CN106916843B

CN106916843B - 一种用农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法及其应用

Info

Publication number: CN106916843B
Application number: CN201510994162.6A
Authority: CN
Inventors: 韩丹翔; 闰从林; 加晶; 胡强
Original assignee: Sdic Biotechnology Investment Co ltd; Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Sdic Biotechnology Investment Co ltd; Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2015-12-25
Filing date: 2015-12-25
Publication date: 2021-01-19
Anticipated expiration: 2035-12-25
Also published as: CN106916843A

Abstract

本发明公开了一种用农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法，该方法包括以下步骤：S1雨生红球藻的活化及预培养；S2农杆菌的活化和质粒转化；S3对步骤S2中获得的农杆菌进行扩培及活性诱导；S4农杆菌和藻细胞共培养；S5转化子筛选；S6转化子鉴定。本发明有效建立了使用农杆菌高效转化雨生红球藻的方法，优化关键影响因素和条件，从而实现较高的转化效率和较好的可重复性，以便通过基因工程手段对藻种进行改良，开发更有经济价值的红球藻藻种，提高工业化生产价值。

Description

一种用农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种用农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法及其应用。

背景技术

虾青素(Astaxanthin，3,3'-二羟基-β,β胡萝卜素-4,4'-二酮，C₄₀H₅₂O₄,图1)是一种红色酮式类胡萝卜素，广泛存在于水生生物特别是藻类和水生动物中。虾青素是一种优质的天然抗氧化剂，其抗氧化活性比β-胡萝卜素要强20倍。虾青素在生物体内可与蛋白质结合而呈现青色、蓝色和棕色等不同颜色，具有较强的着色功能。由于虾青素具有多种生理功效，如在抗氧化性、抗肿瘤、预防癌症、增强免疫力、改善视力等方面都有一定的效果，近年来已成为国内外科研机构及水产养殖、化妆品、医药、食品等众多行业的研究热点。

在自然界中，虾青素可由微藻、植物、真菌及细菌等合成，其中雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)具有最强的合成能力，因而广泛应用于商业化生产天然虾青素。雨生红球藻是一种单细胞的淡水绿藻，隶属于绿藻门(Chlorophata)、绿藻纲(Chlorophyeeae)、团藻目(Volvoeales)、红球藻科(Haematoeoeeaceae)，红球藻属(Haematocoeeus)。由雨生红球藻合成的天然虾青素已经被证实可以提高机体免疫力，防止紫外线(UV-A)对细胞的损伤，抑制癌细胞生长，延滞衰老过程，预防心血管疾病，因此具有巨大的医疗应用前景[Han D,Li Y,Hu Q.Astaxanthin in microalgae:pathways,functions and biotechnological implications.Algae,2013,28:131-147]。

雨生红球藻生活史复杂多样，主要包括营养生长和转化产虾青素两个阶段：在光强较弱、营养丰富的适宜环境中以绿色游动的营养细胞形态存在，在这个过程中雨生红球藻细胞中存在鞭毛，呈游动状态，生长旺盛，生物量增加明显，此阶段即为营养生长阶段；第二个阶段：当其处于不利的环境条件(即胁迫条件，如高光照、高盐、高温或营养盐饥饿)时，便失去鞭毛，以不动的厚壁孢子形态存在，生长速率减慢，基本上呈静止状态，这时细胞内会积累大量的虾青素，从而使细胞呈现红色，此阶段为虾青素积累阶段。

目前用于商业化生产天然虾青素的雨生红球藻大多为筛选得到的野生型品种，这种野生型红球藻细胞中虾青素的含量非常有限(2％以下)，在实验室规模上最高的含量也不超过4％，且生长速度慢，细胞密度低，对培养技术要求高，目前只能以较高的生产成本进行小规模的培养。利用转基因技术来改善雨生红球藻的品质，获得生长速度快、虾青素含量高、耐受性强的新品种是突破现有产量及成本限制的有效手段，具有巨大的商业优势和广阔的市场前景。

目前已有报道建立了基因枪法[Steinbrenner J,Sandmann G.Transformationof the green alga Haematococcus pluvialis with a phytoene desaturase forccelerated astaxanthin biosynthesis[J].Applied and environmentalmicrobiology,2006,72(12):7477-7484.]对雨生红球藻进行转基因改造的方法，该方法是以定点诱变的八氢番茄红素脱氢酶基因为筛选标记，用农药达草灭进行筛选，成功获得了转化子，转化效率约为10^-6cells/μg DNA，经PCR、Southern blot和Western blot鉴定，证明了目的基因成功整合进雨生红球藻的基因组并表达。但该法需要昂贵的仪器基因枪，操作过程复杂且稳定性差，所用的报告基因需定点突变改造不易获得，转化效率较低，不利于推广使用。

另有使用农杆菌EHA101成功转化雨生红球藻SAG-19a的报道[kathiresan s,chandrashekar a,ravishankar g a,et al.Agrobacterium-mediated transformationin the green alga Haematococcus pluvialis(chlorophyceae,volvocales).journalof phycology,2009,45(3):642-649.]，该法以潮霉素为筛选标记，β-葡萄醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)为报告基因，获得了稳定的转化子，并进行了PCR、Southern blot鉴定以及GUS活性鉴定和绿色荧光观察等，证明了外源基因整合进了雨生红球藻的基因组并表达。该法包含藻的预培养、藻菌共培养及筛选等步骤，给出了关键影响因素如潮霉素使用浓度、乙酰丁香酮(Acetosyringone,简称AS)使用浓度、共培养光照强度等条件对转化效果的影响。但经实验，发现存在以下问题：①该法给出的具体参数不适用于该报道以外的其他红球藻藻株，如红球藻藻种(NIES-144)。而NIES-144是一株广泛使用的实验室模式株，由于同时具有异养生长的能力，常被用于发酵生产雨生血球藻的生物质，是一种具有重要的具产业化应用前景的藻株。②该法揭露的共培养光照强度为18.75±2.5μmol·m^-2·s^-1，然而实际上，在该光照条件下大部分的红球藻细胞(包括但不限于NIES144)会迅速向不动孢子转变，并积累虾青素，从而不利于获得转化子；③该法中的藻细胞是直接涂布在固体TAP平板上进行培养，会导致细胞失水死亡，成活率较低；④该法不包含对农杆菌进行活性诱导的步骤及优化相关条件。

总之，该方法转化效率较低，可重复性差，不适用于其他雨生红球藻藻种，因此研究更加高效稳定及广泛适用性的转化方法有利于推进雨生红球藻基因工程领域的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法，用以提高农杆菌介导的转化效率。

本发明的目的还在于提供所述基因转化方法在制备转基因雨生红球藻中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法，该方法包括将已转化质粒的农杆菌与待转化雨生红球藻共培养的步骤，其在共培养前还包括对所述农杆菌进行活性诱导的步骤。

优选，对所述农杆菌进行活性诱导是在pH 5.2-5.6、30μM≥AS的浓度≥0μM。更优选，对所述农杆菌进行活性诱导是在pH 5.4、7.5μM AS的培养环境下进行。在弱酸性环境和AS存在的情况下，对农杆菌进行活性诱导，可以显著提高转化率。本领域应理解，一旦进行诱导的步骤则即可对农杆菌活性产生影响，较佳诱导时间至少为4h，考虑到时间成本等综合因素，2-8小时是一个较佳的时间范围。

优选，所述共培养的光照强度为0-10μmol·m^-2·s^-1。在较弱的光照条件下，可以避免藻细胞过快转化成不动孢子。更优选，所述共培养的光照强度为5μmol·m^-2·s^-1。

优选，菌藻共培养的pH值为5.2-5.6。菌藻在此pH环境下共培养具有更好的转化效率。

进一步，在共培养后还包括筛选转化子的步骤。其在固体培养基上筛选转化子。优选，共培养后的藻细胞在含增稠剂溶液环境中铺平板到所述固体培养基上进行转化子筛选。本领域技术人员应理解，这里的增稠剂是对藻细胞不构成损伤的增稠剂，其具有一定防止水分过快挥发的作用，从而增加藻细胞的存活率。所述的增稠剂包括但不限于玉米淀粉、土豆淀粉等等。

通常，以抗性基因作为选择标记。筛选转化子分两阶段培养，第一阶段为弱光阶段，光照强度为0-5μmol·m^-2·s^-1条件下培养7天，第二阶段为强光培养，在5-10μmol·m^-2·s^-1培养30-35天。第一阶段持续7天的弱光，可以选择性地使野生型细胞迅速死亡；第二阶段较强的光照有利于转化子的正常生长。在本发明的实例中，使用潮霉素抗性选择标记，筛选转化子使用的潮霉素浓度有效浓度为5-7μg/mL。

进一步，在筛选转化子后，还包括对转化子鉴定的步骤。

进一步，在共培养前还包括雨生红球藻活化和预培养的步骤。所述预培养的光照强度优选为0-10μmol·m^-2·s^-1。所述预培养是将活化后的藻细胞在含增稠剂的溶液环境中铺平板到固体培养基上进行培养。

具体地，本发明方法包括以下步骤：

S1雨生红球藻的活化及预培养；

S2农杆菌的活化和质粒转化；

S3对步骤S2中获得的农杆菌进行扩培及活性诱导；

S4农杆菌和藻细胞共培养；

S5转化子筛选；

S6转化子鉴定。

优选的，在S1雨生红球藻预培养中，在铺板前将淀粉溶液或用于增稠、起到防止水分快速丧失的物质混合到藻细胞后再进行铺板，所述预培养的光照强度为0-10μmol·m^-2·s^-1；更优选的，所述淀粉溶液为玉米淀粉溶液。玉米淀粉用量为0.39-2.36mg/cm²，优选用量为0.79-1.57mg/cm²，即按常规9cm直径培养平板为25-150mg/板，优选为50-100mg/板。现有技术在藻的预培养中，是将绿色游动的营养生长期的细胞涂布在含培养基的固体琼脂平板上培养，由于细胞较大且细胞壁较脆弱，不能充分利用培养基的营养，且易失水而死亡，细胞萌发率较低。本发明的方法是将适量的玉米淀粉溶液混合藻细胞后铺板，大幅提高了藻细胞的成活率。

优选的，所述步骤S3的活性诱导中，其诱导条件是pH值5.2-5.6的酸性条件，加入诱导剂AS，该AS的浓度范围是0-30μM。

步骤S4，现有技术在藻菌共培养时，光照强度高达18.75±2.5μmol·m^-2·s^-1；但实际上，雨生红球藻在较强光照下易于向不动孢子形态转化，从而不利于农杆菌转化。在步骤S4中，本发明的方法对共培养转化阶段的光照强度进行了优化，找出了最有利于转化的光强度，选择光照强度为0-10μmol·m^-2·s^-1条件下共培养。这样的光强度，不会使藻细胞过快转化成不动孢子(不动孢子细胞壁增厚且细胞活性降低，无法进行有效转化)，提高转化率。优选的，光照强度是5μmol·m^-2·s^-1。

此外，在步骤S4中，农杆菌与藻细胞共培养时，本发明将S3中得到的农杆菌菌体悬浮液一并(“一并”的含义是指由步骤S3中直接承继过来的各成分，包括酸性环境)铺在预培养雨生红球藻的平板上，使共培养的环境也为弱酸性环境(pH 5.2-5.6)。因为弱酸性环境有利于藻细胞接受外源基因，利于农杆菌将目标基因介导至藻细胞的基因组上。

S5中，本发明的方法对“转化子筛选”过程中的光照强度进行了优化，包括两阶段培养，第一阶段为弱光阶段，光照强度为0-5μmol·m^-2·s^-1条件下培养7天，第二阶段为强光培养，在约5-10μmol·m^-2·s^-1培养30-35天。第一阶段持续7天的弱光，可以选择性地使野生型细胞迅速死亡；第二阶段较强的光照有利于转化子的正常生长。

S5中，潮霉素浓度的有效范围为5-7μg/mL的Hyg，此浓度的潮霉素可以选择性杀死野生型血球藻而保留转化子。若潮霉素浓度过高，Hyg会杀死几乎全部的野生型及转化子，而潮霉素过低野生型存活率太高，干扰转化子的生长。

步骤S5中，经步骤S4的共培养后，将藻细胞混合淀粉溶液或用于增稠、起到防止水分快速丧失的物质，如玉米淀粉(对藻无害的增稠剂)平铺在Agar平板上培养，防止水分过快丧失，提高转化子的存活率。

在一优选实施例中，本发明提供了所述雨生红球藻进行基因转化的方法，该方法包括如下步骤：

S1雨生红球藻的活化及预培养，所述预培养的条件是：在铺板前将淀粉溶液或用于增稠、起到防止水分快速丧失的物质混合到藻细胞后再进行铺板，所述预培养的光照强度为0-10μmol·m^-2·s^-1；

S2农杆菌的活化和质粒转化；

S3对步骤S2中获得的农杆菌进行扩培及活性诱导，所述诱导条件是pH值5.2-5.6的酸性条件，加入诱导剂AS，该AS的浓度范围是0-30μM；

S4农杆菌和藻细胞共培养，光照强度为0-10μmol·m^-2·s^-1，pH值为5.2-5.6；

S5转化子筛选，培养前将藻细胞混合淀粉溶液或用于增稠、起到防止水分快速丧失的物质，培养中分两阶段培养，第一阶段为弱光阶段，光照强度为0-5μmol·m^-2·s^-1条件下培养7天，第二阶段为强光培养，在约5-10μmol·m^-2·s^-1培养30-35天；潮霉素浓度的有效范围为5-7μg/mL；

S6转化子鉴定。

有益效果

首先，本发明加入了对经质粒转化的农杆菌的活性诱导步骤，通过调节pH达到弱酸性环境、以及添加适当浓度的AS，能够有效增加含目标基因农杆菌的介导转化活性；其次，菌藻共培养时，将活性诱导步骤得到的农杆菌菌体悬浮液铺在预培养雨生红球藻的平板上，因而使共培养也是在酸性环境下进行；再次，藻种预培养步骤、菌藻共培养步骤、筛选步骤中均采用增稠剂防止水分过快丧失造成细胞死亡，可大幅提高细胞成活率；再次，共培养的光强选择范围，可避免雨生红球藻细胞过快转化成不动孢子；最后，本发明在筛选转化子步骤中，选用的Hyg浓度的确定以及两阶段培养方法等等，本发明借助上述方法，实现了农杆菌介导雨生红球藻的转化，并获得了较好的转化率及转化稳定性。

本发明有效建立了使用农杆菌高效转化雨生红球藻的方法，优化关键影响因素和条件，从而实现较高的转化效率和较好的可重复性，以便通过基因工程手段对藻种进行改良，开发更有经济价值的红球藻藻种(生长速度更快、虾青素含量更高)，提高工业化生产价值。

附图说明

图1为现有技术中虾青素(A)、虾青素单酯(B)和虾青素双酯(C)的结构图；

图2为转化用表达载体pCam-GFP质粒的框图；

图3为本发明实施例2中添加玉米淀粉铺板对雨生红球藻成活率的影响，培养皿中含1％Agar TAP培养基，A1为直接涂布400个细胞，A4为400个藻细胞混合100mg玉米淀粉；

图4为本发明实施例4中诱导剂pH值对转化率的影响；

图5为本发明实施例5中诱导剂AS浓度对转化率的影响；

图6为转化子筛选，W为野生型对照，T1-3为转化子平板；

图7为转化子Hpt II和eGFP基因PCR鉴定，T为阳性对照，W为阴性对照，M为Marker，1-10为转化子。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。例如，雨生红球藻的活化、平板培养的培养基、质粒转化农杆菌的方式、菌藻共培养的方式等等，除特别指明外，本发明对此并无限定。需要说明的是，除另有特别注明的外，在本申请文件中出现的有关浓度和光强的范围值0，均包括等于0的情况。

实验材料的准备

双元质粒：pCam-GFP，该质粒的框图如图2所示，该质粒含有CaMV 35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因，其表达的产物可使潮霉素Hyg失活。

农杆菌菌株：LBA4404

Basal培养基：三水乙酸纳1.987g/L，酵母提取物2.0g/L，六水氯化镁0.2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，二水氯化钙0.02g/L，L-天冬氨酸0.405g/L，调节pH值6.8。

YEB培养基：牛肉浸膏5g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，七水硫酸镁4g/L，调pH 7.4。固体培养基加琼脂1.5g/100mL。使用时加入50μg/mL利福平(Rifampicin,Rif)、50μg/mL硫酸链霉素(Streptomycin,Str)、50μg/mL卡那霉素(Kanamycin,Kan)。

TAP培养基：2.42g Tris，25mL TAP盐，0.375mL磷酸盐，1.0mL微量元素，1.0mL乙酸，定容到1L，调pH 7.0。

诱导培养基：调节液体TAP的pH值并添加不同浓度的乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)。

共培养培养基：在pH 7.0的TAP中加入1％浓度的琼脂及不同浓度的AS。

筛选培养基：在pH 7.0的TAP中加入1％浓度的琼脂、750μg/mL头孢霉素(Cefotaxime,Cef)以及5μg/mL潮霉素(Hygromycin,Hyg)，其中头孢霉素可杀死农杆菌，潮霉素可杀死野生型雨生红球藻。

实施例1农杆菌介导对雨生红球藻进行基因转化的方法的详细实施例第一步雨生红球藻的活化及预培养

将固体平板(本发明中所用平板直径是9cm)上划线分离的单克隆雨生红球藻NIES-144挑取到含10mL Basal培养基的50mL三角瓶里，约15-20μmol·m^-2·s^-1、20℃下静置培养10d。转接入含100mL Basal培养基的250mL三角瓶里同等条件下培养4d，再以10％的比例接种在含100mL Basal培养基的250mL三角瓶里下静置培养4d。在3000rpm、2min条件下离心收集藻，用无菌ddH₂O洗涤一次后重悬，调节细胞密度，将2×10⁶个细胞混合100mg玉米淀粉溶液后均匀铺在含15μM AS及1％Agar的TAP固体平板上，风干后在5μmol·m^-2·s^-1、20℃下静置培养2d(光照太强会导致血球藻转化成不动孢子)。

第二步农杆菌的活化，质粒转化

S2-1，农杆菌的活化：于-80℃冰箱中取出保存的农杆菌LBA4404，用接种环划线于含有50μg/mL Rif和Str的YEB平板上，28℃倒置培养48小时；挑单菌落接种于含有50μg/mLRif和Str的YEB液体培养基中，震荡培养(28℃，180rpm)20h左右。

S2-2，质粒转化农杆菌：4℃、8000rpm，离心5min收集S2-1中所获得的菌液，弃上清并用无菌ddH₂O洗涤两次。用预冷的0.05M氯化钙溶液将菌液悬浮混匀，静止冰浴30分钟，即为农杆菌感受态细胞。取0.1μg左右的重组质粒(含有待转化的目的基因)加入100μL的农杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴10min，液氮速冻5min，立即转入37℃的水浴锅中，孵育1min后立即冰浴3-5min，加入500μL YEB液体培养基于摇床中震荡培养(28℃，180rpm)2h。取出后涂在含有50mg/L的Kan和50mg/L Rif的LB平板上面，28℃倒置培养48h左右至长出单菌落为止。挑单菌落进行PCR鉴定，阳性菌落接种于含有50μg/mL的Rif、Str和Kan的YEB液体培养基中，震荡培养(28℃，180rpm)20h，加入15％的甘油后保存在-80℃冰箱中备用。

第三步农杆菌活性诱导

取800μL冻存的LBA4404菌液接种在含50μg/mL Rif、Str、Kan和Hyg的10mL YEB培养基里，180rpm、28℃下培养约15h至OD₆₀₀为0.2。8000g、1min离心收集400μL菌体，用无菌ddH₂O洗涤后再用600μL含15μM AS的液体TAP(调酸性pH，5.2-5.6)重悬，于24℃、180rpm下诱导4h。

第四步农杆菌与雨生红球藻共培养

将步骤三得到的600μL菌体混合溶液(含有AS及酸性pH＝5.2-5.6等，即换句话是，经过活性诱导的含目标基因的农杆菌混合液)，均匀铺在前述预培养雨生红球藻的平板上，静置15min后风干，再于5μmol·m^-2·s^-1、22℃下倒置培养2days。

第五步筛选雨生红球藻转化子

用含750μg/mL Cef的ddH₂O将共培养后的藻洗脱下来，3000rpm离心2min，小心吸取上层菌悬液弃去，重复约2-3次至上层液体变为清液，静置0.5h，去上清，将三分之一藻细胞混合100mg玉米淀粉平铺在1％Agar平板上，Hyg浓度均为5μg/mL Hyg，于20℃下先在0-5μmol·m^-2·s^-1下倒置培养一周，光照强度为0-5μmol·m^-2·s^-1，再在约5-10μmol·m^-2·s^-1倒置培养3-5周，光照强度为5-10μmol·m^-2·s^-1。

第六步雨生红球藻转化子外源基因整合及表达鉴定方法

PCR鉴定：

分别以转基因雨生红球藻和野生型藻(作为阴性对照，WT)为模板，使用HptⅡ-F和HptⅡ-R组成的引物对(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)检测HptⅡ基因，使用eGFP-F和eGFP-R组成的引物对(如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)检测eGFP基因。

HptⅡ-F(SEQ ID No.1)：5'-GTGTCACGTTGCAAGACCTG-3'

HptⅡ-R(SEQ ID No.2)：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'

eGFP-F(SEQ ID No.3)：5'-AAGGACGACGGCAACTACAAGACC-3'；

eGFP-R(SEQ ID No.4)：5'-CACGAACTCCAGCAGGACCATG-3'。

HptⅡ基因PCR反应条件：95℃预变性8min，然后经38个循环(95℃45s、60.8℃30s、72℃45s)72℃10min。

eGFP基因PCR反应条件：95℃预变性8min，然后经38个循环(95℃45s、62℃30s、72℃45s)72℃10min。

取5μL PCR物进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察。

结果表明：在转基因雨生红球藻中均可以PCR扩增获得HptⅡ基因的目的片段(407bp)和eGFP基因的目的片段(372bp)；在野生型雨生红球藻中没有目的条带。说明外源基因已经成功插入转基因藻的基因组中。

实施例2添加玉米淀粉铺板以提高雨生红球藻Flotow NIES-144的成活率

(1)雨生红球藻的培养

将固体平板上划线分离的单克隆雨生红球藻NIES-144挑取到含10mL Basal培养基的50mL三角瓶里，约15-20μmol·m^-2·s^-1、20℃下静置培养10d。转接入含100mL Basal培养基的250mL三角瓶里同等条件下培养4d，再以10％的比例接种在含100mL Basal培养基的250mL三角瓶里下静置培养4d。3000rpm、2min条件下离心收集藻，用无菌ddH₂O洗涤一次后重悬。

(2)玉米淀粉的制备

称取10g玉米淀粉装入50mL离心管中，加入无水乙醇震荡混匀后静置5min，4000rpm离心去上清，重复一次；加入无菌ddH₂O震荡混匀后静置5min，4000rpm离心去上清，重复一次；加入75％的乙醇定容至50mL，室温静置3d。使用时用适量无菌ddH₂O洗涤三次，彻底去除乙醇。

(3)混合玉米淀粉和雨生红球藻培养

将400个藻细胞混合100mg玉米淀粉均匀铺在90mm一次性培养皿中，风干后用封口膜包裹，在光照培养箱中约10μmol·m^-2·s^-1、20℃下静置培养，15d后统计细胞存活率。

对照组不使用玉米淀粉，其余条件均相同，制作三个平行。

对照组的藻细胞存活率约为1.17±0.67％，而实验组约为54.2±4.58％，提高了约46倍，如图3所示。

实施例3雨生红球藻Flotow NIES-144在TAP固体培养基上对Hyg的抗性

(1)雨生红球藻的培养

同实施例2中(1)。

(2)含目标基因的农杆菌活化

分取800μL冻存的野生型LBA4404和含pCam-GFP质粒LBA4404菌液接种在含50μg/mL Rif和Str的10mL YEB培养基里，180rpm、28℃下培养约15h至OD₆₀₀为0.2。8000g、1min离心收集400μL菌体，用无菌ddH₂O洗涤后再用600μL含15μM AS的液体TAP(pH 5.2)重悬，于24℃、180rpm下诱导4h。

(3)藻菌共培养

调节细胞密度，将2×10⁶个细胞混合100mg玉米淀粉后均匀铺在含1％Agar的TAP固体平板上，风干后在5μmol·m^-2·s^-1、20℃下静置培养2d。将600μL菌体均匀铺在前述预培养雨生红球藻的平板上，静置15min后风干，再于5μmol·m^-2·s^-1、22℃下倒置培养2d。

(4)雨生红球藻筛选

用含750μg/mL Cef的ddH₂O将共培养后的藻洗脱下来，3000rpm离心2min，小心吸取上层菌悬液弃去，重复约2-3次至上层液体变为清液，静置0.5h，去上清，将5×10⁵个藻细胞混合100mg玉米淀粉平铺在1％Agar平板上，Hyg浓度分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8和9μg/mLHyg，于20℃下先在5μmol·m^-2·s^-1下倒置培养一周，再在约10-15μmol·m^-2·s^-1倒置培养4-5周。

共培养时涂布野生型农杆菌组在0-4μg/mL Hyg的平板上可见有藻落生长，在5-9μg/mL Hyg的平板上藻落完全死亡；共培养时涂布含pCam-GFP质粒的农杆菌组在在0-4μg/mLHyg的平板上可见有藻落生长，在5-7μg/mL Hyg的平板上可见有单藻落长出，在8-9μg/mLHyg的平板上藻落完全死亡。

表1 雨生红球藻对不同浓度Hyg的抗性表现

表1表中“+”表示有藻落或单克隆长出，“－”表示没有藻落或单克隆长出。

实施例4不同pH下雨生红球藻Flotow NIES-144的基于PCR鉴定eGFP基因的转化率

(1)雨生红球藻的培养同实施例2中(1)。

(2)含目标基因的农杆菌活化

使用含pCam-GFP质粒的农杆菌LBA4404菌株，只是使用pH分别为7.0、5.8、5.6、5.4、5.2、5.0六组不同pH的诱导剂TAP，其余操作条件均相同(AS浓度15μM)且与参照实施例3中(2)。

(3)藻菌共培养同实施例3中的(3)。

(4)雨生红球藻筛选

筛选使用的TAP平板含5μg/mL Hyg，其余条件与实施例3中的(4)相同。

(5)雨生红球藻eGFP基因的PCR鉴定

分别以转基因雨生红球藻和野生型藻(作为阴性对照，WT)为模板，使用eGFP-F和eGFP-R组成的引物对(如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)检测eGFP基因。

eGFP-F(SEQ ID No.3)：5'-AAGGACGACGGCAACTACAAGACC-3'；

eGFP-R(SEQ ID No.4)：5'-CACGAACTCCAGCAGGACCATG-3'。

取5μL PCR物进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察。

结果表明：在转基因雨生红球藻中均可以PCR扩增获得eGFP基因的目标片段(372bp)；在野生型雨生红球藻中没有目标条带。

经实验pH的有效使用范围为5.2-5.6，而在其余条件不能获得转化子。实验统计结果如图4所示。

实施例5不同AS浓度下雨生红球藻Flotow NIES-144的基于PCR鉴定eGFP基因的转化率

(1)雨生红球藻的培养同实施例2中(1)。

(2)含目标基因的农杆菌活化

使用含pCam-GFP质粒的农杆菌LBA4404菌株，只是使用分别为0μM、7.5μM、15μM、30μM、50μM、100μM、200μM共七组不同浓度AS的诱导剂TAP，各组其余操作条件完全相同(pH＝5.2)且同实施例3中(2)。

(3)藻菌共培养同实施例3中的(3)。

(4)雨生红球藻筛选同实施例4中的(4)。

(5)雨生红球藻eGFP基因的PCR鉴定同实施例4中的(5)。

经实验AS的有效使用范围为0-30μM，而在其余条件不能获得转化子，具体统计结果如图5所示。

实施例6雨生红球藻Flotow NIES-144转化子的HptⅡ和eGFP基因的PCR鉴定

(1)雨生红球藻的预培养同实施例2中(1)。

(2)含目标基因的农杆菌活化

使用含pCam-GFP质粒的农杆菌LBA4404菌株，其余同实施例3中(2)。

(3)藻菌共培养同实施例3中的(3)。

(4)雨生红球藻筛选同实施例4中的(4)，筛选使用的TAP平板含5μg/mL Hyg。

(5)雨生红球藻Hpt II和eGFP基因的PCR鉴定

Hpt II基因的PCR鉴定：分别以转基因雨生红球藻和野生型藻(作为阴性对照，WT)为模板，使用HptⅡ-F和HptⅡ-R组成的引物对(如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)检测HptⅡ基因。

HptⅡ-F(SEQ ID No.1)：5'-GTGTCACGTTGCAAGACCTG-3'

HptⅡ-R(SEQ ID No.2)：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'

取5μL PCR物进行1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察。

eGFP基因的PCR鉴定同实施例4中的(5)。

结果表明：在转基因雨生红球藻中均可以PCR扩增获得HptⅡ基因的目的片段(407bp)和eGFP基因的目的片段(372bp)；转化结果如图6所示，W为野生型对照，T1-3为转化子平板；图7为对经复筛后的10株转化子进行Hyg和eGFP基因进行PCR鉴定结果，条带分别为407bp和372bp，T为阳性对照，W为阴性对照，M为Marker，1-10为转化子。其中1-5为批次1获得的转化子PCR结果图，6-10为批次2中获得的转化子的PCR结果图，两个批次的鉴定结果显示了较好的重复性。

经三次重复上述最优条件下的实验过程，计算平均转化率约为42±17个/10⁶个藻细胞。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，例如，将发明使用的藻株替换为其他具有相同或相似生长周期的藻株，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用农杆菌介导对雨生红球藻NIES-144进行基因转化的方法，该方法包括将已转化质粒的农杆菌与待转化雨生红球藻NIES-144共培养的步骤，其特征在于，在共培养前还包括对所述农杆菌进行活性诱导的步骤，对所述农杆菌进行活性诱导是在pH 5.2-5.6、0-30μM AS的培养环境下进行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述农杆菌进行活性诱导是在pH 5.4、7.5μM AS的培养环境下进行。

3.如权利要求1～2任一项所述的方法，其特征在于，所述共培养的光照强度为0-10μmol·m^-2·s^-1。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述共培养的光照强度为5μmol·m^-2·s^-1。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述共培养的pH值为5.2-5.6。

6.如权利要求1～2任一项所述的方法，其特征在于，在共培养后还包括在固体培养基上筛选转化子的步骤，共培养后的藻细胞在含增稠剂溶液环境中铺平板到所述固体培养基上进行转化子筛选。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述增稠剂为淀粉，使用量为每平方厘米培养基上0.39-2.36mg淀粉。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，筛选转化子分两阶段培养，第一阶段为弱光阶段，光照强度为0-5μmol·m^-2·s^-1条件下培养7天，第二阶段为强光培养，在5-10μmol·m^-2·s^-1培养30-35天。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述转化子使用潮霉素抗性选择标记，筛选转化子使用的潮霉素浓度为5-7μg/mL。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括转化子鉴定的步骤。

11.如权利要求1～2任一项所述的方法，其特征在于，在共培养前还包括雨生红球藻NIES-144活化和预培养的步骤，所述预培养的光照强度为0-10μmol·m^-2·s^-1。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述预培养是将活化后的藻细胞在含增稠剂的溶液环境中铺平板到固体培养基上进行培养。

13.权利要求1～12任一项所述的方法在制备转基因雨生红球藻NIES-144中的应用。