CN112159788B

CN112159788B - 一种海杆菌属菌株

Info

Publication number: CN112159788B
Application number: CN202011275651.3A
Authority: CN
Inventors: 徐继林; 凌婷; 曹嘉懿; 周成旭; 严小军
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2020-11-16
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2040-11-16
Also published as: CN112159788A

Abstract

本发明提供一种海杆菌属菌株及其筛选方法和应用，该菌株从几种重要饵料微藻藻液中均得到分离，可促进假微型海链藻、微拟球藻等重要饵料微藻的生长。本发明所提供的海杆菌NBU‑A‑0002株，其保藏编号为CCTCC M 2020448。本发明所筛选获得的海杆菌属菌株能促进假微型海链藻和微拟球藻的生长，从而有效扩大假微型海链藻和微拟球藻的产量，满足假微型海链藻和微拟球藻作为饲料的要求。

Description

一种海杆菌属菌株

技术领域

本发明属于共生菌筛选技术领域，具体涉及一种海杆菌属菌株。

背景技术

国内外学者在贝类培育过程中均发现，目前还没有人工配合饵料能够应用于滩涂贝类的苗种繁育，即使使用微藻干粉或者冷藏储存的微藻，其效果也远远不及活体微藻(Espinosa et al.,2006)，所以在实际贝类苗种繁殖生产中，只有新鲜培养的活体微藻细胞才是贝类苗种培育的唯一饵料选择。其中饵料效果较好的微藻主要包括球等鞭金藻、假微型海链藻、角毛藻等。

目前，国内外对这些饵料微藻的培养影响因素研究聚焦于光照、盐度、温度等环境因素，培养基均是针对微藻营养需求的有机和无机营养成分，但即使尽量控制适合的环境条件和营养条件，实际大规模露天繁殖过程中，微藻的最高繁殖密度依旧不够高，非常容易衰败，不能满足贝类规模化苗种繁育的饵料需求。

研究表明，藻际细菌对微藻扩繁有着重要的影响。例如，噬纤维菌(Cytophagasp.)可通过直接攻击的方式抑制硅藻和鞭毛藻的扩繁(Imai et al.,1993)，亚硫酸杆菌(Sulfitobacter sp.)却可以通过分泌吲哚乙酸来促进硅藻的繁殖(Amin et al.,2015)。而目前实际微藻扩繁技术均没有考虑藻际细菌的影响。因此，如何从筛选促进微藻生长的藻际细菌具有一定的研究价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种海杆菌属菌株及其筛选方法和应用，该菌株从几种重要饵料微藻藻液中均得到分离，可促进假微型海链藻、微拟球藻等重要饵料微藻的生长。

本发明所提供的海杆菌属菌株，命名为海杆菌(Marinobacter sp.)，菌株编号NBU-A-0002，其保藏编号为CCTCC M 2020448，保藏日期为2020年8月26日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为武汉、武汉大学。

本发明所提供的海杆菌属菌株，是从假微型海链藻和微拟球藻藻液中筛选获得的；

本发明的海杆菌属菌株用于培养假微型海链藻和微拟球藻。

本发明所筛选获得的海杆菌属菌株能促进假微型海链藻和微拟球藻的生长，从而有效扩大假微型海链藻和微拟球藻的产量，满足假微型海链藻和微拟球藻作为饲料的要求。

附图说明

图1是海杆菌(Marinobacter sp.)的菌落形态图；

图2是不同培养方法对假微型海链藻和微拟球藻生长的影响图。

具体实施方式

以下结合实施案例对本发明进行详细的描述。

实施例1：共生菌株的筛选

本发明的菌株于2018年10月从假微型海链藻和微拟球藻培养液中分离并筛选获得。菌株分离方法如下：将假微型海链藻和微拟球藻培养液稀释后涂布于2216E固体培养基，培养条件为28℃，避光，倒置培育1周左右，可得到不同种类、形态、大小的单克隆菌落。挑取分离程度高、边界清晰、形态多样的单克隆菌落，转移至新的2216E固体培养基上，通过多次细菌三区划线法得到纯化后的菌株。将纯化后的菌株接种到2216E液体培养基中，放置于震荡培养箱培养，培养条件为28℃，避光，转速为220r·min^-1，12h后可得对数期菌液，添加甘油保存于-80℃冰箱。

将无菌纯化的假微型海链藻、微拟球藻和分离获得的藻际细菌分别培养至指数生长期。将假微型海链藻、微拟球藻藻液按每份50mL分装至100mL无菌锥形瓶中。将各扩摇菌液13000rpm，低温离心10min收集并用宁大三号海水培养基清洗三次以去除2216E液体培养基。按藻菌细胞密度比1:50的比例，向假微型海链藻、微拟球藻培养液中分别加入不同的藻际细菌，每组设置三个平行，添加宁大三号海水培养基作为对照组。以假微型海链藻、微拟球藻叶绿素a浓度为指标，分析各藻际细菌对假微型海链藻和微拟球藻生长的影响。最终筛选获得了一株对假微型海链藻和微拟球藻的生长具有明显的促进作用的菌株。

实施例2：筛选的共生菌株的鉴定及理化性质

对筛选的共生菌株16S rDNA进行扩增，具体步骤如下：

1)PCR扩增：通用引物27F和1492R进行PCR扩增，27F序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R序列为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系为：Mix(dNTP、酶、Mg²⁺、10×buffer)12.5μL，27F引物0.5μL，1492R引物0.5μL，菌液模板0.5μL，无菌水11μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，32个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。

2)凝胶电泳及PCR产物割胶回收：PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)对目的PCR产物进行回收纯化。

3)PCR产物连接T载体及感受态细胞的转化：将回收的DNA片段与pMD18-T载体进行连接，连接体系如下：pMD18-T Vector，1μL；DNA片段，1μL；ddH₂O，3μL；Solution 1，5μL；总共10μL。反应条件：16℃连接30min。将10μL连接产物与100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴放置30min。放入42℃水浴中加热90s后，再在冰中放置2min。加200μL LB培养基，37℃振荡培养1h。取100μL转化后的大肠杆菌涂布与含氨苄青霉素的LB固体培养基，培养过夜，直至长出单菌落。

4)阳性菌落鉴定及测序：挑取10-20个单菌落，并加入新鲜的LB液体培养基，放置于震荡培养箱培养。培养条件为28℃，避光，转速为220r·min^-1。以菌液为模板，引物M13-F(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13-R(5′-CACACAGGAAACAGCTATGAC-3′)进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增程序同上。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测进行PCR产物鉴定，2kb左右的电泳条带视为阳性菌落即连接载体成功，并取连接成功的相应菌液进行16S rRNA全长测序。

测序序列结果为SEQ ID NO:1：

cttgcatgcctgcaggtcgacgattagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcggtaacagggggtgcttgcaccccgctgacgagcggcggacgggtgagtaatgcataggaaactgcccagtagtgggggatagcccggggaaacccggattaataccgcgtacgcccttcgggggaaagcaggggatcttcggaccttgcgctattggatgtgcctatgtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatccgtagctggtctgagaggatgatcagccacatcgggactgagacacggcccgaactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggctttcgggttgtaaagcactttcagtgaggaggaaaactctgcgactaatactcgtagggcttgacgttactcacagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgataagcgagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaacggcatttcgaactgtcaggctagagtatggtagagggtagtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcggctacctggaccaatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctactagccgttgggactcttgaagtcttagtggcgcagctaacgcactaagtagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgacgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgcagagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatggccgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccctatccctagttgctagcagttcggctgagaactctagggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaggtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtgcgcacagagggctgcaaacccgcgagggggagccaatctcacaaaacgcatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtgaatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtggattgcaccagaagtggttagtctaaccttcgggaggacgatcaccacggtgtggttcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaaatctctagaggatccccgggtaccgagctcgaatcg

对所测得的16S rDNA序列进行同源性比较与系统发育学分析，在NCBI上进行Blast比对，找到同源性序列并利用MEGA5软件建立系统发育树。根据Blast比对和系统发育学分析结果，本发明的菌株属于变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、海杆菌属(Marinobacter)中的一种,命名为海杆菌(Marinobacter sp.)NBU-A-0002株，其保藏编号为CCTCC M 2020448，保藏日期为2020年8月26日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为武汉、武汉大学。

该菌株生物学特性如下：杆状，菌落呈圆形，不透明米白色，表面湿润光滑，挑起呈粘稠状，革兰氏阴性菌(图1)。

实施例3：海杆菌属菌株在促进假微型海链藻、微拟球藻繁殖中的应用

首先制备藻菌扩培液，组成如下：100mg/L KNO₃、10mg/L KH₂PO₄、3mg/L Fe-citrate·5H₂O、0.6g/L红糖、6μg/L VB₁、0.05μg/L VB₁₂。

然后在100mL玻璃锥形瓶中，加入50mL上述灭菌的藻菌扩培液，加入100μL OD₆₀₀＝0.4～0.6的活化后的海杆菌NBU-A-0002株，接入1mL藻细胞密度为10⁶cell/mL的假微型海链藻、微拟球藻藻种，混合均匀后，置于25℃、光强4000Lux、光照周期光/暗(12h/12h)的光照培养箱中培养。共培养时间为10天，每两天通过检测藻细胞叶绿素a的含量评估细菌对藻生长密度的影响(图2)。

为比较上述扩繁方法扩繁的功效，在100mL玻璃锥形瓶中，分别使用本发明中的藻菌扩培液、本发明中的藻菌扩培液并添加非藻际分离的，从海洋微生物菌种保藏管理中心(http://mccc.org.cn/)购买的海杆菌；以及本发明中的藻菌扩培液并添加海杆菌NBU-A-0002株进行培养，每一培养组设三个平行，接种密度为2×10⁴cell/mL，每天用血球计数板对培养密度进行计数。

培养结果表明(图2)，假微型海链藻、微拟球藻在藻菌扩培液并添加本发明中筛选的海杆菌组中，藻细胞的叶绿素a含量从共培养的第4天开始均显著高于对照组，共培养的第十天叶绿素a含量约达到对照组的两倍，说明本发明中筛选的海杆菌促进假微型海链藻和微拟球藻扩繁的效果随培养时间的延长而更显著。此外，在共培养的第十天添加本发明中筛选的海杆菌组仍始终维持高密度培养。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种海杆菌属菌株

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 海杆菌(Marinobacter sp.)

<400> 1

cttgcatgcc tgcaggtcga cgattagagt ttgatcatgg ctcagattga acgctggcgg 60

caggcttaac acatgcaagt cgagcggtaa cagggggtgc ttgcaccccg ctgacgagcg 120

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cgtagctggt ctgagaggat gatcagccac atcgggactg agacacggcc cgaactccta 360

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ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag 600

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actttccaga gatggattgg tgccttcggg aactctgaca caggtgctgc atggccgtcg 1080

tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc ctatccctag 1140

ttgctagcag ttcggctgag aactctaggg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg 1200

gggatgacgt caggtcatca tggcccttac ggccagggct acacacgtgc tacaatggtg 1260

cgcacagagg gctgcaaacc cgcgaggggg agccaatctc acaaaacgca tcgtagtccg 1320

gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgt gaatcagaat 1380

gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtggat 1440

tgcaccagaa gtggttagtc taaccttcgg gaggacgatc accacggtgt ggttcatgac 1500

tggggtgaag tcgtaacaag gtaaccgtaa atctctagag gatccccggg taccgagctc 1560

gaatcg 1566

Claims

1.一种海杆菌属（Marinobacter sp.）菌株，其特征在于，所述的菌株的保藏编号为CCTCC M 2020448。

2.权利要求1所述的海杆菌属菌株在培养饵料微藻中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的饵料微藻，为假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）或微拟球藻（Nannochloropsis sp.）。