CN112626112B - 玉米miR408基因在调控植物耐渗透胁迫及培育抗耐渗透胁迫植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了玉米miR408基因在调控植物耐渗透胁迫及培育抗耐渗透胁迫植物中的应用。通过转基因手段得到的含玉米miR408基因的转基因植株在干旱和盐等渗透胁迫条件下出现萌发率高、根变长，植株生长较快，因此，miR408基因具有显著提高植物对干旱和盐等渗透胁迫耐受性的作用，为将来利用玉米miR408基因对玉米等植物进行遗传改良，和缩短玉米及其他作物育种年限、提高育种效率提供有效的基因资源。

Description

玉米miR408基因在调控植物耐渗透胁迫及培育抗耐渗透胁迫 植物中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及玉米miR408基因在调控植物耐渗透胁迫及培育抗耐渗透胁迫植物中的应用。

背景技术

植物在其自然生长过程中，因为不能移动，需要适应复杂多变的环境因素，如干旱胁迫、低温胁迫、淹水胁迫和高盐胁迫。一些逆境因子往往是相互联系、相伴而生，并严重影响植物的生长发育、分布以及产量。玉米是世界上分布范围最广、种植面积最大的粮食作物之一，几千年来一直是人类和家畜的重要食物，提高玉米的抗逆性对进一步提高玉米产量具有十分重要的意义。采用传统育种方法改良玉米周期较长、且优质耐逆育种资源有限而具有较大的不确定。充分利用玉米基因组信息挖掘耐逆相关基因并探索其生物技术育种应用十分必要。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出玉米miR408基因在调控植物耐渗透胁迫及培育抗耐渗透胁迫植物中的应用，该基因能够促进植株在渗透胁迫下的萌发与生长。

根据本发明的第一方面实施方式的玉米miR408基因的应用，所述应用为调控植物耐渗透胁迫中的应用。

根据本发明的一些实施方式，所述植物为玉米、拟南芥和/或水稻。

根据本发明的一些实施方式，所述应用为调控植物的抗旱性。

根据本发明的一些实施方式，所述应用为调控植物的抗盐性。

根据本发明的一些实施方式，所述应用为玉米miR408基因在培育抗耐渗透胁迫植物中的应用。

一种培育抗耐渗透胁迫植物的方法，所述方法包括将上述玉米miR408基因导入目的植物中的步骤。

根据本发明的一些实施方式，所述导入是通过含有上述玉米miR408基因的重组载体实现的。

根据本发明的一些实施方式，所述载体为TSK108和/或pGWB614质粒载体。

根据本发明的一些实施方式，所述目的植物为拟南芥和/或水稻。

一种培育抗耐渗透胁迫拟南芥的方法，该方法包括以下的步骤：

S1、以玉米的DNA为模板，利用PCR方法扩增到上述玉米miR408基因的序列；

S2、将步骤S1所得的玉米miR408基因与TSK108载体进行重组连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过抗生素筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒TSK108-miR408；

S3、将步骤S2提取出的质粒与载体pGWB614质粒重组后，转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过抗生素筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取质粒，命名为pGWB614-miR408；

S4、经鉴定正确的阳性质粒pGWB614-miR408，通过农杆菌介导法转化到拟南芥野生型植株中，筛选转基因植株。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述的抗生素为卡那霉素。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中所述的质粒重组采用In-Fusion克隆方法。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中所述的抗生素为壮观霉素。

根据本发明的一些实施方式，步骤S4中所述的筛选转基因植株的方法为喷洒Basta除草剂。

一种培育抗耐渗透胁迫水稻的方法，该方法包括以下的步骤：

将上述鉴定正确的阳性质粒pGWB614-miR408，通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤组织；然后将愈伤组织进行选择培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有抗生素的分化培养基上分化、生根培养，最后将转基因植株挑出进行炼苗、移栽。

根据本发明的一些实施方式，所述抗生素为潮霉素与羧苄青霉素钠。

根据本发明实施方式的玉米miR408基因，至少具有如下有益效果：通过包含所述玉米miR408的基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥和水稻愈伤组织，筛选培养，获得纯合的拟南芥和水稻转基因株系，通过转基因手段得到的转基因植株在干旱和盐等渗透胁迫条件下出现萌发率高、根变长，植株生长较快，因此，miR408基因具有显著提高植物对干旱和盐等渗透胁迫耐受性的作用；本发明为将来利用玉米miR408基因对玉米等植物进行遗传改良，和缩短玉米及其他作物育种年限、提高育种效率提供有效的基因资源。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例4中高盐胁迫下转玉米miR408基因拟南芥的种子萌发和根长情况图，其中，WT为对照，OX408为转基因拟南芥；

图2为本发明实施例4中干旱处理下转玉米miR408基因拟南芥的种子萌发和根长情况图，其中，WT为对照，OX408为转基因拟南芥。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1目的基因的克隆与转化

玉米miR408基因的克隆与转化，具体步骤如下：

(1)使用THERMO SCIENTIFIC KINGFISHER植物DNA提取试剂盒从玉米根(茎、茎尖、叶片、木质部、果实、花序、雄花和/或雌花组织)中提取DNA；

(2)利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计玉米miR408基因序列(SEQ IDNo.1)扩增引物，引物的核苷酸序列如下所示：

Zma408F：GTCGACGGTATCGATAAGCTTATTACAATAGAATTGTTGTAAACCCTATTG(SEQ IDNo.2)

Zma408R：CGCTCTAGAACTAGTGGATCCACAAACCGGGAGGAGG(SEQ ID No.3)；

(3)利用步骤(2)设计的PCR引物对步骤(1)获得的DNA进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒回收PCR产物；

(4)用BamH I/Hind III酶将TSK108质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用胶回收试剂盒进行回收，利用In-Fusion克隆方法将玉米miR408基因片段连接至TSK108；

(5)将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂到含有卡那霉素的LB培养基上，待长出单菌落后从培养皿中挑取阳性单菌落进行菌落PCR，选取PCR检测条带大小符合的单菌落扩大培养，收集菌体提取质粒后进行双酶切检测反应，将酶切检测后出现目的条带的质粒送去公司测序，将测序结果显示已连入目的基因的质粒分别命名为TSK108-miR408；

(6)然后将步骤(5)所得的质粒载体与载体pGWB614质粒通过Gateway的LR反应重组，25℃反应1h，转化大肠杆菌后涂于含有壮观霉素的LB培养基中，随机挑取5个阳性单菌落进行PCR检测，将检测正确的阳性的单菌落送去公司测序，选取测序正确的阳性单菌落摇菌，提取质粒载体，命名为pGWB614-miR408。

步骤(1)所述的玉米miR408基因核苷酸序列(SEQ ID No.1)如下所示：

ATTACAATAGAATTGTTGTAAACCCTATTGCAGGGACCTGCGGTGTTTATTAGTACTGGTGCAAAGACAGCCAAATTAGTGTAGGACTTGTACTGAGAAAAGAATGCAGGAAAAAAAATTATACAAAACCATAACGAGAGAGAGAAAGAGAGAGGATAGGTGGATGGGAGACGGTGAGGAGCCAGGGAAGAGGCAGTGCAGGGGAGGGAGCAACAACGCCTGAGTGTGTTTGTGGTGAGTCCCTCCATTTTGTGAGCGAGCAAACAGAAATCAAATTTGGAATTCTGTTGATGGCCCCCTACCCATGCTCTGCCTCGTCCCTGTCTCCGATCAAACCCAACCCACCTCTCGCTCTCCTTACCTGTGTGTGTCTGTGCTAACGCTAAAGGTACCAACTCCATGGAACATTGGAGATCTATATATACACGCACGCAGCAAAGAATTAACTTGCCGCAGCGCAGTGCAGTACAGTACCGCTAGAGAAGCAGGCCTCGCTGGCTTTGTTTCGTCAGTACAACTCGTACTGCAATGCAACACACCCAAACCATGTGAGACGCCCGGCTGCCCCCGCCAGTACGTACCGCAAGCAGCGGCCATGCCGTACATCTTCCTCCTCCCGGTTTGT

实施例2抗耐渗透胁迫拟南芥的培育

一种抗耐渗透胁迫拟南芥的培育方法，该方法包括以下的步骤：

(1)将实施例1所得的pGWB614-miR408载体通过电击法转入到农杆菌感受态中，将重组农杆菌接种至含有卡那霉素和利福平的固体筛选培养基上，28℃恒温倒置培养至长出单菌落，随机挑取阳性单菌落进行PCR检测，单菌落所扩增出来的条带与阳性对照大小一致，符合条件，说明含有miR408基因的质粒成功转入到农杆菌中；

(2)采用农杆菌浸染拟南芥花序法，使用农杆菌将构建好的pGWB614-miR408转化至拟南芥野生型植株中，喷洒Basta除草剂筛选转基因植株。

实施例3抗耐渗透胁迫水稻的培育

一种抗耐渗透胁迫水稻的培育方法，该方法包括以下的步骤：

(1)将实施例1所得的pGWB614-miR408载体通过电击法转化到根癌农杆菌EHA105中，将重组农杆菌接种至含有卡那霉素和利福平的固体筛选培养基上，28℃恒温倒置培养至长出单菌落，随机挑取11个菌落进行PCR检测，单菌落所扩增出来的条带与阳性对照大小一致，符合条件，说明含有miR408基因的质粒成功转入到农杆菌中；

(2)从含有卡那霉素和利福平的固体筛选培养基上挑选单菌落放入相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、250rpm过夜培养至OD600值约为0.8，5000rpm离心后弃上清，用N6液体培养基重悬沉淀；

(3)将诱导的胚性愈伤组织用解剖刀从外植体上剥离后，用制备好的菌液侵染愈伤组织10-30min后将愈伤组织转移到无菌滤纸上吸干水分，转入含100TM的乙酰丁香酮的N6培养基上培养3天用无菌水将愈伤组织清洗干净后转入含有25-50mg/L潮霉素与200-400mg/L羧变青霉素钠的N6固体培养基上筛选1-3周，将抗性愈伤组织转入新的培养基中继续筛选2-3周后，将抗性愈伤组织转入MS培养基进行分化、生根培养，获得转化植株后移栽盆钵中进行常规技术进行水稻栽培管理。

实施例4拟南芥的抗耐渗透胁迫

1、高盐胁迫处理

以MS作为基本培养基，培养基中加入8g/L琼脂粉、30g/L蔗糖和50mmol/L的NaCl，溶液配置后用1mol/L NaOH调节pH值至5.6-5.9之间，121℃灭菌30min后备用。

2、干旱处理

以MS作为基本培养基，培养基中加入8g/L琼脂粉、30g/L蔗糖和100mmol/L的甘露醇(mannitol)，溶液配置后用1mol/LNaOH调节pH值至5.6-5.9之间，121℃灭菌30min后备用。

3、种子播种

将转基因拟南芥和哥伦比亚野生型拟南芥的种子分别放入已做好标记的1.5mLEP管中后，加入1mL70％的酒精震荡处理15min，离心30s，在超净工作台中倒掉乙醇后用灭菌水仔细吹洗种子，重复清洗4次，直到乙醇溶液清洗干净。往消毒后的种子中加入大约1mL0.1％的琼脂糖溶液，使种子处于悬浮状态，用移液枪吸取种子均匀的单个点播到MS培养基上(干旱处理、高盐胁迫处理)，封口膜密封后对整个培养皿进行遮光处理，4℃春化，3天后置于光照下正常培养，每24小时统计种子萌发数并拍照记录，判断萌发的标准为把播种有材料的培养皿放在黑色背景下，可以见到种子露白。用于观测根长的培养皿置于光照下竖直培养，光照培养下第7天测量根长并记录。每个实验做三次重复，整体重复两次。

4、统计方法

发芽率＝已萌发种子数/总种子数×100％。

根长变化率＝(处理组根长－对照组根长)/对照组根长×100％。

本试验数据采用Excel软件进行统计分析。

5、实验结果

高盐胁迫处理实验结果如图1所示，其中，A、B为相同处理下转玉米miR408基因拟南芥的种子萌发情况，C、D为相同处理下转玉米miR408基因拟南芥的种子根的生长情况，从图中可以看出转基因植株在高盐渗透胁迫条件下相较对照组萌发率更高、根的长度生长更快，植株生长较快。干旱处理实验结果如图2所示，其中，A、B为相同处理下转玉米miR408基因拟南芥的种子萌发情况，C、D为相同处理下转玉米miR408基因拟南芥的种子根的生长情况，从图中可以看出，转基因植株在干旱胁迫条件下相较对照组萌发率更高、根的长度生长更快，植株生长较快。

miRNA是一种长度为21～24nt的单链非编码RNA，具有序列特异性，主要在转录后水平上介导内源性基因的沉默，其编码基因普遍存在于动物、植物及微生物中。随着研究方法和手段日趋成熟，对miRNA的研究在不断进步，越来越多的miRNA编码基因在不同物种中被鉴定出来，一些miRNAs的功能已逐渐得到证实。如番茄miR169c的表达受到干旱胁迫的诱导，过量表达miR169c能够提高番茄植株的抗旱性；在拟南芥中过表达大豆miR394后，发现转基因拟南芥植株的抗旱性增强。

miR408是一类在陆生植物中具有较高保守性的miRNA家族，在已研究的物种中甘蔗分布的miR408成员最多，包括miR408a、miR408b、miR408c、miR408d、miR408e等5个。已有的研究表明miR408参与了植物生长发育的许多过程，包括营养生长、抽穗时间、光合作用和产量以及叶片衰老和脱落。miR408也还被认为是参与环境胁迫应答的物质，但不同物种miR408对环境胁迫的响应程度及机制不同，影响其应用。拟南芥在正常生长条件下，miR408的表达水平低，但是在缺铜时表达量显着增加；拟南芥miR408过量表达反而会降低植物对渗透胁迫等的耐受性；受到干旱胁迫时，miR408在在苜蓿和大麦体内的表达量上升，而在水稻和桃树中研究正好相反，表达量是下降的。现有技术中尚未有将玉米miR408应用于拟南芥、水稻等植物中的相关报道，本发明方案取得了意料之外的效果。

综上所述，本发明提供的miR408基因，该基因具有非编码miRNA的特点，进一步将该基因转到拟南芥中，获得转基因植株，发现转基因植株在干旱和盐等渗透胁迫条件下出现萌发率高、根生长变快，植株生长较快等表型，表明该基因在玉米耐渗透胁迫中起着重要的调控作用。将来利用玉米miR408基因对玉米等植物进行遗传改良，可为缩短玉米及其他作物育种年限、提高育种效率提供有效的基因资源。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 玉米miR408基因在调控植物耐渗透胁迫及培育抗耐渗透胁迫植物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 625

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attacaatag aattgttgta aaccctattg cagggacctg cggtgtttat tagtactggt 60

gcaaagacag ccaaattagt gtaggacttg tactgagaaa agaatgcagg aaaaaaaatt 120

atacaaaacc ataacgagag agagaaagag agaggatagg tggatgggag acggtgagga 180

gccagggaag aggcagtgca ggggagggag caacaacgcc tgagtgtgtt tgtggtgagt 240

ccctccattt tgtgagcgag caaacagaaa tcaaatttgg aattctgttg atggccccct 300

acccatgctc tgcctcgtcc ctgtctccga tcaaacccaa cccacctctc gctctcctta 360

cctgtgtgtg tctgtgctaa cgctaaaggt accaactcca tggaacattg gagatctata 420

tatacacgca cgcagcaaag aattaacttg ccgcagcgca gtgcagtaca gtaccgctag 480

agaagcaggc ctcgctggct ttgtttcgtc agtacaactc gtactgcaat gcaacacacc 540

caaaccatgt gagacgcccg gctgcccccg ccagtacgta ccgcaagcag cggccatgcc 600

gtacatcttc ctcctcccgg tttgt 625

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcgacggta tcgataagct tattacaata gaattgttgt aaaccctatt g 51

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgctctagaa ctagtggatc cacaaaccgg gaggagg 37

Claims (5)

1.玉米miR408基因在提高植物抗旱性和抗盐性中的应用，其特征在于，所述玉米miR408基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述植物为拟南芥。

2.玉米miR408基因在培育具有抗旱性和抗盐性的植物中的应用，其特征在于，所述玉米miR408基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述植物为拟南芥。

3.一种培育抗旱性和抗盐性植物的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求1中所述基因导入目的植物中的步骤；所述目的植物为拟南芥。

4.如权利要求3所述的培育方法，其特征在于：所述导入是通过含有权利要求1所述的目的基因的重组载体实现的。

5.如权利要求4所述的培育方法，其特征在于：所述载体为TSK108或pGWB614质粒载体。

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