CN108018232B - 一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌 - Google Patents

一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌。该伴生细菌为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）pf36，于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60278。本发明从香蕉穿孔线虫多个种群中分离筛选出一株优势伴生细菌，即上述荧光假单胞菌pf36，其与香蕉穿孔线虫具有非常稳定的伴生关系，为杀线虫蛋白酶基因的介导表达提供了一种遗传改良目标菌，由于该目标菌与香蕉穿孔线虫的伴生关系，被改良表达杀线虫蛋白酶基因后，可用于香蕉穿孔线虫的生物防治，而且对作物安全。本发明也为植物线虫的防治提供了一种新的思路和方法，即利用线虫伴生菌介导杀线虫蛋白酶基因实现对线虫的生物防治。

Description

一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌。
背景技术
植物线虫病是由植物寄生线虫侵袭和寄生引起的植物病害。受害植物可因侵入线虫吸收体内营养而影响正常的生长发育；线虫代谢过程中的分泌物还会刺激寄主植物的细胞和组织，导致植株畸形，以及利用天敌控制等。使农产品减产和质量下降。其中吗，香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)又名香蕉烂根病，是香蕉、花卉种植业及很多经济作物的最危险的专性寄生线虫，寄主范围非常广泛，已报道的寄主植物有350多种。该线虫除严重危害香蕉、胡椒和椰子外，还危害大豆、玉米、高梁、甘蔗、茄子、咖啡、番茄和马铃薯等经济作物及红掌、竹芋、棕榈等观赏植物。由于该线虫危害严重，因此，有55个国家对其实施官方控制，中国也将该线虫列为禁止入境的一类植物检疫危险性有害生物。
目前防治该线虫主要还是以化学杀线剂为主，而化学药剂的大量使用对环境、人畜、植物和其它有益生物造成极大的危害和其它负面影响，在许多国家和地区已被严格限制使用。生物防治手段具有环保、安全和可持续性等特点，研究和利用有效的生物防治方法防治香蕉穿孔线虫已倍受关注。
在自然界中，无论是腐生线虫、动物寄生线虫和植物寄生线虫与细菌之间都存在着多种互作关系，其中包括捕食、寄生、共栖和共生等。如异小杆线虫属(Heterorhabditis)和斯氏线虫属(Steinernema)分别与发光杆菌属(Photorhabdus)和嗜线虫致病属(Xenorhabdus)细菌形成互惠共生关系，这种关系主要体现在细菌信息、营养、抗菌和致病作用，以及线虫对细菌的保护和媒介作用等。而植物病原线虫与细菌的共生关系并不像动物寄生线虫与细菌的关系那样密切，如大豆胞囊线虫的胞囊表面和内部存在大量的细菌，数量可达到2.6×105cfu/胞囊，其中主要包括Lysobacter spp.、Varovorax spp.、Rhizobium sp.、Xanthomonas sp.、Pedobacter heparinus、Pseudomonas fluorescens等。然而这些细菌并不是大豆胞囊线虫严格专性的共生菌，但对大豆胞囊线虫的胞囊在土壤中长期存在具有重要的生态作用。2009年Haegeman等在香蕉穿孔线虫体内发现了Wolbachia家族成员，这是首次报道在植物寄生线虫中发现Wolbachia，而在其它植物寄生线虫中尚均未发现Wolbachia，这类细菌主要通过胞质不亲和、孤雌生殖、杀雄性、雌性化和增强雄性或雌性生殖力等多种方式调控其宿主的生殖活动。在自然条件下，植物寄生线虫与所处环境的大量微生物接触，并发生相互作用关系，最后形成一个微生态群落，揭示其中的微生物多样性将有利于我们了解它们之间的互作关系。
在植物寄生线虫伴生细菌的研究工作中，松材线虫与其伴生细菌的关系的研究最为广泛而深入。有研究表明，松材线虫体表的浸泡物对其伴生细菌的生长繁殖具有促进作用，反过来细菌的分泌物或细菌本身对线虫也具有趋向作用和促进繁殖的作用，但这种互利关系并不是特异的，分离自不同的松材线虫种群的细菌对所有松材线虫都有促进作用，反过来，松材线虫体表也可以附生多种细菌。不同地区的松材线虫种群所携带的细菌种类和组成也不尽不相同，如中国的松材线虫伴生细菌主要以假单胞菌(Pseudomonas sp.)为主；美国松材线虫种群以成团泛菌(Pantoea agglomerans)为主；日本松材线虫种群主要以芽孢杆菌(Bacillus spp.)为主。
香蕉穿孔线虫寄生植物根部，在根内和根际土壤中均能完成生活史，据报道香蕉穿孔线虫与根际和土壤中的一些细菌有着伴生关系(Zheng et al.2012)。这些伴生细菌在寄主线虫的作用机制研究和防治方面有着重要的作用和意义。目前为止，并没有关于香蕉线虫伴生菌及其生防作用的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，从香蕉穿孔线虫多个种群中分离筛选出一株优势伴生细菌，为杀线虫蛋白酶基因的介导表达提供了一种遗传改良目标菌，由于该目标菌与香蕉穿孔线虫的伴生关系，被改良表达杀线虫蛋白酶基因后，可用于香蕉穿孔线虫的的生物防治。
本发明的第一个目的是提供一种香蕉穿孔线虫伴生细菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)pf36。
本发明的第二个目的是提供所述荧光假单胞菌pf36在防治香蕉穿孔线虫中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述荧光假单胞菌pf36在构建能够与香蕉穿孔线虫共生的功能菌方面的应用。
本发明的第四个目的是提供所述荧光假单胞菌pf36在构建香蕉穿孔线虫生防工程菌方面的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种香蕉穿孔线虫伴生细菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)pf36，已于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏编号为GDMCC No：60278。
该菌株是从香蕉穿孔线虫多个种群中分离筛选出得一株可与香蕉穿孔线虫稳定伴生的优势细菌，因此其在防治香蕉穿孔线虫中的应用，应在本发明的保护范围之内。
同时，所述荧光假单胞菌pf36在构建能够与香蕉穿孔线虫共生的功能菌方面的应用，应在本发明的保护范围之内。
具体地，是将功能基因转化至所述荧光假单胞菌pf36构建功能工程菌。由于该工程菌能够与香蕉穿孔线虫稳定伴生，因此可以以该菌为介导，实现对香蕉穿孔线虫的操作。
如：所述荧光假单胞菌pf36在构建香蕉穿孔线虫生防工程菌方面的应用。
具体是将具有杀香蕉穿孔线虫活性的生物酶的编码基因转化至所述荧光假单胞菌pf36构建杀线工程菌。该工程菌能够与香蕉穿孔线虫稳定伴生，因此工程菌所表达的杀线生物酶可以实现杀线作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从香蕉穿孔线虫多个种群中分离筛选了一株优势伴生细菌，为杀线虫蛋白酶基因的介导表达提供了一种遗传改良目标菌，由于该目标菌与香蕉穿孔线虫的伴生关系，被改良表达杀线虫蛋白酶基因后，可用于香蕉穿孔线虫的生物防治，也为植物线虫的防治提供了一种新的思路和方法。
本发明在筛选上述具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌时，继代培养了10个香蕉穿孔线虫种群，且各线虫种群均在胡萝卜愈伤组织上继代培养3次以上，可确保分离的细菌与香蕉穿孔线虫具有稳定的伴生关系。同时综合了生物安全性和遗传改造背景等因素，确定分离频率较高的荧光假单胞菌pf36菌株具有遗传改造潜力的伴生细菌，其不仅遗传改造潜力强，而且经过案例验证了，将具有杀香蕉穿孔线虫活性的生物酶的编码基因(如蛋白酶pase4基因)与其进行转化构建的工程菌与香蕉穿孔线虫伴生关系稳定，杀线作用显著，且对作为安全性高，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为香蕉穿孔线虫伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌菌株在NA平板上的培养特征(37℃，48h)。
图2为香蕉穿孔线虫伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌菌株菌株的显微特征。
图3为香蕉穿孔线虫伴生细菌菌株的基因组DNA提取电泳结果；M：DNA marker；1～48：依次为xjy1～xjy5、yj1～yj6、kqj1～kqj4、zbj1～zbj6、hz1～hz6、xinj1～xinj5、bxj1～bxj4、dbsr1～dbsr7和hg1～hg5。
图4为香蕉穿孔线虫伴生细菌菌株的16S rDNAPCR扩增产物电泳结果；M：DNAmarker；1～48：依次为xjy1～xjy5、yj1～yj6、kqj1～kqj4、zbj1～zbj6、hz1～hz6、xinj1～xinj5、bxj1～bxj4、dbsr1～dbsr7和hg1～hg5。
图5为靶标菌株荧光假单胞菌pf36。A：菌株pf36产荧光色素检测图(λ＝302nm)；B：菌株pf36扫描电镜图。
图6为遗传改造荧光假单胞菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36的筛选及检测。A和B为遗传改造荧光假单胞菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36在SMA平板上降解脱脂奶粉情况(37℃，48h)，其中，a为导入重组质粒(pase4-MCS2)转化子p4MCS-pf36，b为空转化载体(pBBR1MCS-2)对照MCS-pf36，c为蛋白酶表达阳性接合子p4Tn5-pf36，d为空载体(pUTmini-Tn5)接合子对照Tn5-pf36；C为菌株p4MCS-pf36的重组质粒双酶切鉴定，M为DNA marker，1：重组质粒pase4-MCS2，2：pase4-MCS2经EcoR I、BamH I双酶切；D为菌株p4Tn5-pf36的pase4基因Southern杂交，1：阳性对照pase4基因的PCR产物，2：Kpn I酶切消化pf36基因组DNA，3：KpnI酶切消化p4Tn5-pf36基因组DNA。
图7为遗传改造荧光假单胞菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36发酵上清液对香蕉穿孔线虫的致死率和毒性；A为不同处理对线虫致死率测定(25℃，浸泡48h)，(n＝5，p＜0.05)；B为香蕉穿孔线虫浸泡于发酵上清液60h后表现的毒性性状(25℃)，其中，1：对照处理pf36，2：p4Tn5-pf36处理，3：p4MCS-pf36处理。
图8为不同处理的香蕉植株在接种香蕉穿孔线虫90d后的长势；A：空白对照H2O；B：p4Tn5-pf36+香蕉穿孔线虫(RS)；C：pf36+RS，D：H2O+RS，E：MCS-pf36+RS；F：p4MCS-pf36+RS；G：Tn5-pf36+RS，H：LB+RS。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1香蕉穿孔线虫伴生细菌——荧光假单胞菌pf36的获得
1、香蕉穿孔线虫伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌的分离纯化
(1)香蕉穿孔线虫伴生细菌分离
为确保分离的细菌与香蕉穿孔线虫具有稳定的伴生关系，供试的来源于不同寄主植物的10个香蕉穿孔线虫种群(表1)，均在胡萝卜愈伤组织上继代培养3次以上。收集经过继代培养的香蕉穿孔线虫(混合虫态线虫)，分别装于1.5ml灭菌离心管中(约1000条)。4500rpm离心45s，弃上清，重复清洗线虫3次，然后将收集于管底的线虫用灭菌的玻璃棒彻底研碎，加入1ml无菌水充分摇匀，吸取50μl研磨液涂布于NA(营养琼脂)平板上，待平板晾干后，放入37℃培养箱中倒置培养48h。最后依据菌落生成的形态、大小和颜色等生理特征从培养平板上挑出具有代表性的细菌菌株。另外，切取1g左右不接种线虫的胡萝卜愈伤组织置于1.5ml灭菌离心管中，用玻璃棒搅碎后按分离线虫伴生细菌的方法分离胡萝卜愈伤组织的内生细菌。
表1供试的香蕉穿孔线虫种群信息表
Figure BDA0001491788540000051
Figure BDA0001491788540000061
(2)香蕉穿孔线虫伴生细菌纯化
根据不同的菌落特征分离的细菌菌株采用连续划线培养的方法进行纯化。具体方法是将挑取的细菌划线接种于NA平板上，37℃培养48h后，再挑取单菌落划线接种于新的NA平板上，37℃培养48h后，挑取单菌落接种于LB培养基中，200rpm，37℃培养24h，培养的菌液一部分用于鉴定(细菌的基因组DNA提取)，一部分加入甘油至终浓度为30％，贮存于-80℃备用。
(3)结果
根据菌落培养特征的不同，从10个香蕉穿孔线虫种群中共分离53株细菌，其中在xjy、xinj、hn和hg种群中各分离得到5株细菌，分别编号为xjy1～xjy5、xinj1～xinj5、hn1～hn5和hg1～hg5；在yj、zbj和hz种群中各分离得到6株细菌，分别编号为yj1～yj6、zbj1～zbj6和hz1～hz6；在kqj和bxj种群中各分离得到4株细菌，分别编号为kqj1～kqj4和bxj1～bxj4；在dbsr种群中分离得到7株细菌，编号为dbsr1～dbsr7；从没有接种线虫的胡萝卜愈伤组织中分离得到5株内生细菌，编号为r1～r5。部分分离纯化细菌菌株在NA平板上培养48h后的菌落特征见图1，显微特征见图2。
2、香蕉穿孔线虫伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌的16S rDNA扩增
(1)鉴定方法
1)伴生细菌基因组提取：分离纯化得到的伴生细菌菌株基因组DNA的提取方法参照OMEGA公司研发的Bacterial DNAKit使用说明进行。
2)伴生细菌16S rDNA扩增：以提取的各伴生细菌基因组DNA为模板，使用通用引物27F和1492扩增各伴生细菌的16S rDNA片段。
通用引物27F和1492的序列如下：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
3)PCR扩增产物的纯化回收、连接和转化：使用OMEGA公司研发的MicroElute DNAClean-Up Kit纯化回收各伴生细菌16S rDNA PCR扩增产物。采用TaKaRa公司的pMD19-TVector进行连接，配置下列反应体系：
Figure BDA0001491788540000071
混匀反应溶液后，将管置于PCR仪上，22℃反应30min；用移液枪将上述的连接产物全部加入到100μl的感受态细胞E.coli DH5a进行转化，涂布于含有20mg/ml X-gal、24mg/ml IPTG和50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，待菌液完全风干后，37℃倒置培养12h。
4)阳性克隆筛选：用灭菌牙签轻轻挑取平板上白色的单菌落，置于装有10μl灭菌水的PCR管中，在涡旋仪中以最大转速混匀，从中吸取1 μl菌液作为模板，用pMD19-T克隆载体的通用引物(M13-47和RV-M)进行PCR扩增检测；剩余部分菌液加入到含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并作标记，220rpm，37℃培养16h。
pMD19-T克隆载体的通用引物序列如下：
M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’
(2)结果
使用试剂盒提取分离获得的58株细菌的基因组DNA，电泳检测结果显示，各菌株样品在约23kb处有一条明亮条带(图3)，表明提取的基因组DNA完整性较好。以提取的基因组DNA为模板，分别扩增各菌株的16SrDNA片段，电泳检测表明，各菌株在约1700bp处(连上约200bp载体序列)出现一条特异性的目的条带(图4)，与预测值一致，PCR扩增成功。扩增产物经纯化回收、连接和转化后，挑取白色菌落进行单菌落PCR扩增，经电泳检测后，将各阳性克隆送往生物公司测序。
3、香蕉穿孔线虫伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌的16S rDNA鉴定
(1)序列的测定与比对
经上述PCR鉴定的阳性克隆，取其与之对应的培养菌液送往上海生工进行序列测定。测序成功后提交至NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行同源比对鉴定。
(2)结果
将各分离菌株的测序结果提交至GenBank数据库进行同源性比对，58个菌株与数据库中的已知核酸序列的相似度在99％以上。根据Blast比对结果，在10个香蕉穿孔线虫种群中分离获得的53株伴生细菌可分为13个属、20个种和3个不定种。另外，在没有接种香蕉穿孔线虫的胡萝卜愈伤组织中分离获得的5株内生细菌(r1～r5)可分为5个属5个种，分别为：Achromobacter piechaudii、Bacillus aryabhattai、Enterobacter amnigenus、Pantoea agglomerans和Pseudomonas gessardii。
结果表明，香蕉穿孔线虫的伴生细菌种类比较丰富，此外，从胡萝卜愈伤组织中分离得到的5种内生细菌与从线虫上分离得到的23种细菌没有重叠，说明在用胡萝卜愈伤组织培养线虫的过程中，香蕉穿孔线虫伴生细菌未被胡萝卜愈伤组织内生细菌污染，从各线虫种群中分离获得的菌株均为香蕉穿孔线虫的伴生细菌。
4、香蕉穿孔线虫优势伴生细菌筛选
(1)香蕉穿孔线虫优势伴生细菌筛选
根据鉴定的结果筛选出在10个香蕉穿孔线虫种群中分离频率较高的细菌菌种作为后续遗传改造的目标菌。
(2)检测结果
从10个香蕉穿孔线虫种群中分离得到的53株细菌可分为23个细菌种，并分析各菌种的分离频率。
结果表明荧光假单胞菌为供试香蕉穿孔线虫种群的优势伴生细菌之一，同时考虑到生物安全性和遗传背景等因素，选择荧光假单胞菌作为后续遗传改造的目标细菌，并以从hn线虫种群分离得到的第36号菌株hn4(荧光假单胞菌)作为目标改造菌株，将其命名为pf36，并于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏编号为GDMCC No：60278。
37℃条件下，荧光假单胞菌pf36在LB平板培养60h后，菌落光滑微隆起，边缘不整齐，周围产黄绿色素，紫外光(λ＝302nm)下可见黄绿荧光(图5中A图)；扫描电镜下观察其菌体为杆状，呈单个或成对排列，大小约为0.7μm×2.4μm(图5中B图)。
实施例2香蕉线虫伴生荧光假单胞菌在防治香蕉穿孔线虫中的应用
1、蛋白酶pase4基因导入香蕉穿伴生细菌——荧光假单胞菌
(1)转化方法
蛋白酶pase4基因分别通过载体转化和接合转座的方法导入目标菌荧光假单胞菌pf36。蛋白酶pase4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
①载体转化法
以实验室保存的连接有蛋白酶pase4基因的重组质粒pase4-pEASY为模板，使用如下引物扩增蛋白酶pase4基因。
上游引物M1：
Figure BDA0001491788540000091
下横线为EcoR I酶切位点，波浪线为核糖体结合位点；
下游引物M2：
Figure BDA0001491788540000092
下横线为BamH I酶切位点，波浪线为6×His标签序列。
扩增产物与广宿主表达载体pBBR1MCS-2连接后得到重组质粒pase4-MCS2，并转化感受态pf36细胞，最后涂到含卡那霉素(Kan，30μg/mL)的SMA平板上筛选具有蛋白酶活性的转化子p4MCS-pf36。
②接合转座法
接合转座：参照Biomedal公司pUTmini-Tn5 Km Kit使用说明进行三亲本接合试验。
以实验室保存的连接有蛋白酶pase4基因的重组质粒pase4-pEASY为模板，使用如下引物扩增蛋白酶pase4基因。
上游引物T1：
Figure BDA0001491788540000093
下横线为NotI酶切位点，波浪线为核糖体结合位点
下游引物T2：
Figure BDA0001491788540000094
下横线为Not I酶切位点，波浪线为6×His标签序列
扩增产物与载体pUTmini-Tn5(Biomedal)连接得到重组质粒pase4-Tn5，重组质粒pase4-Tn5在辅助菌E.coli DH5α(pRK2013，Biomedal)协助下转移到受体菌pf36，并通过Tn5的转座作用将pase4基因整合到pf36基因组中。最后通过含有Kan(30μg/mL)和Cm(34μg/mL)的SMA平板筛选具有蛋白酶活性的接合子p4Tn5-pf36。
(2)结果
利用M1/M2引物扩增蛋白酶pase4基因，连接到载体pBBR1MCS-2得到重组质粒pase4-MCS2，经EcoR I和BamH I双酶切检验正确后转化感受态pf36细胞得到转化子p4MCS-pf36，将其接种到SMA平板上出现明显水解带，而空转化载体对照MCS-pf36并没有出现脱脂奶粉降解现象(图6中A图)。提取p4MCS-pf36的重组质粒作双酶切(EcoR I和BamH I)，得到一条约5kb载体片段条带和一条约1.7kb目的片段条带(图6中C图)，结果表明构建的重组质粒pase4-MCS2成功转化伴生细菌pf36，并且pase4基因在其中得到正确表达。利用T1/T2引物扩增蛋白酶pase4基因，连接载体pUTmini-Tn5得到重组质粒pase4-Tn5，经Not I酶切检验正确后转化E.coli DH5α(λpir)得到供体菌p4Tn5-DH5α。将供体菌p4Tn5-DH5α、辅助菌E.coli DH5α(pRK2013)和受体菌pf36混合孵育后得到接合子p4Tn5-pf36，将其接种到SMA平板上出现明显水解带，而空转化接合子Tn5-pf36并没有出现脱脂奶粉降解现象(图6中B图)。提取p4Tn5-pf36基因组DNA，经Southern杂交检测确定pase4基因以单拷贝插入到受体菌pf36基因组中(图6中D图)。说明蛋白酶pase4基因成功整合到pf36基因组中并得到正确表达。
2、p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36发酵上清液杀线虫生物活性测定
(1)方法
将p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36分别接种于含有Kan(34μg/mL)的LB培养基中，37℃，200rpm培养48h后，离心收集发酵上清液。试验共设置如下处理：p4MCS-pf36发酵上清液、MCS-pf36发酵上清液、p4Tn5-pf36发酵上清液、Tn5-pf36发酵上清液、pf36发酵上清液、LB+Kan和H2O，浸泡48h后统计各处理液中线虫死亡率，每处理5重复。
(2)结果
用p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36发酵上清液浸泡线虫48h的结果表明(图7中A图)，p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36处理的线虫死亡率分别为63.9％和42.0％，两者间差异显著(p＜0.05)，并都显著(p＜0.05)地高于其它处理。MCS-pf36、Tn5-pf36和pf36处理的线虫死亡率分别为12.7％、10.3％和12.3％，三者无显著(p＞0.05)差异，但都显著(p＜0.05)高于LB+Kan和H2O处理。当浸泡时间为60h时，p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36处理的线虫表现的毒性性状(图7中B图)与用蛋白酶PASE4处理的相似，而在pf36对照处理中，线虫没有表现异常的变化。因此推断，pase4基因可以通过改造菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36介导表达，并实现对香蕉穿孔线虫的毒杀作用，且在相同的处理条件下，p4MCS-pf36比p4Tn5-pf36的杀线虫活性更强。
3、p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36对香蕉穿孔线虫防治效果及其对作物安全性测定
(1)方法
供试香蕉穿孔线虫为从巴西蕉根际土壤中分离的种群，供试香蕉品种为大蕉(Musaparaolisiac)，种植基质为沙土∶炭土∶有机土＝1∶1∶2(121℃灭菌30min)，盆钵1.8L塑料花盆(装基质土1.5L)。试验共设置如下处理：p4MCS-pf36+香蕉穿孔线虫(RS)、p4Tn5-pf36+RS、MCS-pf36+RS、Tn5-pf36+RS、pf36+RS、LB+RS、H2O+RS、p4MCS-pf36、p4Tn5-pf36、pf36和H2O。当香蕉苗长至5～6叶期时，需接菌的处理按菌液浓度为106cfu/g(基质土)注入香蕉苗根际土壤中，接菌3d后再接种香蕉穿孔线虫，接虫量为1000条(混合虫态)/株，接种方法参照Wang等(2016)。蕉株被接种线虫后在温室条件(25～32℃)生长90d，统计各处理香蕉苗的株高、鲜重、根重、根内线虫数、基质线虫数及线虫繁殖率等指标，评估遗传改造菌对香蕉穿孔线虫的防治效果及其对香蕉作物的安全性。共进行2次试验，每次试验设置4个重复。
(2)结果
盆栽试验结果表明，p4Tn5-pf36+RS处理的香蕉苗根内线虫数(每克)、基质土线虫数和总线虫数都显著(p＜0.05)低于其它处理，而株高、茎&叶鲜重和根重均显著(p＜0.05)大于其它接种RS的处理。
在另外的6个接种RS的处理中，p4MCS-pf36+RS处理的香蕉苗根内线虫数(每克)和总线虫数与其他5个处理差异均不显著(p＞0.05)，该处理的株高与pf36+RS处理株高差异不显著(p＞0.05)，但显著(p＜0.05)高于其他4个处理，该处理的茎&叶鲜重和根重与MCS-pf36+RS、Tn5-pf36+RS、pf36+RS处理差异不显著(p＞0.05)，但显著(p＜0.05)大于LB+RS和H2O+RS处理。因此，改造菌p4Tn5-pf36对香蕉穿孔线虫的防控效果最好，能显著(p＜0.05)抑制香蕉穿孔线虫的繁殖数量，且植株长势较好(图8)；然而，p4MCS-pf36对香蕉穿孔线虫的防控效果并不明显。
此外，改造菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36对香蕉苗的安全性测定结果显示，p4Tn5-pf36处理与pf36、p4MCS-pf36和H2O处理相比，株高显著(p＜0.05)最低，地上部和根部鲜重差异不显著(p＞0.05)，而pf36、p4MCS-pf36和H2O处理之间的株高、茎&叶鲜重和根重均无显著(p＞0.05)差异；经p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36处理的植株没有表现出明显的受害症状，因此确定改造菌对香蕉作物安全。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1695
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgaaaaaac atcaggtctc atctagtatt attgctacta ttttgttagg gtcaagctta 60
ttgggaggcg gacttccagc attcgcaaaa agtaatgtta tgtataatag cgactgggaa 120
actccttctt acatgagtga gacatggaaa gcacctaaga aagtcaaaaa gcaagagatt 180
gtttggaaat atttatccga caagagtgat gtacttaaag tacaaggcga ggtagagaat 240
cagtttgaat tgctaaacga aatagaggat acagacactg acacaactca ttaccgtcta 300
cgtgaggtat ataaaggggt tccagtgtac ggctcagatc agactgtgca tctaaatgaa 360
gacggggatg taacttcctt ctttggacaa gtagttccta cagagtctct gaaaaaagta 420
aaaacaaagc ctaaattaaa agaaaatgat gcgattaaag ctatcaaaaa agatttgaag 480
aaggaggtag gggaagtatc agaatttagc gttgacccag aggcagattt atatatctat 540
cctcaggaga ataaggtttc tttggcctat ataacagagg ttaccttcct tgaaccagaa 600
ccaggccgtt ggttctatgc aatcgatgca cataatggaa aggtcttaga caaatataac 660
attatggagc atgtgacaaa ggcgcataag tctaatatca aagtaggaga agctgtagat 720
tcaactgttg atgttcgatc cttggatgga caagcagatg atgctggttc agccgatcca 780
aaagaattag gcacaggtaa aggggtttta ggtgatacga aaacattccc aaccacatat 840
gctaacggga cctattcttt gaaggacact actcgcggta aaggagttga aacgtataca 900
gcgcgtaatg gcaccactta tatgtaccca gtaacaagta caaataacaa attcgacgat 960
ccagccgcag ttgatgcaca tgcttatgcg ggcaaagtgt acgactacta taaaaacaca 1020
tttaatcgtg atagctttga taatgctggc gccaagctta attctatcgt tcattattct 1080
acggactata acaatgcctt ctgggatggc gctgagatgg tgtatggcga tggagatggc 1140
aaaaaattca tcagtttatc gggcggcctt gacgtaattg ctcatgaatt aactcatgct 1200
gtaacagaaa gaacagcagg cttgatttat agaaatgagt caggtgcatt gaatgaatct 1260
atttcggaca tttttggtgc aatggtagat cgagatgatt gggaaatcgg tgaagatatt 1320
tacactcctg atattcctgg ggatgcactg cgctcactct ctgacccagc taaatataat 1380
caccctgacc atatgagcaa aaaatataca ggcactaaag ataatggtgg cgttcatacc 1440
aatagcggta tcaataacaa agcagcctac ctgatttctg aaggtggcac tcattatgga 1500
gtcacggttg aaggagtagg acgcgaagca actgaaaaaa tttactatcg tgcattaacg 1560
gtttatctaa cgtcaacctc taactttgct caaatgcgtc aagcagcaat caatgcagca 1620
acagatttat acggtgctga ttccgctgaa gtacaagcag taaaagatgc ttacaaagcg 1680
gttggtatca actaa 1695

Claims (4)

1.一种香蕉穿孔线虫伴生细菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)pf36，其特征在于，于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：60278。
2.将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的编码基因PASE4通过载体转化和接合转座方法导入权利要求1所述荧光假单胞菌pf36中得到的重组生防菌株在防治香蕉穿孔线虫中的应用。
3.权利要求1所述荧光假单胞菌pf36在构建能够与香蕉穿孔线虫共生的功能菌方面的应用；
所述应用具体是将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的编码基因PASE4通过载体转化和接合转座方法导入所述荧光假单胞菌pf36构建杀线工程菌。
4.权利要求1所述荧光假单胞菌pf36在构建香蕉穿孔线虫生防工程菌方面的应用；
所述应用具体是将核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的编码基因PASE4通过载体转化和接合转座方法导入所述荧光假单胞菌pf36构建杀线工程菌。
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