CN107118979B - 一种解淀粉芽孢杆菌与应用 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌，对花生病害有拮抗作用，所述解淀粉芽孢杆菌保藏名称解淀粉芽孢杆菌LX17，保藏编号CGMCC12360，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌LX17的应用，其在拮抗花生病害中的应用。所述解淀粉芽孢杆菌LX17也可广泛用于沙土种植中，植物病害的防治。对花生病害具有显著的防治效果，同时，不需要使用菌多灵等有机药剂，减少了对环境的污染。同时因为菌制剂，其附着力较化学试剂强，适用于沙土等储水能力差的环境。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌与应用
技术领域
本发明涉及一种对花生病害有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌的筛选及应用。
背景技术
B.amyloliquefaciens最早是由日本科学家Fukumoto于1943年从土壤中分离到的，因分泌解淀粉酶故命名为“解淀粉芽孢杆菌”(Fukumoto，1943)。B.amyloliquefaciens属于革兰氏阳性菌，可以刺激植物生长和产生次生代谢产物抑制植物病原物。其代表株系FZB42的基因组大小为3918kb，约包含3693个编码区域(Chen et al.，2008)。B.amyloliqueffaciens拮抗活性首先表现在抗真菌活性上，权春善(2006)从堆肥中分离到植物病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)具有强烈抗菌活性的B.amyloliquefaciensQ-12。陈士云(2005)从土壤中分离到B.amyloliquefaciensCH-2，能抑制油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌丝生长和菌核形成，并初步认定活性物质为抗菌蛋白活多肽。Pyoung Il Kim(2004)报道B.amyloliquefaciens MET0908分泌抗真菌蛋白能有效控制番茄炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)。Soad A.Algam1(2004)报道B.amyloliquefaciens能促进植株生长，有效控制由劳尔青枯病菌Ralstoniasolanacearum引起的烟草青枯病。Yoshida et al.，(2002)从桑树上分离到的B.amyloliquefaciens RC-2具有抑制桑树炭疽病原菌(Colletotrichum dematium)、白纹羽菌(Rosellinia necatrix)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和水稻白叶枯病(Xanthomonas campestris)等植物病原真菌和细菌，并分离到的一种环肽类化合物伊枯草菌素A(iturin)。B.amyloliquefaciensFZB45具有肌醇六磷酸酶(phytase)活性，可以在缺磷的条件下刺激植物生长(Idriss etal.，2002)。2003年Murphy对部分土壤杆菌研究表明，B.amyloliquefaciens可以通过刺激植物生长来抑制黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic viius，CMV)的侵染。
但是目前，由于花生种植土壤的环境因素，尚未有报道可用于花生病害拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌。申请者从根际土壤中筛选了一株对花生病害有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)LX-17。
发明内容
为解决现有技术中的不足，本发明从根际土壤中筛选了一株对花生病害有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
一种解淀粉芽孢杆菌，对花生病害有拮抗作用，所述解淀粉芽孢杆菌保藏名称解淀粉芽孢杆菌LX17，保藏编号CGMCC12360，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明还提供了所述解淀粉芽孢杆菌LX17的应用，其在拮抗花生病害中的应用。
进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌LX17也可广泛用于沙土种植中，植物病害的防治。
所述应用包括其单独制备为菌制剂，也包括以其为成分在沙土病害防治中的应用。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌LX17，对沙土种植的植物病害尤其是花生病害具有显著的防治作用，环保，且有效作用时间长。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1 16SrDNA扩增产物凝胶电泳图；
图2基于16S rDNA序列构建的系统发育树。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步的描述。
实施例1拮抗菌株的鉴定方法
1.1 菌株的生理生化鉴定(方中达，1998)，结果见表1。
(1)取纯化后的菌株接种于NA培养基平板，28℃培养18-24h后，取纯培养物涂片，分别进行革兰氏染色及运动力检测。
革兰氏反应：用3％氢氧化钾(KOH)来测定细菌革兰氏染色反应。用牙签挑取菌落放在载玻片上与3％氢氧化钾液滴搅拌，1min后，慢慢拉出，若拉出丝状物为革兰氏阴性菌，反之，则为革兰氏阳性菌。
运动力检测：制备半固体培养基，高压灭菌后倒入试管约10mL，从培养及顶部针刺接种，若细菌能运动则从接种点向下生长。
(2)将纯化的单菌落进行生理生化鉴定，包括碳素化合物利用和分解、氮素化合物利用和分解、大分子化合物的分解及其好氧性和是否产生荧光等的鉴定。
碳素化合物利用和分解：将细菌接种于柠檬酸盐培养基斜面上，28℃培养18～24h，柠檬酸盐培养基变为蓝色，表示柠檬酸被利用；将细菌接种于蛋白胨葡萄糖磷酸盐培养液中， 28℃培养后，加入甲基红指示剂，培养液变为红色则为阳性反应。
氮素化合物利用和分解：将细菌接种于硝酸盐培养液中培养来测定是否有亚硝酸盐的生成；将细菌接种于肉汁冻培养基测定吲哚有无产生，从而得出该细菌对色氨酸的利用情况。
大分子化合物的分解：利用明胶培养柱穿刺接种细菌，培养一段时间观察明胶的分解液化情况；将细菌划线接种在加入2％可溶性淀粉的肉汁冻培养基平板上，培养一段时间后加一层碘液，菌落周围出现无色透明圈则淀粉被水解。
精氨酸双水解试验：细菌穿刺接种，用灭菌的凡士林封管培养，培养基转为红色者为阳性。
好氧性则通过半固体穿刺法对细菌的好氧性进行测定，如果该菌沿着穿刺线只在开管的上部有明显的扩散带，说明该菌是专性好氧菌；在开管的上下部都能生长为兼性厌氧性细菌；只能在开管的下部和闭管中生长为厌氧性细菌。
过氧化氢酶反应测定：将一滴新鲜的细菌放在洁净的载玻片上，加一滴过氧化氢，有气泡产生为阳性反应。
荧光性：菌株在金氏B培养基(KBA)上产生黄绿色荧光色素，则具有荧光性。
表1 活性菌株LX-17的生理生化特征
Figure DEST_PATH_GSB0000166038770000031
注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应
*参考《伯杰细菌鉴定手册》。
通过生理生化测定，LX-17为好氧菌，厌氧条件下生长微弱，可以利用柠檬酸盐做碳源；可以利用无机氮源硝酸盐；V-P实验为红色，为阳性反应。结合该菌的形态特征和测定的生理生化指标，初步鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌。
1.2 菌株DNA提取
进行基因组DNA的提取，其提取方法主要参照TIANGEN TIANamp BACTERia DNAKit试剂盒说明书进行，并略加修改，步骤如下：
(1)取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清；
(2)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮；
(3)加入4μLRNAase(100mg/mL)溶液，震荡15s，室温放置5min；
(4)向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；
(5)加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(6)加入220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
(7)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱GB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
(8)向吸附柱CB3中放入500μL缓冲液GD(使用前检查是否加收入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
(9)向吸附柱CB3中放入700μL漂洗液PW(使用前检查是否加收入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
(10)向吸附柱CB3中放入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；
(11)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(12)将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。
1.3 PCR与序列测定
(1)提取的DNA参照TaKaRa公司的16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒说明书进行PCR扩增，其中正向引物为：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQ IDN0.1)，反向引物为：3’-CGCTTACCTTGTTACGACTT-5’(SEQ ID NO.2)。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸90s；72℃后延伸5min，共30个循环。PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后置于3UVTMTransilluminator(UVP，USA)下进行观察，结果见图1。
(2)根据预先设计的引物与预期扩增片段大小，结合Marker，目的片段在紫外灯下切割下来，用回收试剂盒Silica Bead DNA GelExtraction Kit进行DNA的回收。16s rDNA序列测定由宝生物工程(大连)有限公司进行序列测定。通过BLAST程序将测定的序列与GenBank(NCBI，网站http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比较，然后从GenBank中获得和试验菌株序列相近种、属的16s rDNA序列进行确定。
基于16S rDNA序列构建的系统发育树，结果见图2。
对菌株16S进行PCR扩增，得到约1500bp的基因片断，提交Genebank进行Blast分析，与已经报道的菌株16SrDNA进行同源比较。结果显示该活性菌株的16s rDNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属的细菌菌株的解淀粉芽孢杆菌的16s rDNA序列高度同源，同源率达99％。结合传统的生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析的结果，判定菌株LX-17为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
实施例2对花生病害的防治
试验田18亩，划分为3个区域，每个区域各6亩，分别为1号田、2号田、3号田，每块田内分为三组，每2亩为一组，各组间设有隔断。其中，1号田只喷洒水，二号田使用本发明所述的解淀粉芽孢杆菌LX17，3号田喷洒多菌灵水溶液。
所述解淀粉芽孢杆菌LX17配置及使用为采用灌根的方法，震荡培养菌浓度0D值达到0.4-0.6后，分别在播种期、播种后10d、20d利用LX17发酵液1000倍灌根。对照用50％ 多菌灵800倍液和清水。花生冠腐病于花生出苗后开始调查，至始花期结束。花生花生根腐病、花生白绢病菌于花生收获前20d进行调查。
病株率＝发病株数/总株数×100％
病情指数＝∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)
防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
用LX17菌株处理花生菌株，田间试验均表明对花生冠腐病、根腐病和白绢病均有明显防治效果，结果见表2-4。。
表2 对田间对花生冠腐病的防治效果
Figure DEST_PATH_GSB0000166038770000051
表3 对田间对花生根腐病的防治效果
Figure DEST_PATH_GSB0000166038770000052
表4 对田间对花生白绢病的防治效果
Figure DEST_PATH_GSB0000166038770000053
虽然当前发明参考特定的示例被描述，其只是为了解释的目的而不是对本发明的限制，对实施方式的改变，增加和/或删除可以被做出而不脱离本发明的范围。
Figure ISB0000166038780000011

Claims (1)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) ，所述解淀粉芽孢杆菌保藏名称解淀粉芽孢杆菌LX17，保藏编号CGMCC12360，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
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