)和5'-TCCCGTGTCCATTGTAGGTC-3'(如SEQ ID NO：4所示)。Action用作内部标准，带有引物5'-GGTCAACTTGTTGATTCCCCTCTT-3'(如SEQ ID NO：11所示)和5'-AACCGCAAAATCCAAAGAACG-3'(如SEQ ID NO：12所示)。

具体步骤如下：1.组织取样后投入液氮速冻中；在液氮中将组织研磨成粉，预冷1.5mL离心管加入样品0.1g，并加入1mL TRIzol，迅速混匀，室温下静置10分钟；2.向每管加入200μL三氯甲烷，剧烈震荡30秒，室温(25℃)静置5分钟；3.于4℃12000rpm离心10分钟，样品分相为三层，其中上层水相为RNA；4.小心吸取上清600μL转移至新离心管中，重复步骤2和步骤3以得到更纯的RNA；5.加入500μL的异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温(25℃)静置10分钟。4℃12000rpm离心10分钟，弃上清；6.每管加入1mL 75％乙醇，涡旋振荡；7.4℃12000rpm离心5分钟，弃上清；8.短暂离心后用20μL移液器小心吸弃残余75％乙醇；9.超净台上将RNA沉淀吹至半透明胶状，根据沉淀多少加30-40μL灭菌DEPC溶解RNA沉淀；10.55～60℃孵育10分钟；11.小心混匀样品，并短暂离心；12.RNA样品经核算分析仪测定浓度后保存于－80℃冰箱备用。

RNA质量检测和浓度测定：1.电泳检测RNA完整性：1％琼脂糖凝胶快速电泳，检测RNA分子完整性，观察18S、28S条带是否清晰；2.紫外分光光度计测定A260及A280来定量分析RNA的纯度和浓度；用溶解RNA的溶剂读取BLANK，NanoDrop测定RNA浓度；分离RNA的理想效果是A260/A280＝1.8～2.0。

总RNA根据反转录试剂盒

One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix合成cDNA第一链，每个样品一次反转cDNA终浓度都为1μg。cDNA存放－20℃保存备用。反转体系如下：Total RNA-，Oligo(dT)primer 1μL，2×Ts reaction mix10μL，Enzyme mix 1μL，gDNA remover 1μL，RNA-free water-。反应条件：42℃孵育15min，85℃，5s灭活，-20℃冰箱保存备用。

根据基因cDNA全长通过软件primer3+进行qPCR引物的设计，选择特异性好、碱基之间无互补的引物在擎科引物合成公司合成，得到扩增引物G::OsMST1。以水稻各时期的cDNA为模板，通过琼脂糖凝胶电泳检测引物特异性，反应体系如下：cDNA 1μL，G::OsMST1的正向引物(10μM)0.5μL，G::OsMST1的反向引物(10μM)0.5μL，2×Easy

supermix 12.5μL，ddH₂O 10.5μL。反应条件：94℃，2分钟；94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分钟；共34个循环，72℃，5分钟；4℃。

荧光定量PCR引物检测正确后，以反转录合成的c DNA第一链为模板，在

96实时荧光定量PCR仪上运用两步法进行定量，每个基因每个样品设置3个技术重复，反应体系如下：cDNA 1，正向引物(10μM)(如SEQ ID NO：11所示)0.3，反向引物(10μM)(如SEQID NO：12所示)0.3，

Top Green qPCR Supermix 7.5，ddH₂O 5.9。反应条件：(1)预变性阶段：94℃30s，94℃15s，60℃30s，40个循环；(2)溶解曲线阶段：60℃60s，97℃1s；(3)冷却阶段：40℃1min。

结果如图1所示，糖转运基因OsMST1在灌浆期的穗、节间、茎基部和根部表达量比较高。

2、本发明的糖转运基因OsMST1的定位

为了研究OsMST1表达的组织特异性，我们构建了携带ProOsMST1的转化载体。通过PCR扩增得到OsMST1的启动子(2.0kb)，扩增引物GUS::OsMST1的正向引物和反向引物分别为5'-CGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCTTAAATATAAGGGCAGGT-3'(HindIII网站斜体)(如SEQ IDNO：7所示)和5'-GACTGACCACCCGGGGATCCTCCCCCTCCTCGCTCCGTCT-3'(SalI网站以斜体显示)(如SEQ ID NO：8所示)。使用HindIII和Sal内切酶进行片段切割，扩增的片段被克隆到pCAMBIA1300载体中，产生ProOsMST1构建体。产生的构建体被转化进入根癌农杆菌EHA101菌株，然后引入野生根癌农杆菌介导的转化水稻类型(cv。TB309)。

具体步骤如下：以已测序完成的水稻数据库(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)中OsMST1的起始密码子ATG之前的2.0kp的序列为依据，设计OsMST1启动子的特异引物GUS::OsMST1，并加入HindⅢ和SalI两个酶切位点，以营养液培养的苗期水稻幼嫩叶片基因组DNA为模板，使用PrimeSTAR高保真聚合酶进行PCR扩增，其PCR反应体系如下：模板DNA 3μL(200ng/μL)，Buffer(5×)10μL，dNTP Mixture(2.5mM each)4μL，GUS::OsMST1的正向引物2.5μL，GUS::OsMST1的反向引物2.5μL，PrimeSTAR 0.5μL，ddH₂O，26.5μL。

依次加入以上成分，轻弹混匀，短暂离心。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2.5min，40个循环；72℃延伸10min。将OsMST1启动子的PCR扩增产物经电泳检测和凝胶回收试剂盒回收后，使用Hind Ⅲ和SalI双酶切表达载体p1300质粒和OsMST1 PCR扩增产物回收的片段，然后再进行凝胶电泳检测回收目的片段，将回收正确大小的两个目的片段进行16℃连接过夜后转入DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞内(连接体系：p1300质粒为4μL；proOsMST1 PCR扩增产物回收的片段4μL；T4ligase为1μL；10×T4Buffer为1μL)，此时所用的抗生素为卡那霉素，挑取阳性克隆进行菌液PCR检测后送测序，经测序鉴定无误后扩培菌液并抽取质粒，质粒命名为proOsMST1–p1300，并将质粒转化入农杆菌GV3101，抗生素为卡那霉素和利福平，菌液阳性鉴定无误后，加入甘油保存菌液于－80℃备用。将遗传转化得到的株系进行全生育期培养，取阳性植株加入已配置好的GUS染液中，保证样品各组织部位都完全浸到GUS染液，放入37℃恒温箱中用锡箔纸进行避光染色10h左右，待样品出现明显蓝色时，倒掉并回收染液，用70％的乙醇浸泡1h，再用80％的乙醇脱色1h，最后加入70％的乙醇浸泡直至样品完全脱色，将脱色后的样品保存于无水乙醇中。通过体视显微镜观察荧光发生部位。

由图2可知，在节、叶鞘、茎和叶片都观察到GUS荧光，具体的在节、茎和叶鞘以及侧叶脉的维管组织检测到的荧光比较强烈。

为了研究OsMST1表达的细胞特异性，我们又构建了携带OsMST1-GFP的转化载体。通过PCR扩增得到OsMST1的CDS序列，扩增引物OE::OsMST1的正向引物和反向引物分别为5'-CGGGGGACTCTAGAGGATCCATGGCCGGAGGTGTCATCGT-3'(HindIII网站斜体)(如SEQ ID NO：5所示)和5'-TCGGAGGAGGCCATACTAGTTCAGTACGTCCCGGTCGGTT-3'(SalI网站以斜体显示)(如SEQ ID NO：6所示)。使用HindIII和Sal内切酶进行片段切割，扩增的片段被克隆到pCAMBIA1300-GFP载体中，产生OsMST1-GFP构建体。产生的构建体被转化进入根癌农杆菌EHA101菌株，然后引入野生根癌农杆菌介导的转化水稻类型(cv。TB309)。

具体步骤如下：将获得的OsMST1-GFP质粒浓缩；因AXYGEN小提试剂盒提取的质粒浓度不足以达到原生质体转化所需，为了达到较高的转化效率，在转化原生质体前对质粒浓缩。

浓缩步骤如下：(1)将所有同名称基因的质粒混到一管，保证质粒浓缩后浓度≥1μg；(2)用封口膜将离心管封口，在管盖上用针头戳2个孔；(3)将盛有质粒的离心管放进漂浮板，连带漂浮板一起放进－80℃冻存降温；(4)开启冷冻干燥机，将漂浮板连带带有质粒的离心管放进冷冻干燥机抽干；(5)加ddH₂O调浓度≥1μg，－20℃保存备用。

水稻原生质体的制备：(1)选取15株水稻黄花苗，用一次刀片切成细条，越细越好；(2)放入装有10mL酶解液的培养皿中，抽真空30min，黑暗处理放入温室，22℃，3-4h；(3)取出培养皿加10mL W5摇5min；(4)将溶液过滤到有机玻璃管中，滤液分成2管，放入冰上；(5)200×g，1min，4℃，弃上清，沿壁轻轻加1mL W5，轻轻重悬原生质体至底部无沉淀；(6)冰上静置孵育40min；(7)去上清，加2mL W5轻轻混匀，加入等体积的0.01％二乙酸荧光素FDA染色剂；(8)黄色枪头的头剪掉，吸取12μL混匀样轻轻打入血球计数板并放置显微计数；(9)剩余原生质体冰上孵育40min后弃上清。

PEG介导的原生质体转化：根据原生质体的浓度估算出原生质体个数，加入MMG使原生质体终浓度大约为2×105个/ml；在1.5ml圆底离心管配置如下反应液：150μL原生质体：15μg，GFP空白载体(1.0μg/μL)，均匀混合；然后加入165μL的PEG转化液，轻缓地上下颠倒几次，促使PEG和原生质体融合，室温静置5min，加入1ml的W5，终止反应；200g离心5min，去掉上清液，用200μL的W1使原生质体重悬浮，22℃黑暗条件下培养过夜；野生型水稻和携带转基因株系共聚焦显微镜进行观察，通过共聚焦激光扫描显微镜观察到了GFP荧光，结果如图3所示，初步观察糖转运基因OsMST1定位于液泡膜上。

3、本发明的糖转运基因OsMST1在酵母吸收实验中的功能分析

为了研究OsMST1特异性研究底物，采用PCR扩增的方法利用引物Y::OsMST1，正向引物序列为5'-TTGGTACCGAGCTCGGATCCATGGCCGGAGGTGTCATCGT-3'(如SEQ ID NO：9所示)，反向引物序列为5'-GATGGATATCTGCAGAATTCTCAGTACGTCCCGGTCGGTT-3'(如SEQ ID NO：10所示)，把基因OsMST1从水稻的cDNA中扩增出来，然后通过同源重组的方法克隆至酵母(Yeast)表达载体PDR196中，得到含有基因OsMST1的目标载体，同时设置一个空载体对照组EV(不含OsMST1)。我们利用PEG/醋酸锂的方法把空载体和含有基因OsMST1的目标载体转化至酵母突变菌株EBY.VW4000中进行异源过表达。

具体如下：1)将待转化的酵母菌种在完全营养型培养基(YPD培养基：20g/L胰化蛋白胨，10g/L酵母抽提物，20g/L D-葡萄糖，固体培养基添加20g/L琼脂，高压灭菌待用)平板上划线活化；2)挑取单克隆接种于5mL完全营养型培养基中，28℃-30℃培养至OD600＝1.0；3)取0.5ml菌液，12000g，离心30秒，倒去上清(底部还剩约100μl培养基)；4)加入1μl鲑鱼精DNA，混匀；加入1μg目的质粒DNA，混匀；再加入500μl酵母转化缓冲液，混匀，室温静置8-10小时；5)取管底20-50μl菌体悬液，涂布于选择平板(根据需要添加氨基酸)，28-30℃，静置培养，即得到含有本发明的糖转运体OsMST1的酵母。

酵母转化缓冲液：将90ml 45％的PEG4000、10ml 1M的醋酸锂、1ml 1M的Tris-Hcl(pH7.5)、0.2ml 0.5M的EDTA混合所得。参考文献为Elble R.(1992)A simple andefficient procedure for transformation ofyeasts.Biotechniques.13,18–20，然后用酵母打点实验在不同糖为底物的SD平板上鉴定表型。

SD配方：6.7g/L Bacto-yeast nitrogen base without amino acids(BD,Difco)，20g/L D-半乳糖，L-腺嘌呤50mg/L，L-组氨酸100mg/L，L-亮氨酸250mg/L，L-色氨酸100mg/L，MES 50mM，使用NaOH调节pH为5.5，固体培养基添加20g/L琼脂，高压灭菌待用。

综上所述，该糖转运基因OsMST1及糖转运体OsMST1可用于提高水稻的产量，通过植物分子遗传和生理生化等方法将该糖转运基因OsMST1敲除，使其失去功能，导致结实率和单株产量显著下降。将这种糖转运基因OsMST1过量表达，从而增强水稻结实率和单株产量显著增加，为通过生物技术的手段进一步提高水稻的单产提供了优异的基因资源。

实施例2：

本发明的水稻糖转运基因OsMST1或其糖转运体(糖转运体OsMST1)在培育高产量水稻(提高水稻结实率和单株产量)中的应用，具体包括OsMST1过表达和突变体植物的构建、成熟期表型和产量因子分析。

为了验证本发明的糖转运基因OsMST1在水稻中的作用，我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对水稻糖转运基因OsMST1进行编辑，分别获得了两个不同突变类型的敲除株系osmst1-1、osmst1-2，如图4所示，敲除株系osmst1-1的突变类型为5个碱基的缺失、敲除株系osmst1-2的突变类型为4个碱基的缺失。

并对野生型(WT)和突变体(osmst1-1、osmst1-2)灌浆期各部位进行可溶性糖和淀粉含量的分析，具体如下：

1、可溶性总糖的提取方法：1)取适量新鲜的植物组织材料，110℃杀青30min，然后调至40℃左右过夜烘干。2)用球磨机打磨成粉，称量细粉约0.1g置于10mL离心管内，加入3mL 80％乙醇，80℃水浴10min，冷却后3000g离心10min，收集上清液于新的10mL离心管中；于残渣中再加入2mL 80％乙醇，80℃水浴10min，重复抽提两次，合并三次上清至总体积6mL。3)上清液中加入适量活性炭，80℃水浴脱色30min，充分混匀后静置5min(或冷却后4℃过夜处理)，8000g离心15min，取1mL上清液于1.5mL离心管中。4)加入800μL蒽酮浓硫酸溶液，充分混匀，沸水浴10min，冷却后取200μL到酶标板中，在620nm下测定吸光值。根据样品的OD值和标准曲线公式，计算每个样品的可溶性总糖的浓度。

2、淀粉的提取与含量测定：将提取可溶性糖时剩余沉淀中的乙醇挥发干净，加入5mL水煮沸15min，冷却后，加入0.5mL的9.2mol/L的高氯酸，最后加蒸馏水定容至10mL，混匀，3000g离心10min，根据不同的淀粉浓度进行稀释，并与蒽酮硫酸反应，煮沸10min，取200uL分装到酶标板3个孔中，蒽酮硫酸作为对照，于620nm处测定吸光值。根据样品的OD值和标准曲线公式，计算每个样品中淀粉含量。

结果如图5-图6所示。相比野生型(WT)，突变体(osmst1-1、osmst1-2)可溶性糖和淀粉的含量在叶片中显著降低，而在节和叶鞘中显著累计。数值为三次重复实验的平均值±标准差，P值为显著性差异统计检验Student’s t-test分析*P<0.05，**P<0.01。说明本发明的糖转运体参与糖的转运和分配，突变后会改变糖和淀粉的组织分配。

本发明同时采用¹³C同位素标记实验进行生理功能分析。于灌浆前期对水稻植株进行标记，标记半个月，分部位取样测定¹³C的丰度。具体如下：1)于控温控湿控二氧化碳的标记箱内进行实验，一个标记箱做同位素标记，另一个做对照；2)将灌浆前期的水稻植株放于设置好的标记箱内，进行连续十五天的标记，每四天加一次制气样品；3)标记结束后，分穗、旗叶、节1、茎1、叶鞘1、叶片、节、茎和叶鞘，烘干；4)磨碎过100目筛，送中国亚热带研究所进行同位素的测定。结果如图7所示，¹³C在节和叶鞘中的丰度显著高于野生型，说明本发明的糖转运体OsMST1确实参与糖的转运和分配。

为了进一步验证糖转运基因OsMST1在植物中的功能，我们通过PCR的方法通过引物OE::OsMST1，F1正向引物的序列为5'-CGGGGGACTCTAGAGGATCCATGGCCGGAGGTGTCATCGT-3'(如SEQ ID NO：5所示)，R1反向引物的序列为5'-TCGGAGGAGGCCATACTAGTTCAGTACGTCCCGGTCGGTT-3'(如SEQ ID NO：6所示)，扩增水稻糖转运基因OsMST1的CDS序列，然后通过同源重组的方法克隆至植物表达载体P1300中(获自University of California，San Diego，US)，得到含有基因OsMST1的目标载体；再将所述目标载体通过热击转化法转入农杆菌中，将纯化的质粒克隆至水稻中进行表达，具体步骤如下：接种，保存在-20度的种子使用前取出(用多少取多少，用纸包好)，置于37度恒温箱烘烤10-20小时左右(最好过夜)。拨去种皮，尽量不要损害到种胚，拨皮后检查,将胚乳表面发黑或胚死亡的种子剔掉，用纸包好带入组培操作间。(以下操作均在超净工作台内进行)将种子倒入干净的100ml三角瓶中，加入75％乙醇消毒2分钟，期间要不断的摇动，倒出酒精，再加入20ml 2％的NaC103,覆盖种子即可，室温在摇床上160rpm摇25min,将NaC10倒掉，将种子用无菌镊子转移至高压灭菌过的滤纸上，在超净工作台上吹干为止，然后将种子接入诱导培养基(NB培养基)上，每皿20粒，注明日期，封口膜封口，置于27C恒温箱中暗培养。掐芽，种子在培养箱中培养7天后，长出可见的芽和遁片，根据种子的生长状态，将芽掐掉，继续在27℃恒温箱中暗培养。继代掐芽后7天左右，进行第一次继代，用镊子将新长出的愈伤夹成小块，转入新的NB培养基中，每皿20粒，在27℃恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代，培养15天后，就可以长出颜色鲜黄，表面光滑，直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第三次继代。共培养(整个操作过程需8天)，第一天：选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2-3mm的颗粒愈伤，置于27℃暗培养4天。第三天:农杆菌划线28℃培养，两天后农杆菌长满即可洗脱(18)，用于转化。第五天:悬浮农杆菌，悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮(AS)(19)20ML的AMM液体培养基中，剧烈震荡1min后，静置1h，让农杆菌形成悬浮液，取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤，略微摇动静置30min，于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基(AS培养基)上27℃暗培养3天。第八天：等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑，但未长满愈伤时，挑取愈伤于无菌培养瓶中，用无菌水冲洗，直至无可见菌丝为止，最后用含300mg/1的羧苄无菌水静置1h，置于无均滤纸上晾干后，转移至筛选培养基上。抗性愈伤的继代筛选，当抗性愈伤在朝霉素30培养基上生长15天后，将愈伤换到新的朝霉素30培养基上，15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤，继续培养，等新愈伤长出很多时转移至潮霉素培养基上，筛选3-7天。分化，从朝霉素培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基上再生，成团而不是分散放置，一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽，随后根也长出,当芽长至2-3cm时，就可移至1/2MS培养基(生根培养基)上。分化间进行，25℃，光14小时，暗10小时。生根，超净工作台内进行，每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗，在生根培养基上生长10天。分化间进行，25℃，光14小时，暗10小时。炼苗，生根十天后开盖，加己晾两天或晒过的水，泡过培养基即可，2天后用水洗掉生根培养基，加晾两天或晒过的水浸过根，3-7天后待生长状态好了后移栽大田。(期间每天要加水，确保根都泡在水中)。分化间进行，25℃，光14小时，暗10小时。最终获得的转基因阳性苗就是过表达株系osMST1^OE1、osMST1^OE2，即高产量水稻。

在成熟期，对野生型(WT)、突变体(osmst1-1、osmst1-2)和过表达株系(osMST1^OE1、osMST1^OE2)进行表型和产量相关性状进行分析。

结果如图8-图13所示，突变体(osmst1-1、osmst1-2)结实率和单株产量显著降低，小区产量减少20％-22％。过表达株系(osMST1^OE1、osMST1^OE2)结实率和单株产量显著升高，小区产量增加15％-16％。数值为三次重复实验的平均值±标准差，P值为显著性差异统计检验Student’s t-test分析*P<0.05，**P<0.01。说明本实施例的糖转运体对提高水稻产量有积极的作用，为通过遗传育种进一步提高水稻单产提供基因和种质资源。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 水稻糖转运基因OsMST1及其糖转运体、应用和扩增引物

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1554

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

atggccggag gtgtcatcgt ggcgaacgac ggtgatggct ccgccgtgga ccacggcgga 60

cggctgacgt tctcggtggt catcacctgc ctcgtggcgg cctccggcgg cctcatcttc 120

ggctacgacg tcggcatctc aggcggcgtc tcgacgatgg agccgttcct gcggcggttc 180

ttccccggcg tggtgaggag gatggcggag gcgaggcccg ggaacgagta ctgcgtctac 240

gacagccagg cgctgacggc gttcacgtcg tcgctgtacg tcgccgggct ggtggcgtcg 300

ctcgtggcca gccgcgtcac cagggcgatg gggcggcagg ccgtcatggt catgggcggc 360

gcgctcttct tcgccggcgg cgccgtcacc ggcttcgccg tgaacatcgc catgctcatc 420

gtcggccgca tgctgctcgg cttcggcgtc ggcttcacca accaggcggc tcctctcttc 480

ctcgccgaga tggccccgac gcggtggcgc ggctcgctca cggccgggtt ccagttcttc 540

ctcgccgtcg gcgtcgtcat cgccaccgtc accaactact tcgcgtcgcg cgtcccctgg 600

gggtggcgcc tctccctcgg cctcgcgggg gcgcccgccg tcgtcatctt cctgggcgcg 660

ctcttcctca ccgacacgcc cagcagcctc gtcatgcgcg gcgacacggc ccgcgcgcgc 720

gccgcgctgc tccgggtgcg cggggctggc gccgacgtgg aggcggagct gaagggcatc 780

gtgcgcgccg tggaggtggc gcgccagggg gaggacggcg cgttccggcg gatggcggcg 840

aggcgggagt accgccctta cctggtgttc gccgtggcca tgcccatgtt cttccagctc 900

acgggcgtca tcgtgatctc cttcttctcc ccgctggtgt tccgcaccgt cgggttcggc 960

agcaacgccg cgctgatggg caacgtcatc ctcggcgccg tcaacctcgt ctgcctcatg 1020

ctctccaccc tcgtcatcga ccgctacggc cgcaaggtgc tcttcatggt cggcggcgcc 1080

atcatgatca tcgcccaggt tggggtggcg tggatcatgg gggcgcaggt ggggaagaac 1140

gggtcggagg cgatggcgag gccgtacgcg gtggcggtgg tggcgttcac gtgcctgcac 1200

acggcggggt tcgggtggtc gtggggcccg ctggggtggg tgatccccgg cgagatattc 1260

ccggtggaca tccggtcggc ggggcaggcg atgaacgtgt ccatcggcct cggcctcacc 1320

ttcgtgcaga cgcagtcgtt cctcgccatg ctctgccggt tcaggtacgg caccttcgcc 1380

tactacgccg cgtgggtcgc cgtcatgacc gtcttcatcg ccgtcttcct gccggagacc 1440

aagggcgtcc cgctcgagtc catggccacc gtctgggcgc gacactggta ctggaagcgg 1500

ttcgcgcggg agcaaccaaa gacgagcgcc gacgaaccga ccgggacgta ctga 1554

<210> 2

<211> 517

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Ala Gly Gly Val Ile Val Ala Asn Asp Gly Asp Gly Ser Ala Val

1 5 10 15

Asp His Gly Gly Arg Leu Thr Phe Ser Val Val Ile Thr Cys Leu Val

20 25 30

Ala Ala Ser Gly Gly Leu Ile Phe Gly Tyr Asp Val Gly Ile Ser Gly

35 40 45

Gly Val Ser Thr Met Glu Pro Phe Leu Arg Arg Phe Phe Pro Gly Val

50 55 60

Val Arg Arg Met Ala Glu Ala Arg Pro Gly Asn Glu Tyr Cys Val Tyr

65 70 75 80

Asp Ser Gln Ala Leu Thr Ala Phe Thr Ser Ser Leu Tyr Val Ala Gly

85 90 95

Leu Val Ala Ser Leu Val Ala Ser Arg Val Thr Arg Ala Met Gly Arg

100 105 110

Gln Ala Val Met Val Met Gly Gly Ala Leu Phe Phe Ala Gly Gly Ala

115 120 125

Val Thr Gly Phe Ala Val Asn Ile Ala Met Leu Ile Val Gly Arg Met

130 135 140

Leu Leu Gly Phe Gly Val Gly Phe Thr Asn Gln Ala Ala Pro Leu Phe

145 150 155 160

Leu Ala Glu Met Ala Pro Thr Arg Trp Arg Gly Ser Leu Thr Ala Gly

165 170 175

Phe Gln Phe Phe Leu Ala Val Gly Val Val Ile Ala Thr Val Thr Asn

180 185 190

Tyr Phe Ala Ser Arg Val Pro Trp Gly Trp Arg Leu Ser Leu Gly Leu

195 200 205

Ala Gly Ala Pro Ala Val Val Ile Phe Leu Gly Ala Leu Phe Leu Thr

210 215 220

Asp Thr Pro Ser Ser Leu Val Met Arg Gly Asp Thr Ala Arg Ala Arg

225 230 235 240

Ala Ala Leu Leu Arg Val Arg Gly Ala Gly Ala Asp Val Glu Ala Glu

245 250 255

Leu Lys Gly Ile Val Arg Ala Val Glu Val Ala Arg Gln Gly Glu Asp

260 265 270

Gly Ala Phe Arg Arg Met Ala Ala Arg Arg Glu Tyr Arg Pro Tyr Leu

275 280 285

Val Phe Ala Val Ala Met Pro Met Phe Phe Gln Leu Thr Gly Val Ile

290 295 300

Val Ile Ser Phe Phe Ser Pro Leu Val Phe Arg Thr Val Gly Phe Gly

305 310 315 320

Ser Asn Ala Ala Leu Met Gly Asn Val Ile Leu Gly Ala Val Asn Leu

325 330 335

Val Cys Leu Met Leu Ser Thr Leu Val Ile Asp Arg Tyr Gly Arg Lys

340 345 350

Val Leu Phe Met Val Gly Gly Ala Ile Met Ile Ile Ala Gln Val Gly

355 360 365

Val Ala Trp Ile Met Gly Ala Gln Val Gly Lys Asn Gly Ser Glu Ala

370 375 380

Met Ala Arg Pro Tyr Ala Val Ala Val Val Ala Phe Thr Cys Leu His

385 390 395 400

Thr Ala Gly Phe Gly Trp Ser Trp Gly Pro Leu Gly Trp Val Ile Pro

405 410 415

Gly Glu Ile Phe Pro Val Asp Ile Arg Ser Ala Gly Gln Ala Met Asn

420 425 430

Val Ser Ile Gly Leu Gly Leu Thr Phe Val Gln Thr Gln Ser Phe Leu

435 440 445

Ala Met Leu Cys Arg Phe Arg Tyr Gly Thr Phe Ala Tyr Tyr Ala Ala

450 455 460

Trp Val Ala Val Met Thr Val Phe Ile Ala Val Phe Leu Pro Glu Thr

465 470 475 480

Lys Gly Val Pro Leu Glu Ser Met Ala Thr Val Trp Ala Arg His Trp

485 490 495

Tyr Trp Lys Arg Phe Ala Arg Glu Gln Pro Lys Thr Ser Ala Asp Glu

500 505 510

Pro Thr Gly Thr Tyr

515

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacaccgtcg aggcaatcgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcccgtgtcc attgtaggtc 20

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggggactc tagaggatcc atggccggag gtgtcatcgt 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcggaggagg ccatactagt tcagtacgtc ccggtcggtt 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgacggccag tgccaagctt gcttaaatat aagggcaggt 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gactgaccac ccggggatcc tccccctcct cgctccgtct 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggtaccga gctcggatcc atggccggag gtgtcatcgt 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatggatatc tgcagaattc tcagtacgtc ccggtcggtt 40

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtcaacttg ttgattcccc tctt 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaccgcaaaa tccaaagaac g 21

Claims

1.一种水稻糖转运基因OsMST1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种由权利要求1所述的水稻糖转运基因OsMST1的编码得到的糖转运体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1所述的水稻糖转运基因OsMST1或如权利要求2所述的糖转运体在培育高产量水稻中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其应用的方法包括如下步骤：通过PCR法扩增所述水稻糖转运基因OsMST1的CDS序列，然后通过同源重组的方法克隆至表达载体中，得到含有基因OsMST1的目标载体，再将所述目标载体通过热击转化法转入农杆菌中，最终通过遗传转化克隆至水稻中进行表达，得到含有所述水稻糖转运基因OsMST1的过表达株系，即为高产量水稻。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述表达载体为P1300。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述PCR法扩增采用的扩增引物为OE::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

7.一种用于权利要求1所述的水稻糖转运基因OsMST1的扩增引物，其特征在于，该扩增引物为G::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

8.一种用于权利要求1所述的水稻糖转运基因OsMST1的扩增引物，其特征在于，该扩增引物为OE::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

9.一种用于权利要求1所述的水稻糖转运基因OsMST1的扩增引物，其特征在于，该扩增引物为GUS::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

10.一种用于权利要求1所述的水稻糖转运基因OsMST1的扩增引物，其特征在于，该扩增引物为Y::OsMST1，其正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。