CN103289947A

CN103289947A - 一种杀松材线虫的工程菌及其应用

Info

Publication number: CN103289947A
Application number: CN2013102555081A
Authority: CN
Inventors: 黄天培; 林群新; 关雄; 张灵玲; 吴昌标; 钱小莉; 郑颖; 沙莉; 黄响珠; 周勇; 林燕珍; 戴瑞卿
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明涉及一种杀松材线虫的工程菌及其应用。本发明的一种杀松材线虫的工程菌（CGMCCNO：7661），以松材线虫为靶标，通过生物活性测定法结合基因鉴定和质谱分析法获得获得杀松材线虫的Bt杀虫晶体蛋白；取表达载体pGEX-KG质粒，与重组质粒pMD18T-cry1Ea11构建融合表达载体pGEX-cry1Ea11，转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)，获得一种杀松材线虫工程菌BL21(DE3)-pGEX-cry1Ea11。本发明为进一步研究利用Bt杀虫晶体蛋白防治松材线虫的生物农药打下基础，拓宽了Bt杀虫谱，为生物防治松材线虫开辟了一条新的途径。

Description

一种杀松材线虫的工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种工程菌及其应用，具体涉及一种杀松材线虫的工程菌及其应用，属于生物农药技术领域。

背景技术

松材线虫 [Bursaphelenchus xylophilus（Steiner & Buhrer）Nickle; pine wood nematode，PWN] 属于线虫动物门、线虫纲、垫刃目（Aphelenchida）、滑刃总科、滑刃科（Aphelenchoidedae）、伞滑刃线虫属（Bursaphelenchus）。PWN兼有噬菌特性和取食树体内薄壁细胞的功能，可导致素有松树“癌症”之称的松材线虫病，是世界四大森林病害之一，同时也是我国一种主要的外来入侵生物病害。它严重危害我国松林安全，能危害8种非松属植物和36种松属植物。由于松材线虫病能使多种松树迅速死亡，危害严重，防治极其困难，国内外给予高度的重视，很多国家一直将其作为有害生物检疫对象。松材线虫病最早在日本长崎发现，到2009年，松材线虫病已传播到北美（加拿大，美国和墨西哥）、欧洲（葡萄牙）和亚洲（日本，韩国和中国），已成为松树林和森林生态系统的一种世界性的威胁。2003年，松材线虫病杀死了日本大约10×10⁵立方米的松树。我国于1982年首次在南京中山陵的黑松上发现松材线虫病，短短三十几年来，该病疫情由1省1市1区传播到粤、鲁、皖、浙、鄂、渝、桂、沪、闽、湘、黔、滇、赣的l4个省市区及台湾和香港地区，2004年已传播到四川的邻水。松材线虫病具有致病能力强、传播迅速、寄主死亡的速度快，防治难度大等特点，不仅具有危害方面的严重性与毁灭性，而且具有治理方面的艰巨性与长期性，从而造成巨大的经济损失。由于松材线虫病的严重危害性，一旦发生就很难控制，所以目前在松材线虫病的防治方面还是实行“以防为主，防治结合，防重于治”的方针。另外，由于松材线虫病的致病机理还没有厘清，所以至今松材线虫病的防治仍然面临许多难题。因此，鉴于目前防治PWN策略中存在的弊病，有必要开发新的可持续抗PWN策略。

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是一种革兰氏染色阳性（G+）细菌，属于芽胞杆菌属中的一个种，在土壤中广泛存在。它有别于其他芽胞杆菌的特征是在细菌产生芽胞的过程中，会在菌体的一端或两端形成具有蛋白性质的伴胞晶体。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。从20世纪60年代人们发现Bt杀虫晶体蛋白对线虫有特异活性以来，国外研究者们开展了大量有关这方面的研究，克隆出了抗线虫的相关基因。近年来研究发现，Bt对PWN也有一定的杀灭作用，但Bt对PWN的研究却一直没有深入进行，Bt生防潜力没有得到充分的发掘。

因此，通过以松材线虫为靶标，获得高效杀松材线虫的Bt杀虫晶体蛋白，不仅可以广辟资源，扩大Bt的防治谱，而且可以减少化学农药对环境的污染，具有显著的生态效应和经济效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杀松材线虫的工程菌及其应用。

实现本发明目的技术方案如下：

本发明的一种杀松材线虫的工程菌是人工构建的含Bt杀松材线虫晶体蛋白基因cry1E的工程菌，宿主为大肠埃希氏菌（Escherichia coli），于2013年5月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏号为：CGMCC NO：7661；对杀松材线虫具有活性。

本发明的一种杀松材线虫工程菌（CGMCC NO：7661）的构建方法，包括以下步骤：

（1）菌株的筛选：在市场购买来的大量Bt菌株中，筛选出杀松材线虫活性最强的Bt菌株，对其杀虫晶体蛋白进行杀松材线虫毒力的测定，并对该杀虫晶体蛋白进行质谱测序和基因克隆。

（2）构建重组质粒pMD18T-cry1Ea11：以含cry1Ea11基因的Bt菌株DNA为模板，设计一对cry1Ea11引物cry1EF和cry1ER，克隆获得一个5’端含BamH I位点和3’端含Sal I酶切位点的3528 bp的cry1Ea11.。引物cry1EF和cry1ER的序列如下：

cry1EF：5'-CGGGATCCATGGAGATAGTGAATAATCAGAATC-3'

cry1ER：5'-ACGCGTCGACTTATTCCTCCATAAGAAGTAATTC-3'；

将cry1Ea11基因与克隆载体pMD18-T连接，构建重组质粒pMD18T-cry1Ea11，进行菌落PCR及双酶切验证。

（3）构建融合表达载体：取表达载体pGEX-KG质粒，与重组质粒pMD18T-cry1Ea11构建融合表达载体pGEX-cry1Ea11，用BamH I和Sal I分别双酶切表达载体和重组质粒并回收目的片段；酶切产物跑胶回收后连接；融合表达载体pGEX-cry1Ea11如图1所示。

（4）转化大肠杆菌BL21(DE3)：利用菌落PCR和单双酶切验证筛选阳性转化子，筛选得到工程菌BL21(DE3)-pGEX-cry1Ea11，即杀松材线虫工程菌（CGMCC NO：7661）。

（5）融合蛋白的诱导表达和纯化：将500μL过夜培养的E.coliBL21(DE3)-pGEX-cry1Ea11工程菌液接种到50mL含有100mg mL^-1Amp的液体LB中，37℃、250r/min培养至OD₆₀₀=0.6-0.8，加入IPTG，使其终浓度为1.0mM。16℃、150r/min诱导30h以使其表达融合蛋白。经过细胞收集、细胞破碎后，利用谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S-transferase，GST）标签纯化获得融合蛋白。所述LB培养基为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g溶于1L蒸馏水，分装后灭菌；IPTG为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside）。

（6）融合蛋白的活性测定：在96孔板中加入松材线虫悬浮液100μL（每孔中100条）。将纯化的融合蛋白GST-Cry1Ea11进行活性测定。结果表明：融合蛋白浓度的对数和松材线虫的校正死亡率成正相关性，杀虫效果随着时间的延长而提高。

以上的构建方法中如无特殊说明均为常规方法。

本发明具有以下优点与积极效果：

本发明利用质粒重组技术构建了可表达杀松材线虫蛋白的大肠埃希氏菌工程菌，并以松材线虫为靶标，通过生物活性测定对大肠杆菌工程菌进行杀线虫活性测定，获得一株高效杀松材线虫的大肠埃希氏菌工程菌（CGMCC NO：7661）。利用大量繁殖杀松材线虫的大肠埃希氏菌工程菌可以生产高效杀松材线虫的Bt杀虫晶体蛋白，为进一步研究利用苏云金杆菌杀虫晶体蛋白防治松材线虫的生物农药打下基础。本发明的杀松材线虫的大肠杆菌工程菌拓宽了Bt杀虫谱，为生物防治松材线虫开辟了一条新的途径。

附图说明

图1为杀松材线虫工程菌（CGMCC NO：7661）融合表达载体pGEX-cry1Ea11的示意图。

具体实施方式

　为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。实施例中的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

实施例1、一种杀松材线虫工程菌（CGMCC NO：7661）制剂的制备方法

1、按1%（V/V,下同）接种量，在5mL LB液体培养基（含终浓度100μg mL^-1 Amp 抗生素）中接入50μL -70℃保存的工程菌（CGMCC NO：7661），37℃、150 r/min培养12 h；

2、取步骤1的培养液，利用平板划线法于LB固体平板（含终浓度100μg mL^-1 Amp 抗生素）37℃培养24 h，得到单菌落；

3、取单菌落接种于5mL LB液体培养基（含终浓度100μg mL^-1 Amp 抗生素），37℃、150 r/min培养12 h；

4、按1%接种量，将200μL培养液转接到20mL LB液体培养基（含终浓度100μg mL^-1 Amp 抗生素），37℃、150 r/min培养至OD₆₀₀=1；

5、按1%接种量，将500μL培养液转接到50mL LB液体培养基（含终浓度100μg mL^-1 Amp 抗生素），37℃、250 r/min培养至OD₆₀₀=0.6-0.8，加入200mg mL^-1 IPTG 62.5μL，使其终浓度为1.0 mM。16℃、15 r/min诱导30 h，得到工程菌（CGMCC NO：7661）制剂。

实施例2、一种杀松材线虫工程菌（CGMCC NO：7661）的应用

一种杀松材线虫工程菌（CGMCC NO：7661）的应用，包括以下步骤：

（1）松材线虫的培养和分离

松材线虫从感病黑松通过贝尔曼漏斗法分离而来。流程如下：将灰葡萄胞接种在PDA平板中，在25℃下静置培养。待菌丝长满整个平板后，接种松材线虫，25℃下培养7d后分离、收集。使用时将含有线虫的培养基放入漏斗中，并用无菌水洗出，1000-1500r/min离心、消毒（0.1%的硫酸链霉素），浓缩配制成10条/μL的线虫悬液。

（2）农药样品的制备

Bt HD1、8010和BRC-XQ12分别以1%接种量接入5mL LB液体培养基中，30℃、200r/min活化过夜，再按1%接种量转接至50mL LB培养基中，30℃、200r/min培养3d左右，其产生晶体后，将发酵液稀释到OD₆₀₀值为1.0，备用。杀松材线虫工程菌（CGMCC NO：7661）制剂的制备方法参照实施例1，备用。于市场购买辛硫磷、溴氰菊酯和杀螟丹化学农药，稀释成10、100、500、1000、5000和10000倍液，备用。

（3）生物活性测定

分别吸取100μL农药样品加入96孔培养板中，每孔中加入幼虫悬浮液100μL（100条），混合均匀。以液体LB培养基处理为对照，每处理重复3次。将96孔培养板置于25℃、黑暗保湿条件下培养，48h后用显微镜观察，检查线虫的死亡数。死虫和活虫的判断标准：凡不活动且虫体成“C”形、“J”形或虫体僵直者均判为死虫；凡活动者或者虫体成波浪形、螺旋形、卷曲形、“S”形的均判为活虫。计算校正死亡率。

以上述实验结果为基准，再设置8个浓度梯度，3个重复，计算LC₅₀，结果如表1所示。实验结果表明，工程菌（CGMCC NO：7661）在48h时LC₅₀最小。

表1 不同处理对松材线虫的防治效果

注：表1中，0为商业化培养基、1-3为商业化化学农药、4-5为商业产品菌株制剂、6为含有cry1Ea11基因的Bt菌株制剂、7为杀松材线虫工程菌（CGMCC NO：7661）制剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种杀松材线虫的工程菌，其特征在于该菌株为人工构建质粒的工程菌，宿主为大肠埃希氏菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：7661。

2.根据权利要求1所述的杀松材线虫的工程菌，其特征在于含Bt杀松材线虫晶体蛋白基因cry1Ea11。

3.根据权利要求1或2所述的一种杀松材线虫的工程菌，其特征在于对杀松材线虫具有活性。

4.根据权利要求1或2所述的一种杀松材线虫的工程菌，其特征在于具有融合表达载体pGEX-cry1Ea11。

5.一种如权利要求1所述的工程菌在杀松材线虫上的应用。