CN112940992B - 一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，菌剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，菌剂及其应用。该茶树内生细菌为大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)V4，该菌株在2021年1月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2021027。该茶树内生细菌具备IAA产生能力、ACC脱氨酶活性、固氮能力、溶磷能力及铁载体产生能力，从而改良土壤营养成分和吸收状况，促进植物吸收更多的营养物质，有效促进植物的生长。并且，该茶树内生细菌易培养，繁殖速度快，绿色有机无污染，可广泛应用于植物促生菌剂或微生物肥料的制备。

Description

一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，菌剂及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，菌剂及其应用。

背景技术

目前农药、化肥在农业的应用非常广泛，其可促进植物的生长发育与高产。然而，随着化肥的不断使用，导致土壤和食品中存在农药残留，对人类健康及生存环境构成威胁。因此，寻求高效健康的植物促生剂成为人们的特别关注点，微生物肥料与微生物菌剂应运而生，其可使土壤中无效营养有效化，控制农作物病害，减少农药和化肥的使用，并起到对植物的生长发育具有促进作用。

在目前的研究中，所用的植物促生菌株主要分离自植物或者环境本身，将其作为微生物肥料与菌剂应用于土壤中，具有安全、适应性强、持久的特点。中国发明专利申请CN104805045A公开了一种根际促生菌及其应用，该菌株具有固氮、解磷、产吲哚乙酸的促生特性，可以增加土壤养分，提高肥料有效性，促进植物对土壤养分吸收针对小麦具有显著的促生效果。中国发明专利CN109136137B公开了一种抗重金属的植物促生菌株及其应用，该植物促生菌株BHG-02能够分泌有机酸，溶解并利用培养基中的磷酸钙，同时具有ACC脱氨酶活性，生长激素IAA、脲酶活性等特性，溶解土壤中的重金属，解除植物的重金属胁迫，改良土壤养分状况，从而起到促进植物生长的作用。中国发明专利申请CN110484470A公开了一株多效植物促生菌及分离筛选方法，该多效植物促生菌具有解磷、产NH₃、产植物生长激素和产嗜铁素等功能，可应用于肥料和微生物接种剂中。

茶树是我国的重要经济作物，自古开门七件事，柴、米、油、盐、酱、醋、茶，可见茶在我们生活中的重要性。因此茶的品质逐渐被人们重视，人们对茶叶的选择逐渐倾向于无公害食品茶、绿色食品茶、有机茶即无农药和化肥残留的健康茶。因此，使用微生物肥料与菌剂代替已有人工合成的化肥与农药，既能促进茶树的生长发育与产量，又能保证茶叶的有机健康，将是茶树种植的重要前景。

Xiaomei等人(Yan，X.，Wang，Z.，Mei，Y.，Wang，L.，Wang，X.，Xu，Q.，Wei， C.(2018).Isolation，Diversity，and Growth-Promoting Activities of EndophyticBacteria From Tea Cultivars ofZijuan andYunkang-10.Front Microbiol，9，1848.)从紫娟和云抗10号两个密切相关的茶品种中分离出内生细菌，并比较了它们的多样性及植物生长促进(PGP)活性，确定了两个品种的优势群体或固氮属的植物生长促进活性。该研究团队从紫娟中获得了三个门类(变形杆菌，硬毛菌和拟杆菌)的共18个属的110个分离株；从云抗10号获得了两个门类 (变形菌门和厚壁菌门)的22个属的164个分离株。该研究表明，草螺菌属菌株(Herbaspirilum spp.)、甲基杆菌属菌株(Methylobacterium spp.)、短波单胞菌属菌株(Brevundimonas spp.)显示出了不同的植物促生能力，它们的植物促生能力按照草螺菌属菌株、短波单胞菌属菌株、甲基杆菌属菌株依次降低，并且大多数甲基杆菌属菌株都不具备固氮、解磷、产铁载体、产吲哚乙酸、ACC脱氨酶活性的植物促生特性。此外，该研究证实了茶树中的内生菌在不同季节和不同茶树品种中会不断变化，其中紫娟的植物促生细菌比云抗10号的丰富得多。然而，该研究虽然涉及了多种茶树内生细菌的分离鉴定以及植物促生能力比较，却未能实现茶树内生细菌在具体植物中的促生应用以及效果验证。

大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)是一种革兰氏阴性杆状细菌，其在制备异麦芽酮糖中得到了许多应用，例如中国发明专利CN101200750B，其公开了一种大黄欧文氏菌及其在制备异麦芽酮糖中的应用。但是，大黄欧文氏菌在植物内生的报道很少，特别是目前尚无茶树内生的大黄欧文氏菌的相关研究及其在促进植物生长应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，其能够有效促进植物的生长，可应用于植物促生菌剂或微生物肥料的制备，绿色有机无污染。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，所述茶树内生细菌为大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)V4，保藏编号为CCTCC NO：M2021027。

优选地，所述茶树内生细菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

本发明的第二方面提供了一种菌剂，所述菌剂含有本发明第一方面所述的茶树内生细菌。

优选地，所述菌剂含有的茶树内生细菌为活菌体，所述菌剂为液态菌剂。

本发明的第三方面提供了本发明第一方面所述的茶树内生细菌、本发明第二方面所述的菌剂在促进植物生长中的应用。

优选地，所述植物包括茶树或水稻。

本发明的第四方面提供了一种促进茶树生长的方法，包括：将本发明第一方面所述的茶树内生细菌和/或本发明第二方面所述的菌剂与茶树幼苗或茶树植株接触。

优选地，本发明第四方面所述的方法包括以下具体步骤：

(1)将所述茶树内生细菌接种至LB液体培养基，摇床培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌水清洗、重悬，得到菌剂；

(2)将所述茶树幼苗或所述茶树植株种植在已灭菌的营养基质中，接种所述菌剂进行培育。

优选地，在步骤(1)中，所述摇床培养的条件为28℃、180r/min。

优选地，在步骤(1)中，离心时间为1min，离心转速为10000rpm。

优选地，在步骤(2)中，所述营养基质包括：质量份数比为1∶1∶1的营养土(Pindstrup substrate)、蛭石和珍珠岩。

优选地，在步骤(2)中，所述菌剂的菌体浓度为OD600＝1.0，接种量为 50mL/株。

本发明的第五方面提供了一种促进水稻生长的方法，包括：将本发明第一方面所述的茶树内生细菌和/或本发明第二方面所述的菌剂与水稻种子接触。

优选地，本发明第五方面所述的方法包括以下具体步骤：

(1)将所述茶树内生细菌接种至LB液体培养基，摇床培养至对数生长期，离心收集菌体，用生理盐水清洗、重悬，得到菌剂；

(2)采用日浸夜露的方式对所述水稻种子进行浸种催芽，直至露白，接着进行消毒，得到表面消毒的露白种子，备用；

(3)将所述露白种子接种所述菌剂、浸泡，接着用无菌水清洗所述露白种子，种植在水培养基上进行培育。

优选地，在步骤(1)中，所述摇床培养的条件为28℃、180r/min。

优选地，在步骤(1)中，离心时间为1min，离心转速为10000rpm。

优选地，步骤(2)具体包括：用0.1％KMnO₄以日浸夜露的方式对所述水稻种子进行浸种催芽24小时，再用灭菌水以日浸夜露的方式对所述水稻种子进行浸种催芽24小时，直至所述水稻种子露白，接着分别用75％酒精和5％次氯酸钠对露白种子进行消毒3分钟，得到表面消毒的露白种子，备用。

优选地，在步骤(3)中，所述菌剂的菌体浓度为OD600＝1.0；所述露白种子按照1mL菌剂：10粒露白种子的比例接种所述菌剂。

优选地，在步骤(3)中，所述水培养基为0.55％Agar(在水中只加入0.55％琼脂的固体培养基)。

区别于现有技术，上述技术方案提供了一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，该茶树内生细菌为大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)V4，保藏编号为CCTCC NO：M2021027，其具备IAA产生能力、ACC脱氨酶活性、固氮能力、溶磷能力及铁载体产生能力，从而改良土壤营养成分 和吸收状况，促进植物吸收更多的营养物质，有效促进植物的生长。并且，该茶树内生细菌易培养，繁殖速度快，绿色有机无污染，可广泛应用于植物促生菌剂或微生物肥料的制备。

附图说明

图1为实施例3所述大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici V4)的系统进化树；

图2为实施例4所述接种实验组(Erwinia rhapontici V4)以及对照组(无菌水SW)后的茶树生长指标检测结果图(接种13周后的检测结果)；

图3为实施例4所述接种实验组(Erwinia rhapontici V4)以及对照组(无菌水SW)后的茶树形态图(接种13周后拍摄植株照片)；

图4为实施例5所述接种实验组(Erwinia rhapontici V4)以及对照组(生理盐水SNS)后的水稻生长指标检测结果图(培养14天后的检测结果)，图中，a、b表示显著性差异水平；相同字母者，表示组间差异不显著；字母不同者，表示组间差异显著；

图5为实施例5所述接种实验组(Erwinia rhapontici V4)以及对照组(生理盐水SNS)后的水稻形态图(培养14天后拍摄植株照片)。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

在本发明中，所述菌剂(含有Erwinia rhapontici V4菌株)的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分。例如，所述菌剂可以为液态菌剂(例如可以为菌液)和/或固态菌剂(例如可以为冻干后的菌体)，优选为液态菌剂。

在本发明中，所述“日浸夜露”的方法，即白天浸种(10～12h)、夜晚捞出摊开(10～12h)。

下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的菌株、植物作物、试剂及器材等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

首先，对本发明实施例中涉及的菌株、培养基、试剂盒等进行说明。

1、菌株保藏信息说明：

本发明提供的具有植物促生效应的茶树内生细菌为大黄欧文氏菌 (Erwiniarhapontici)V4，并于2021年1月7日被保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为CCTCC，地址位于中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M2021027。

2、培养基成分说明：

(1)LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，琼脂18g/L；

(2)LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L；

(3)NA培养基：牛肉浸膏3g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖2.5g/L，琼脂18g/L，pH＝7.0(25℃)；

(4)TSA胰蛋白胨大豆琼脂培养基，购自杭州微生物试剂有限公司。

(5)DF固体培养基：KH₂PO₄4g/L，Na₂HPO₄6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，葡萄糖2g/L，葡萄糖酸2g/L，柠檬酸2g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，琼脂18g/L， pH＝7.0(25℃)；

(6)ADF固体培养基：用ACC代替(NH₄)₂SO₄作为唯一氮源，终浓度为 3mmol/L，其它成分与DF固体培养基相同；

(7)Ashby固体培养基：CaCO₃5g/L，CaSO₄.2H₂O0.1g/L，KH₂PO₄0.2 g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，NaCl 0.2g/L，甘露醇10g/L，琼脂13g/L，pH＝7.0 (25℃)；

(8)NBRIP固体培养基：葡萄糖10g/L，Ca₃(PO₄)25g/L，MgCl₂·7H₂O 5g/L，(NH₄)₂SO₄0.1g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，KCl0.2g/L，琼脂18g，pH 为6.8-7.0(25℃)；

(9)MKB固体培养基：酪蛋白氨基酸5g/L，甘油15mL/L，KH₂PO₄2.5 g/L，MgSO₄·7H₂O2.5g/L，琼脂18g/L，pH＝7.2(25℃)；

(10)CAS固体培养基：铬天青S(CAS)60.5g，十六烷基三甲基溴化铵HDTMA 72.9mg，1mmol/L，FeCl₃·6H₂O10mL，0.1mol/L磷酸盐缓冲液 50mL，琼脂18g，定容至1L；磷酸盐缓冲液(g/L)：NaH₂PO₄·2H₂O5.905 g，Na₂HPO₄·12H₂O24.270g，NH₄Cl2.500g，KH₂PO₄0.750g，NaCl1.250g，定容至1L，pH＝6.8(25℃)。

3、试剂盒说明：

本发明实施例中，采用的细菌基因组提取试剂盒为：希玥 生物Biomiga 品牌的细菌基因组提取试剂盒。

接着，通过具体实施例对本发明进行详细说明，但是本发明并不限定于以下的实施方式。

实施例1茶树内生细菌的分离、纯化

从安徽黄山群体种茶树上采摘茶树叶片，装入干净的采样袋(瓶)中，做好标记，于4℃冰箱中保存备用。

在黄山群体种茶树叶片表面消毒结束后，将叶片样品剪碎放入已灭菌研钵内，加入少量无菌水研磨；然后，用枪头将研磨液转移至离心管内，加入与叶片质量等量的无菌水，配置成研磨液，之后稀释成3个浓度梯度10^-1，10^-2， 10^-3。接着，将三个浓度梯度的研磨液分别涂在LB培养基、NA培养基、TSA 培养基这三个特定培养细菌的固体培养基中。涂板结束后，放入28℃培养箱中培养3天，挑取不同形态的单菌落，经反复划线三次纯化后获得纯培养物，接种于LB固体培养基试管斜面，4℃保存。

实施例2具有植物促生效应的茶树内生细菌的筛选

1、菌株的培养以及菌悬液的制备：

将实施例1分离纯化得到的菌株接种至LB液体培养基中，在28℃、180 r/min的条件下摇床培养8～12小时，离心收集菌体，用生理盐水清洗、重悬制备成菌悬液。

2、菌株的筛选

通过IAA产生能力、ACC脱氨酶活性、固氮能力、溶磷能力及铁载体产生能力这5个植物生长促进指标，对所分离得到的菌株进行促生效应鉴定，从而筛选出具有植物生长促进能力的内生细菌。

(1)IAA产生能力测试

植物生长素(IAA)对植物具有直接刺激生长作用。

测试步骤：取制备好的菌悬液1mL分别置于含有5mL LB液体培养基(含或不含0.5mg/mL色氨酸)的摇菌管中，在28℃，180r/min培养条件下培养 2天，之后将培养物在10000rpm转速下，离心1min，取2mL上清液与2mL salkowski显色液反应，避光保存30min。另外，用2mL 60μg/mL IAA样品， 2mL LB液体培养基与2mL salkowski显色液反应作为对照组。反应液变为红色，则说明该菌株具有IAA生成能力。

(2)ACC脱氨酶活性测试

植物中1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid， ACC)是乙烯合成的前体物质，产ACC脱氨酶的内生细菌能利用该酶降解 ACC成为α-丁酮酸和氨，降低逆境条件下乙烯浓度，减少有害乙烯的产生，进而促进植物快速生长。

测试步骤：取制备好的菌悬液100μL分别涂布在ADF固体培养基和DF 固体培养基上，在28℃恒温培养箱中培养7天，以DF固体培养基上生长情况为对照。生长、继代培养5代后在ADF固体培养基上该菌株仍能生长，则说明该菌株具有ACC脱氨酶合成能力。

(3)固氮能力测试

测试步骤：取制备好的菌悬液100μL分别涂布在Ashby固体培养基上，以含氮的LB固体培养基为对照。在28℃恒温培养箱中培养7天后，该菌株在Ashby固体培养基上可继续生长，继续继代培养2代，同样有上述的表征，则说明该菌株是阳性菌株，具有固氮能力。

(4)溶磷能力测试

测试步骤：将NBRIP固体培养基分区，在每个区域中点植5μL制备好的菌悬液，保证相同大小的菌落，每个菌悬液点植3个培养基(保证3次重复)。在28℃恒温培养箱中培养7天后，观察到菌株周围有透明晕圈，则说明该菌株具有溶磷能力。

(5)铁载体产生能力测试

铁载体可以促进植物对土壤中铁的吸收，也可以防治土壤中病原菌的发生。

测试步骤：将MKB固体培养基分区，在每个区域中点植5μL制备好的菌悬液，保证菌落大小相同，在28℃恒温培养箱中培养。每个菌悬液点植3 个培养基(保证3次重复)。待长成菌落后，将加热后的CAS固体培养基冷却至60℃时，倒入10mL均匀覆盖在含有菌株的MKB固体培养基表面，1 小时后若观察到平板上菌落周围有铁载体晕圈，则说明该菌株具有产生铁载体能力。

通过上述5个植物生长促进指标的测定，筛选得到一株IAA产生能力、 ACC脱氨酶活性、固氮能力、溶磷能力及铁载体产生能力均最佳的茶树内生细菌菌株，命名为V4。

实施例3具有植物促生效应的茶树内生细菌V4的鉴定和保藏

1、茶树内生细菌V4的分子鉴定

使用细菌基因组提取试剂盒(希玥 生物Biomiga品牌)，对实施例2中所述的茶树内生细菌V4的基因组DNA进行提取，并利用细菌通用引物扩增菌株的16S rDNA序列。其中，细菌通用引物的碱基序列为：

F16S-27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(如SEQ ID NO：2所示)；

R16S-1492R：5’-CGGTTACCTTGTTACGACTTC-3’(如SEQ ID NO：3 所示)。

扩增产物由通用生物系统(安徽)有限公司进行测序，16S rDNA序列长度为1443bp，其序列如SEQ ID NO：1所示。

将测定的序列在NCBI数据库中用Blast软件与已知核苷酸序列进行同源性分析，结果表明，茶树内生细菌菌株V4与菌株Erwinia rhapontici strain DQ-03(KF500096.1)的16S rDNA序列的相似性最高(99.58％)。

接着，将茶树内生细菌菌株V4与Erwinia属中的5个种菌株序列进行进化树分析，即采用Mega5.0软件进行多序列匹配排列，以邻接法 (Neighbor-Joining Method)构建16SrDNA系统进化树，分析结果如图1所示。由图1可知，茶树内生细菌菌株V4与Erwiniarhapontici距离最近，可以确定其归属于Erwinia属。结合形态特征和生理生化特性，将茶树内生细菌菌株V4鉴定为大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici V4)，编号为V4。

2、茶树内生细菌V4的保藏

将大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici V4)保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为CCTCC，地址位于中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M2021027，保藏日期为2021年1月7日。

实施例4茶树内生细菌V4在茶树上的应用

以一年生的龙井43扦插苗为实验材料。

用清水冲洗茶苗根部，去除原土壤，用清水擦洗叶片，选取大小一致的茶苗24棵，修剪，保留20厘米木质化地上部分。

将茶苗种植在已灭菌的营养基质中，每盆营养基质中，加入等量的灭菌水，每盆种植一棵茶苗，将其在温室(25℃，75％湿度，16小时光照，8小时黑暗)培养7天以备用。其中，营养基质包括质量份数比为1∶1∶1的营养土、蛭石和珍珠岩。其中，营养土为采购自丹麦品氏托普集团的盆栽花卉栽培基质泥炭(Pindstrup substrate)。

将Erwinia rhapontici V4菌株接种至LB液体培养基，于28℃，180rpm 摇床培养至对数生长期。接着，于10000rpm转速下离心1min，收集菌体，用无菌水清洗、重悬直至OD600nm＝1.0(以紫外分光光度计)作为接种菌剂，以无菌水作为对照组(记为SW)。实验组每盆茶苗接种50mL接种菌剂，对照组每盆茶苗接种50mL灭菌水，一周接种一次，接种13周。

需要说明的是，在本实施例中，菌剂的有效接种浓度为OD600nm＝1.0，接种量为50mL。本领域技术人员可以理解的是，在其它实施例中，可以根据菌体浓度的变化，相应调整具体接种量，在此不作赘述。接种13周后，检测茶树的生长指标：新梢萌发率，新梢长度，新梢鲜重与干重，新梢叶片数量，检测结果如表1和图2所示。图3为接种13周后，实验组(Erwinia rhapontici V4)以及对照组(无菌水SW)中茶树苗的形态图。

表1茶树生长指标检测结果

注：a、b表示显著性差异水平；相同字母者，表示组间差异不显著；字母不同者，表示组间差异显著。

由表1、图2以及图3可知，相比于接种灭菌水的对照组，接种Erwinia rhaponticiV4菌株后，显著地增加了茶树的新梢萌发率、新梢长度、新梢鲜重、新梢干重以及新梢叶片数量。结果表明，Erwinia rhapontici V4菌株对茶树具有明显而有效的生长促进作用。

实施例5茶树内生细菌V4在水稻上的应用

以株两优899水稻种子为实验材料。

用0.1％KMnO₄以日浸夜露的方式浸泡水稻种子24小时，再用灭菌水以同样的日浸夜露方式浸泡水稻种子，直至水稻种子露白。接着；分别用75％酒精和5％次氯酸钠对露白种子进行消毒3分钟，得到表面消毒的露白种子，备用。

将Erwinia rhapontici V4菌株接种至LB液体培养基，于28℃，180rpm 摇床培养至对数生长期。接着，于10000rpm转速下离心1min，收集菌体，用0.9％的生理盐水重悬至OD600nm＝1.0(以紫外分光光度计)作为接种菌剂，以0.9％的生理盐水作为对照组(记为SNS)。接着，以3mL接种菌剂浸泡30 粒表面消毒的露白种子，室温接种24小时，后用无菌水清洗水稻种子，种植在0.55％的水培养基上，温室(25℃，75％湿度，16小时光照，8小时黑暗) 培养14天。其中，0.55％的水培养基为0.55％Agar(在水中只加入0.55％琼脂的固体培养基)。

需要说明的是，在本实施例中，菌剂的有效接种浓度为OD600nm＝1.0，接种比例为：1mL菌剂：10粒露白种子。本领域技术人员可以理解的是，在其它实施例中，可以根据菌体浓度的变化，相应调整具体接种比例，在此不作赘述。

培养14天后，检测水稻苗的生长指标：苗长，根的数目，鲜重，干重，检测结果如表2和图4所示。图5为培养14天后，实验组(Erwinia rhapontici V4)以及对照组(生理盐水SNS)中水稻苗的形态图。

表2水稻苗生长指标检测结果

注：a、b表示显著性差异水平；相同字母者，表示组间差异不显著；字母不同者，表示组间差异显著。

由表2、图4以及图5可知，相比于接种0.9％生理盐水的对照组，接种 Erwiniarhapontici V4菌株后，显著地增加了水稻的苗长、根的数目、鲜重以及干重，表明Erwiniarhapontici V4菌株对水稻具有明显而有效的生长促进作用。

本发明提供的茶树内生细菌、菌剂具备IAA产生能力、ACC脱氨酶活性、固氮能力、溶磷能力及铁载体产生能力，可以改良土壤营养成分 和吸收状况，促进植物吸收更多的营养物质，从而有效促进植物的生长。因此，本发明提供的茶树内生细菌、菌剂并不限于应用于促进茶树、水稻的生长，其还可以应用于促进其他植物的生长。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，菌剂及其应用

<130> 20210422

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> 大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)

<400> 1

gggcagggcg gcggctacac atgcagtcga acggtagcac agagagcttg ctcttgggtg 60

acgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgccc gatggagggg gataactact 120

ggaaacggta gctaataccg cataacgtct tcggaccaaa gtgggggacc ttcgggcctc 180

acaccatcgg atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaacggc tcacctaggc 240

gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag 300

actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca 360

tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagtgggg aggaaggcga 420

tgaagttaat agcttcttcg attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg 480

ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg 540

cacgcaggcg gtctgtcaag tcggatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt 600

cgaaactggc aggctagagt cttgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat 660

gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct 720

caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780

gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg 840

accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca 900

agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg gccttgacat 960

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tcctttgttg ccagcacgta atggtgggaa ctcaaaggag actgccggtg ataaaccgga 1140

ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacgg ccagggctac acacgtgcta 1200

caatggcgca tacaaagaga agcgacctcg cgagagcaag cggacctcat aaagtgcgtc 1260

gtagtccgga tcggagtctg caactcgact ccgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag 1320

atcagaatgc tacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1380

gagtgggttg caaaagaagt aggtagctta accttcggga gggcgctacc acttgatcgt 1440

gcg 1443

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

cggttacctt gttacgactt c 21

Claims (10)

1.一种具有植物促生效应的茶树内生细菌，其特征在于，所述茶树内生细菌为大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontici)V4，保藏编号为CCTCC NO：M2021027。

2.根据权利要求1所述的茶树内生细菌，其特征在于，所述茶树内生细菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1或2所述的茶树内生细菌。

4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有的茶树内生细菌为活菌体，所述菌剂为液态菌剂。

5.权利要求1或2所述的茶树内生细菌、权利要求3或4所述的菌剂在促进植物生长中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物包括茶树或水稻。

7.一种促进茶树生长的方法，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的茶树内生细菌和/或权利要求3或4所述的菌剂与茶树幼苗或茶树植株接触。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)将所述茶树内生细菌接种至LB液体培养基，摇床培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌水清洗、重悬，得到菌剂；

(2)将所述茶树幼苗或所述茶树植株种植在已灭菌的营养基质中，接种所述菌剂进行培育。

9.一种促进水稻生长的方法，其特征在于，包括：将权利要求1或2所述的茶树内生细菌和/或权利要求3或4所述的菌剂与水稻种子接触。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

(1)将所述茶树内生细菌接种至LB液体培养基，摇床培养至对数生长期，离心收集菌体，用生理盐水清洗、重悬，得到菌剂；

(2)采用日浸夜露的方式对所述水稻种子进行浸种催芽，直至露白，接着进行消毒，得到表面消毒的露白种子，备用；

(3)将所述露白种子接种所述菌剂、浸泡，接着用无菌水清洗所述露白种子，种植在水培养基上进行培育。

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