CN107593769B - 巨大芽孢杆菌yjb3在促进植物生长和生防中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，属于植物保护领域。所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3具有溶磷、固氮、产嗜铁素等促进植物生长功能以及抑制植物病原菌的生防作用。利用植物内生菌YJB3菌液通过根际接种、喷雾或涂抹叶片处理或种子浸菌和浸根的方式，使内生菌定殖于植物体内或根际，提高所接种植物营养水平，提高抗病能力，增加植物生物量，促进植物生长。本发明操作简单、安全、经济，可降低农业生产中农药、化肥的使用量，减少农业面源污染，对改善农田土壤生态环境，提高农产品品质具有重要意义。

Description

巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用
技术领域
本发明属于植物保护领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用。
背景技术
由于过分追求农业产量，农药、化肥和地膜等农业化学品滥用，土壤生态环境遭到严重破坏，土壤环境受有机污染物和重金属严重污染，土壤肥力严重下降，导致农产品质量下降。居民普遍感到现在的农产品品质下降，甚至由于农产品污染，严重损害人体健康。研究发现植物内生菌系统地分布于植物的各个器官、组织的细胞和细胞间隙。某些土壤微生物在植物根际或根表面定殖后可以进入植物根系内部，然后迁移至其他器官。内生菌在与宿主植物长期协同发展过程中，彼此形成了相互依存、相互作用的生态学关系。植物内生菌在改善植物生长条件、提高植物对不良环境条件的抵御能力、减少病虫害、提高植物产量等方面具有重要有益生物学作用。
植物内生菌对宿主植物的促生作用可以分为直接促生作用和间接促生作用，内生菌可以通过分泌植物激素，溶解土壤中P、Fe等营养元素，固氮、拮抗植物病原菌以及缓解生物或非生物胁迫等方式促进宿主植物的生长发育，提高作物产量。研究表明沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、草螺菌属(Herbaspirillum)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)等不同种属的植物内生菌具有促生作用。内生菌还可以与病原菌竞争营养和生态位，或者直接产生抗菌活性物质如丁二醇、脂肽、氢氰酸(HCN)、生物表面活性剂或挥发性有机化合物(VOC)等抑制植物病原微生物，如杨树内生菌Bacillus pumilus JK-SX001产生甲苯可以防止杨树溃疡病。
植物内生菌定殖于植物体内，可以改善植物营养水平，提高植物抵御病虫害，可以减少农药化肥的使用，改善生态环境，提高农产品品质，具有广阔的应用前景。
发明内容
为了克服现在农业生产中过分依赖农药和化肥来提高农业产量的缺点与不足，响应国家关于化肥、农药零增长的规定，本发明的目的在于提供一种巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用。
所述的巨大芽孢杆菌YJB3具有溶磷、固氮、产嗜铁素等促进植物生长功能以及抑制植物病原菌的生防作用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3的保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2017年06月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017389。
所述的促进植物生长在于溶解无机磷Ca3(PO4)2、AlPO4、FePO4的能力为6.16～40.78mg/L，溶解有机磷卵磷脂的能力为80.35～108.26mg/L。
所述的促进植物生长在于固氮能力以固氮酶还原生产的乙烯量表示，所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3固氮酶活性为105.56～135.89nmol C2H4/(h·mL)。
所述的促进植物生长在于产嗜铁素的水平为69.72～96.86％。
对于产嗜铁素作用可作为抑菌剂抑制植物病原菌；具体为，可与植物病原菌争夺铁元素发挥抑菌作用。
所述的促进植物生长和生防在于巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3可以抑制植物病原菌丝核菌(Rhizoctonia solani)、壳球孢属(Macrophomina phaseolina)和镰刀菌属(Fusarium oxysporum)。
所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3菌液制备方法为：取斜面保藏B.megaterium YJB3菌种转接于100mL LB液体培养基中，30℃，120rpm摇床培养7～9h后，3000r/min离心收集菌体，然后悬浮于PBS溶液中，稀释至浓度为106～109CFU/mL的菌悬液并补充0.5～1.5g/L的醋酸钠为起始碳源。
将所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3按照浓度为106～109CFU/mL接种量为1～10mL接种于植物根际或喷雾或涂抹叶片方法接种处理促进植物生长。
所述的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3的接种方法还可以为：取颗粒饱满的植物种子，首先用5％次氯酸钠浸种消毒15～20min，然后用无菌去离子水冲洗2～3次，浸入含有浓度为106～109CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液中30～180min。
将植物幼苗根系浸入含有浓度为106～109CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液中30～90min。
所述的植物可以为用于土壤污染植物修复的东南景天、苜蓿、黑麦草、龙葵等，或者水稻、玉米、菜心、番茄等作物。上述植物的种子均可从市场上购买得到。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明提供一种植物内生菌Bacillus megaterium YJB3在促进植物生长和生防中的应用。利用植物内生菌B.megaterium YJB3菌液通过根际接种、喷雾或涂抹叶片处理或种子浸菌和浸根的方式，使内生菌定殖于植物体内或根际，提高所接种植物营养水平，提高抗病能力，增加植物生物量，促进植物生长。本发明操作简单、安全、经济，可降低农业生产中农药、化肥的使用量，减少农业面源污染，对改善农田土壤生态环境，提高农产品品质具有重要意义。
附图说明
图1是土培环境中巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3对DBP污染胁迫下菜心生物量的影响。
图2是土培环境中巨大芽孢杆菌(B.megaterium)YJB3对无DBP污染胁迫下菜心生物量的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所使用的LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl为10g，pH 7.5，水1000mL；培养基使用前先在121℃下高温灭菌20min。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然。培养基使用前先在121℃下高温灭菌20min。
磷酸缓冲液(PBS，g·L-1)：K2HPO4，1.44；KH2PO4，0.24；KCl，0.2；NaCl，8.0；pH 7.2。
实施例中所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3的保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2017年06月28日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017389。
实施例1
菌株B.megaterium YJB3溶磷能力定量测定方法参照Liu et al.(Liu,F.P.,Liu,H.Q.,Zhou,H.L.,et al.,2014.Isolation and characterization of phosphate-solubilizing bacteria from betel nut(Areca catechu)and their effects on plantgrowth and phosphorus mobilization in tropical soils.Biol.Fertile.Soils 50,927-937.)。
盐酸钼酸铵溶液：称取20g(NH4)6MoO24·4H2O溶于200mL去离子水，搅拌均匀后加入到425mL浓盐酸中，混匀后再加入50mL去离子水。
还原剂：称取15g NaHSO3溶于250mL去离子水，混匀后加入依次1.5g Na2SO4和0.5g1,2,4-氨基萘酚磺酸，然后定容至500mL，于4℃避光保存备用。
磷标准溶液：称取0.10975g重结晶KH2PO4溶解于0.1M HCl溶液中，定容至500mL。该溶液为50μg/mL磷标准溶液。
磷标准曲线的绘制：分别吸取磷标准溶液0、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0mL于50mL容量瓶中，加入2mL盐酸钼酸铵溶液，用0.1M HCl稀释至20mL，混匀。沸水浴加热2min，取出后立即加入1mL还原剂显色，冷却后用去离子水定容。用分光光度计测定660nm处吸光值。以吸光值OD660为纵坐标，磷浓度为横坐标绘制磷标准曲线。测定所述菌株YJB3溶解无机磷Ca3(PO4)2、AlPO4和FePO4的能力分别为6.16、21.87和40.78mg/L，溶解有机磷卵磷脂的能力为80.35～108.26mg/L。
实施例2
将菌株B.megaterium YJB3接种于Ashby固体培养基(无氮)(Kryuchkova,Y.V.,Burygin,G.L.,Gogoleva,et al.,2014.Isolation and characterization of aglyphosate-degrading rhizosphere strain,Enterobacter cloacaeK7.Microbiol.Res.169,99-105.)，30℃培养3d，观察其生长情况，有菌落长出为阳性。
固氮酶活性测定采用乙炔还原法，以nmol C2H4/(h·mL)表示固氮酶活性大小。
Figure BDA0001388150870000041
测定所述菌株YJB3固氮酶活性105.56～135.89nmol C2H4/(h·mL)。
实施例3
MM9盐溶液(g·L-1)：Na2HPO4 60，KH2PO4 3，NaCl 5，NH4Cl 10；
MKB(金氏培养基L-1)：K2HPO4 2.5g，MgSO4·7H2O 2.5g，酸解酪蛋白5g，甘油13mL，pH 7.2。
CAS(铬天青S)染液培养基：取2.7mg FeCl3·6H2O溶于10mL 10mM盐酸，将其加入到50mL 1.21mg·mL-1的铬天青溶液中，再将此溶液缓慢倒入40mL1.82mg·mL-1的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液中，不断搅拌，避免产生气泡，形成暗蓝色溶液，121℃高压灭菌20min。750mL去离子水中加入30.24g Pipes(哌嗪二乙醇磺酸)和100mL MM9盐溶液，用50％的NaOH调节溶液pH至6.8，琼脂15g，121℃高压灭菌20min。
产嗜铁素定量测定：将菌株B.megaterium YJB3接种于MKB液体培养基中，30℃，150rpm摇床培养3d，将培养液3000rpm离心5min取上清液，等体积加入CAS检测液(Payne,1994,Detection,isolation,and characterization of siderophores.MethodsEnzymol.235,329-344.)，充分混匀后静置1h，用去离子水调零，在630nm处测定吸光值(UV–2450，Shimadzu,Japan)(As)。空白培养基与CAS检测液等体积混匀为对照，以其630nm处吸光值作为参比值(Ar)，根据公式[(Ar–As)/Ar]×100％计算嗜铁素的相对含量。测定所述菌株产嗜铁素的水平为69.72～96.86％。
实施例4
平板对峙法测定抑菌活性，结果显示所述菌株YJB3能够抑制植物病原菌丝核菌(Rhizoctonia solani)、壳球孢属(Macrophomina phaseolina)和镰刀菌属(Fusariumoxysporum)。
所述的丝核菌(Rhizoctonia solani)、壳球孢属(Macrophomina phaseolina)和镰刀菌属(Fusarium oxysporum)均在文献“Bisht S,Pandey P,Kaur G,etal.Utilization of endophytic strain Bacillus sp.SBER3for biodegradation ofpolyaromatic hydrocarbons(PAH)in soil model system[J].European Journal ofSoil Biology,2014,60:67-76.”中公开。
在PDA平板中央接入直径为3mm的植物病原菌菌块，同时在距离中央2.5cm处划线接入巨大芽孢杆菌YJB3，28℃培养，以不接种菌株YJB3为空白对照。培养3d后，测定抑菌圈直径(mm)和对照处理菌落直径(mm)，并计算抑菌率，结果如表1所示。计算公式：抑菌率＝[(对照处理菌落直径-处理菌落直径)/对照处理菌落直径]×100％
表1菌株巨大芽孢YJB3对植物病原菌的抑制作用
植物病原菌 抑菌率(％)
丝核菌(Rhizoctonia solani) 41.9±0.12
壳球孢属(Macrophomina phaseolina) 36.5±0.07
镰刀菌属(Fusarium oxysporum) 58.3±0.21
实施例5
设定土壤中DBP浓度为100mg·kg–1(T100)。取部分土壤(约5kg)添加DBP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后装入栽培容器，缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megateriumYJB3菌种转接于100mL LB液体培养基中，30℃，120rpm摇床培养7h后，3000rpm离心3min，收集菌体，用PBS冲洗2～3次后，重悬得到菌悬液，调整菌体浓度为108CFU/mL，并补充1.0g/L的醋酸钠为起始碳源。将所述菌株YJB3按照接种量为5mL接种于菜心根际，每个处理重复3次，完全随机排列，结果表明接种所述菌株YJB3的处理使DBP污染条件下菜心绿宝(LB)地上部和根部生物量分别增加了29.2％和36.8％(鲜重)，菜心(HG)地上部和根部生物量分别增加了20.6％和45.5％(鲜重)(图1)。在无DBP污染条件下，接种所述菌株YJB3处理使菜心绿宝(LB)地上部和根部生物量分别增加了22.5％和30.3％(鲜重)；使菜心华冠(HG)地上部和根部生物量分别增加了38.9％和26.4％(鲜重)(图2)。
实施例6
将浓度为107CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3的菌悬液喷施水培植物番茄植株叶面，每4h喷施一次，连续喷施4次，并选择靠近植株顶端的幼嫩叶片。喷施前首先喷施无菌水冲洗植株叶片，并且待叶片水分风干后，再喷施菌液。培养液中DMP初始浓度为100mg/L，培养容器避光处理，在温室内培育50d后收获，分别测定植物地上部和根部生物量。相对于未接种植株，接种菌株YJB3使DMP污染胁迫下植株地上部和根部生物量分别增加了24.1％和13.6％(鲜重)；接种菌株YJB3，使无DMP污染胁迫下植株地上部和根部生物量分别增加了35.6％和22.9％(鲜重)。
实施例7
取颗粒饱满的黑麦草种子，首先用5％次氯酸钠浸种消毒20min，然后用无菌去离子水冲洗3次，浸入含有所述浓度为106CFU/mL的内生菌培养液中180min。让已经接种巨大芽孢杆菌YJB3黑麦草种子播种于含有DBP(初始浓度为100mg/kg)土壤中，该菌株YJB3通过植物种子途径定殖植物体内，在温室内培育45d后收获植物，分别测定植株地上部和根部生物量。结果表明，相对于未接种植株，接种所述菌株YJB3的处理，使黑麦草种子发芽了提高了18.2％，并使DBP胁迫下黑麦草植株地上部和根部生物量分别增加了25.2％和20.7％(鲜重)。接种菌株YJB3，使无DBP污染胁迫下植株地上部和根部生物量分别增加了37.6％和32.9％(鲜重)。
实施例8
设定土壤中DEHP浓度为100mg·kg–1。取部分土壤(约5kg)添加DEHP丙酮溶液，将其拌匀，即为污染母土，然后混入其余土壤中，搅拌均匀，待丙酮溶剂挥发完毕后装入栽培容器，缓慢滴灌加入自来水，保持田间持水量的60％，并遮光老化14d。取斜面保藏的B.megateriumYJB3菌种转接于100mL LB液体培养基中，30℃，120rpm摇床培养7h后，3000rpm离心3min，收集菌体，用PBS冲洗2～3次后，重悬得到菌悬液，调整菌体浓度为107CFU/mL，并补充1.0g/L的醋酸钠为起始碳源。将水稻幼苗根系浸入菌悬液内60min，然后移入土壤中，在温室内培育50d收获，接种所述菌株YJB3使DEHP污染胁迫下水稻地上部和根部生物量分别增加了16.2％和20.8％(鲜重)，使无DEHP污染胁迫下水稻地上部和根部生物量分别增加了32.5％和40.3％(鲜重)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)YJB3，于2017年06月28日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2017389。
2.根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
所述的促进植物生长在于溶解无机磷Ca3(PO4)2、AlPO4、FePO4的能力为6.16～40.78mg/L，溶解有机磷卵磷脂的能力为80.35～108.26mg/L。
3.根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
所述的促进植物生长在于固氮能力以固氮酶还原生产的乙烯量表示，所述的巨大芽孢杆菌YJB3固氮酶活性为105.56～135.89nmol C2H4/(h·mL)。
4.根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
所述的促进植物生长在于产嗜铁素的水平为69.72～96.86％。
5.根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
所述的促进植物生长和生防在于巨大芽孢杆菌YJB3抑制植物病原菌。
6.根据权利要求5所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
所述的植物病原菌为丝核菌(Rhizoctonia solani)、壳球孢属(Macrophominaphaseolina)和镰刀菌属(Fusarium oxysporum)。
7.根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
将所述的巨大芽孢杆菌YJB3按照浓度为106～109CFU/mL接种量为1～10mL接种于植物根际或喷雾或涂抹叶片处理促进植物生长。
8.根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
取颗粒饱满的植物种子，首先用5％次氯酸钠浸种消毒15～20min，然后用无菌去离子水冲洗2～3次，浸入含有浓度为106～109CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液中30～180min。
9.根据权利要求1所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
将植物幼苗根系浸入含有浓度为106～109CFU/mL的巨大芽孢杆菌YJB3菌悬液中30～90min。
10.根据权利要求1～9任一项所述的巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用，其特征在于：
所述的植物为东南景天、苜蓿、黑麦草、龙葵、水稻、玉米、菜心、番茄。
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