CN109517756B - 一株海洋解磷巨大芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株海洋解磷巨大芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株海洋解磷巨大芽孢杆菌及其应用。该菌于2018年1月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018056。该菌能够进行磷酸盐的降解，以植酸钠为唯一磷源时其溶磷量约为117.14mg/dl，通过高效地降解沉积物环境中的磷酸盐等物质，从而促进生态系统中磷元素的高效循环，并增加沉积环境中的可获的磷量；还能够能够较好的促进红树植物秋茄的生长，提高整个生态系统的生产力，可以加速生态系统的修复；该菌为无毒，从而可以进一步应用于微生物功能微生物菌剂的研发，具有助力红树林生态系统保护和修复中的巨大潜力，具有较好的市场前景、经济效益和生态效应。

Description

一株海洋解磷巨大芽孢杆菌及其应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株海洋解磷巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)SCSIO 43701及其应用。
背景技术：
植物促生菌(Plant Growth Promoting Bacterium，PGPB)是指能够通过提高营养可获得量、产生激素和抑制植物有害微生物来有效地促进植物生长和产量的一类细菌；最常见的PGPR种类：农杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、圆褐固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克氏菌属(Burkholderia)、柄细菌属(Caulobacter)、色素细菌属(Chromobacterium)、欧文氏菌属(Erwinia)、产黄菌属(Flavobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和沙雷氏菌(Serratia)(Bhattacharyya and Jha,2012；RufusJ.Akinrinlola,2018)，植物促生菌一方面通过直接提供营养物质、植物激素来直接促进植株的生长，可以通过抑制植物病原菌的作用而促进植株体的生长(Ahemad and Kibret,2014)；并且可以在一定程度有效地改善底质的情况。基于植物促生菌剂的作用将直接促进植物生长的根际细菌分为三类，具体为生物肥料，植物刺激剂和根际介导物(Lugtenbergand Kamilova,2009)。
由于自然环境中很多沉积物中的可溶磷浓度比较低，相应的生产力主要受到磷限制。而植物仅以两种不同的可溶形式吸收磷元素，如一元(H2PO4 -)或二元(HPO4 2-)离子。而环境中的磷通常以磷酸钙盐的形式存在于环境中，不能被植物所直接吸收和利用，传统农业上对底质中氮磷钾的不足通过使用磷肥来解决。磷肥进去土壤后，由于淋失、挥发或者土壤中的Ca+、Fe3+、Al3+等离子结合形成难容的磷酸盐，作物不能较好的吸收，导致磷肥的利用率只有20％左右。溶磷是植物促生菌的一个重要特性，即能够将不能溶解的磷酸盐转化为可溶解磷(Lugtenberg and Kamilova,2009)，具有这类功能的菌能够产生一些酶，如磷酸酶、植酸酶和有机酸，以溶解不同来源如岩石磷酸盐等来源的磷。芽孢杆菌是一类重要的植物促生菌，其能够产生具有较强抗性、在恶劣的储存和环境条件下都具有较高生存率的内生孢子；其还能够分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质等，如有机酸类等物质溶解土壤中作物不易吸收的钙磷、铁磷、铝磷等化合物，促进土壤中无效磷的溶解及利用。巨大芽孢杆菌是发现最早、溶磷效果最好且在农业上应用面积最为广泛的菌株之一，能够较好的促进植物的生长、提高光合作用速率以及提高环境中可获得性磷的浓度(Han and Lee,2006)。
红树林生态系统是位于热带和亚热带海岸线的湿地，具有较高的生产力和生物多样性，是很多海洋生物的重要栖息地，如一些无脊椎动物，鸟类和哺乳动物等，是可以防止潮汐和海啸的天然屏障以及蓝色碳库的重要组成，所以在全球的碳素循环过程中发挥着重要的作用(Dahdouh-Guebas et al.,2005；Bouillon et al.,2008)。目前全球范围内，红树林生态系统受到严重的破坏，面积缩减了30％以上。另外，由于红树林沉积物环境中富含有机质，溶解和颗粒养分含量极低，红树林生态系统中的沉积物一般都受到营养限制，红树植物的生长和生态系统的修复在一定程度上受到抑制；Luo和Gu(2018)发现一些红树林处于该生态系统中的沉积物可能是磷限制状态，从而说明了解磷菌在该生态系统中的中重要性。对于不同的植物而言，植物促生菌能够有效地促进植物生长达500％并且产量增加57％(Kloepper et al.,1980；Asghar et al.,2004；Khalid et al.,1997)，如关于陆生植物上的报道已有很多，接种解磷巨大芽孢杆菌的黄瓜和辣椒实验组的枝条生长和根干重，分别增加8％-22％和27％及高达26％和29％，而目前关于海洋解磷巨大芽孢杆菌是深海来源的解磷菌在促生方面的研究报道还不是很多。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一株海洋解磷巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701，其于2018年1月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018056。
本发明的第二个目的是提供所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO43701在提高红树植物抗逆能力中的应用。
所述的红树植物优选为秋茄(Kandelia candel(Linn.)Druce)。
本发明的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701能够进行磷酸盐的降解，以植酸钠为唯一磷源时其溶磷量约为117.14mg/dl，该菌的生态效应即对红树植物的促生效果研究表明：与对照组相比，添加巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO43701菌液的实验组在叶片数量、株高、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素以及PSII原初光能转化效率FV/FM分别提高366.04％、62.59％、4.1％、1.59％、11.9％和0.91％，这些数据充分证实了巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701能够较好的促进红树植物的生长，具有较好的生态效应。该菌株可以通过生物固氮作用提供氮素，同时溶解环境中难以溶解的磷酸盐等为可溶性磷元素供给红树植物，促进红树植物的生长接种实验证实其能够较好的促进红树植物秋茄的生长。
因此，本发明的第三个目的是提供巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO43701在将难以溶解的磷酸盐转化为可溶解磷中的应用。
本发明的第四个目的是提供巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701在制备解磷菌肥中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种解磷菌肥，以所述的巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)SCSIO 43701作为活性成分。
本发明的第六个目的是提供巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701在促进红树植物生长中的应用。
所述的红树植物优选为秋茄(Kandelia candel(Linn.)Druce)。
本发明的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701通过高效地降解沉积物环境中的磷酸盐等物质，从而促进生态系统中磷元素的高效循环，并增加沉积环境中的可获的磷量；还能够较好的促进红树植物秋茄的生长，提高整个生态系统的生产力，可以加速生态系统的修复。
根据《微生物肥料生物安全通用技术准则(NY1109-2006)》对巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)SCSIO 43701进行中急性毒性剂量分级标准判定该菌为无毒，从而可以进一步应用于微生物功能微生物菌剂的研发，具有助力红树林生态系统保护和修复中的巨大潜力，具有较好的市场前景、经济效益和生态效应。
因此，本发明的第七个目的是提供巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO43701在红树林生态系统的保护和修复中的应用。
本发明的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701能够进行磷酸盐的降解，以植酸钠为唯一磷源时其溶磷量约为117.14mg/dl，通过高效地降解沉积物环境中的磷酸盐等物质，从而促进生态系统中磷元素的高效循环，并增加沉积环境中的可获的磷量；还能够能够较好的促进红树植物秋茄的生长，提高整个生态系统的生产力，可以加速生态系统的修复；该菌为无毒，从而可以进一步应用于微生物功能微生物菌剂的研发，具有助力红树林生态系统保护和修复中的巨大潜力，具有较好的市场前景、经济效益和生态效应。
本发明的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701于2018年1月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018056。
附图说明：
图1是巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701的16S rDNA的系统进化发育树；图中的SCSIO 43701表示巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701的分离、纯化和鉴定
用于分离微生物的深海样品为来源于南海北部的深海样品(2011年)，采集具体深度为：3928m；站点为118°30.989E，18°5.255N；采用的分离培养基为稀释的10％的221E培养基：具体成分为蛋白胨0.1g、酵母提取物0.5g、FePO4 0.01g、(NH4)2SO4 0.4g、CaCO3 0.1g、琼脂12g和海水1000mL，pH 7.2-7.4。称取0.2g沉积物样品至18mL灭菌海水，分别稀释成10-1、10-2、10-3 3个稀释度，涂板，待有明显菌落长出后，转接涂布直至到单一菌。由此分离、纯化得到菌株SCSIO 43701。
1.1巨大芽胞杆菌SCSIO 43701的形态学和分子生物学鉴定
通过革兰氏染色和镜检等，结果显示菌株SCSIO 43701为杆状菌，奶黄色，菌落圆形且大，表面光滑，革兰氏阳性菌，好氧菌；根据《常见细菌鉴定手册》中，革兰氏阳性好养和兼性厌氧球菌及芽孢杆菌属与类芽孢杆菌属鉴定方法，关于碳源利用，能够高效地利用D-葡萄糖、麦芽糖和半乳糖，淀粉酶和乙酰胺氧化酶阳性，并且能够生成吲哚，福格斯-普里斯考尔(Voges-Proskauer)反应阳性。
通过生长曲线发现，该溶磷菌(即菌株SCSIO 43701)在培养10h时候进入对数生长期而在22h左右进行平台期间。在生理生化水平上，菌株SCSIO 43701与标准菌株巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium NBRC 15308T相比，两者之间还存在差异，如催化酶活性、氧化酶活性、V-P的反应、硝酸盐还原，以及碳源甘露醇、蔗糖和木糖的利用等(表1)。
表1菌株SCSIO 43701与标准菌株
Figure BDA0001882161550000061
Figure BDA0001882161550000071
注：+为阳性，-为阴性，ND为Not Determined
1.2巨大芽孢杆菌SCSIO 43701的分子生物学鉴定
将菌株SCSIO 43701接种于液体LB培养基(液体LB培养基具体成分为：蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 25g和去离子水1L)中过夜培养后，培养混浊，吸取约1mL液体离心后，使用细菌DNA提取试剂盒：
Figure BDA0001882161550000073
Bacterial DNA Kit D3350-02(Omega Bio-Tek公司)提取菌株SCSIO 43701的基因组DNA，以纯化后的基因组DNA作为模板，采用细菌16S通用引物27F/1492R(Weisenburg et al.,1991，16S ribosomal DNA amplification forphylogenetic study,Journal of bacteriology，1991173(2):697-703)进行PCR扩增，PCR反应体系如表2所示。
表2菌株SCSIO 43701的16S rDNA PCR反应体系
Figure BDA0001882161550000072
PCR反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃40s，共30个循环；后延伸72℃10min，反应结束后，取4μL PCR反应产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，若有单一目的条带的出现，则将剩余的PCR产物直接交与华大基因用ABI Prism 3730XLDNA分析系统测序，并将测序分析得到的16S rDNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，在EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)对其种属鉴定进行初步的确定，建立系统发育树，系统发育树如图1所示，从系统发育树可以看出与菌株SCSIO 43701的16S rDNA序列具有较近亲缘关系的序列来自于B.megaterium NBRC 15308，在DNA分子水平上，相似性为99.38％。
综合以上形态学、生理生化和分子生物学鉴定结果，菌株SCSIO 43701属于芽孢杆菌属的新种，命名为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)SCSIO 43701，该菌于2018年1月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018056。
实施例2：巨大芽胞杆菌SCSIO 43701的有机磷降解活性测定
巨大芽胞杆菌SCSIO 43701的解磷活性实验检测采用的方法为钼锑抗显色法，挑取单菌落接种到含有100mL改良选择性液体固氮培养基(改良选择性液体固氮培养基具体成分为：FeSO4·7H2O 0.001g、KCl 0.56g、MgCl2·6H2O 4.00g、NaCl 25.00g、MgSO4·7H2O4.80g、K2HPO4 0.01g、Tris 0.48g、蛋白胨4.00g、酵母提取物2.00g、甘油2.00mL和去离子水1.00L，pH 8.10，固体培养基加入18.00g琼脂)的锥形瓶中，设置实验组和对照组，其中实验组接种1％的菌液而对照组接种1％的无菌水，置于28℃，180rpm培养24h后，以1％的接种量转接到含有100mL改良性解磷培养基PSM(改良性解磷培养基PSM具体成分为：D-葡萄糖15.00g、NH4NO3 5.00g、CaCl2 2.00g、KCl 0.50g、MgSO4·7H2O 0.50g、FeSO4·7H2O 0.01g、Mn SO4·7H2O 0.01g、植酸钠4.00g、NaCl 25.00g和去离子水1.00L，pH 8.15，固体培养基加入18.00g琼脂)的锥形瓶中，28℃，180rpm培养7d；培养7d后测得对照组中水中总磷的含量为940mg/L，实验组中总磷的含量为1760mg/L，与对照组相比水中总磷增加了87％，解磷能力为以植酸钠为唯一磷源时其溶磷量为117.14mg/dl。
实施例3：巨大芽胞杆菌SCSIO 43701用于毒性鉴定实验
本实验在广东省微生物分析检测中心完成。挑取巨大芽胞杆菌SCSIO 43701的单菌落接种于改良选择性液体固氮培养基(改良选择性液体固氮培养基的配方同实施例2)中30℃培养3天，用生理盐水将菌液浓度调整为2.0×108～2.0×109cfu/mL，试验用的KM品种SPF级小白鼠20只，雌雄各半，其生长环境为室温24-28℃，相对湿度为(40-70)％，群笼饲养，10只/笼。
毒性检测实验的具体方法严格按照《微生物肥料生物安全通用技术准则NY 1109-2006》，剂量为5580mg/kg·BW，按照限量法的要求，选取健康小白鼠20只，雌雄各半，分2组，实验前动物禁食6h，自由饮水，经口灌胃1次，灌胃量为0.12mL/20g·BW，灌胃后继续禁食2h，其后给予正常饮食，观察7天，每天观察一次，记录小鼠死亡情况，在连续观察的7d时间内，实验动物未见明显中毒体征，无动物死亡，所以按照《微生物肥料生物安全通用技术准则NY 1109-2006》中急性毒性剂量分级标准判定，该巨大芽胞杆菌SCSIO 43701属于无毒级别，因此可以应用红树植物的功能菌剂研制。
实施例4：解磷巨大芽胞杆菌SCSIO 43701在红树植物秋茄促生长的生态效应
将巨大芽胞杆菌SCSIO 43701接种到含有100mL改良选择性液体固氮培养基(改良选择性液体固氮培养基的配方同实施例2)锥形瓶中，28℃，180rpm震荡培养24h摇瓶发酵后，放入4℃冰箱作为接菌剂备用，接种时进行一定比例的稀释，实验用的红树植物为一年龄的红树植物秋茄(Kandelia candel(Linn.)Druce)，首先将其置于实验室内进行约为一周的适应性培养，浇灌盐度为20‰的人工海水；然后，实验组与对照组分别随机选取6株株高、株径和具有类似其他形态学特征的植株，进行实验，生态效应的验证实验为42天，菌株添加实验，对照组添加50mL去离子水而实验组添加50mL巨大芽胞杆菌SCSIO 43701菌液(终浓度为1×108CFU/mL)，实验开始时记录初始植株高度(与塑料盆开端水平为起点)，叶子数量，光合速率FV/FM，其后每7天记录一次株高(每次测3次取平均值)，叶子数量(带有嫩绿色或叶径少于1cm为新生叶子；其中包含新生叶子以及正常的叶子)；每15天记录一次光合速率FV/FM，每株植物随机选取5片叶子测试；实验结束后，观察记录植株的存活情况，计算各组存活率；随机选取4片叶子，每组共24片叶子，测定光合色素含量，叶片光合色素含量的测定按照《植物生理学实验指导》(孔祥生,2002)中的方法进行，计算公式如下所示：
Ca＝12.72A663-2.59A645(叶绿素a的浓度)
Cb＝22.88A645-4.67A663(叶绿素b的浓度)
叶绿素总浓度CT＝Ca+Cb＝20.29A645+8.05A633
Figure BDA0001882161550000101
Figure BDA0001882161550000102
式中C为色素含量(mg/L)；V为提取液的体积(mL)；N为稀释倍数；m为样品质量(g)；1000表示1L＝1000mL。
表3接种溶磷菌巨大芽胞杆菌SCSIO 43701对秋茄株高的影响
Figure BDA0001882161550000111
表4接种溶磷菌巨大芽胞杆菌SCSIO 43701对秋茄叶片增长的影响
Figure BDA0001882161550000112
整个生长周期中，对照组秋茄株高的增长高度为0.88±0.44cm，而实验组的增长高度为1.73±0.75cm，添加菌剂的实验组秋茄株高增长率为对照组的1.97倍，其为P＝0.12(P>0.05)，无显著性差异(表3)；但是相比实验组与对照的叶片增加量，对照组叶片数目增加了22.53％，而实验组叶片数目增加了75.79％，实验组与对照组之间具有显著性差异(P＝0.0009<0.05)(表4)。与对照组相比，实验组在叶片数量、株高、叶绿素a含量、叶绿素b含量、类胡萝卜素含量以及PSII原初光能转化效率FV/FM分别提高366.04％、62.59％、4.1％、1.59％、11.9％和0.91％，这些数据充分证实了巨大芽胞杆菌SCSIO 43701能够较好的促进红树植物的生长，具有较好的生态效应。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一株海洋解磷巨大芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1445
<212> DNA
<213> 巨大芽胞杆菌SCSIO 43701(Bacillus megaterium SCSIO 43701)
<400> 1
aacggcggtg ctataatgca gtcgagcgaa ctgattagaa gcttgcttct atgacgttag 60
cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggcaac ctgcctgtaa gactgggata acttcgggaa 120
accgaagcta ataccggata ggatcttctc cttcatggga gatgattgaa agatggtttc 180
ggctatcact tacagatggg cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240
aaggcaacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360
agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa 420
caagtacaag agtaactgct tgtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta 540
aagcgcgcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg 600
tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agagaaaagc ggaattccac gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc ggctttttgg tctgtaactg 720
acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcctc tgacaactct agagatagag cgttcccctt cgggggacag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcatttagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggatggtaca aagggctgca agaccgcgag gtcaagccaa tcccataaaa 1260
ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt ggagtaaccg taaggagcta gccgcataag 1440
ggacg 1445

Claims (8)

1.巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) SCSIO 43701，其保藏编号：CCTCC NO：M2018056。
2.权利要求1所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) SCSIO 43701在提高红树植物抗逆能力中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的红树植物为秋茄(Kandelia candel(Linn.) Druce) 。
4.权利要求1所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) SCSIO 43701在将难以溶解的磷酸盐转化为可溶解磷中的应用。
5.权利要求1所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) SCSIO 43701在制备解磷菌肥中的应用。
6.一种解磷菌肥，其特征在于，以权利要求1所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) SCSIO 43701作为活性成分。
7.权利要求1所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) SCSIO 43701在促进红树植物生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的红树植物为秋茄(Kandelia candel(Linn.) Druce) 。
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