CN107574181A

CN107574181A - 调控植物光合作用的miR408及其应用

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Publication number: CN107574181A
Application number: CN201710964220.XA
Authority: CN
Inventors: 李磊; 潘加伟
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明公开了调控植物光合作用的miR408及其应用。本发明发现植物miR408对光合作用具有调控功能，在植物中过表达miR408，气体交换和光谱性质两方面的光合参数测定的结果表明，miR408转基因植物的光合作用显著改善，miR408及其编码基因可用于创制高光合作用的植物新品种，具有广阔的应用前景。

Description

调控植物光合作用的miR408及其应用

技术领域

本发明涉及植物光合作用研究领域，特别涉及一种影响植物光合作用的microRNA(miRNA)的研究，以及该miRNA在培育转基因植物新品种方面的应用。

背景技术

植物光合作用是地球上最重要的化学反应，是生命的发动机也是新绿色革命的核心问题，对植物光合作用的研究关系着人类未来能源的新希望。植物光合作用的大致机理目前已被研究得较为清楚，自然界中植物通过光合作用将光能转化为化学能。位于叶绿体中内囊体内膜含有叶绿素分子的光系统I(photosystem I)和光系统II(photosystem II)是吸收光能的主要单位。光系统II吸收光能，将水裂解为质子和电子，并产生氧气。质子产生膜内外电势差，驱动ATP合成酶(ATP synthase)运转产生ATP，电子沿电子传递链传递，经去镁叶绿素(Pheophytin)、质体醌(Plastoquinone)、细胞色素b_6/f复合体(Cytochrome b_6/fcomplex)、质体蓝素(Plastocyanin)传递给光系统I，随后，电子又继续传递给铁硫受体分子(Fe-S)、铁氧还原蛋白(Ferredoxin)和黄素(Flavin adenine dinucleotide)，最终传递给电子受体NADP+，黄素中的黄素蛋白(Flavoprotein)将其还原为NADPH。光系统I本身也可吸收光能独立运转，将电子从铁氧还原蛋白传递给质体醌，最终又传递回光系统I，形成一个循环。内囊体膜上的电子传递链过程又称为光依赖反应(light-dependent reaction)，其产生的ATP和NADPH用于在叶绿体基质中进行的光不依赖反应(light-independentreaction)，利用二氧化碳合成糖类。总体而言，植物通过光合作用，将水和二氧化碳转化成有机物并释放氧气，成为生物界赖以生存的基础和地球碳氧平衡重要的媒介。

MicroRNA(miRNA)是一类存在于几乎所有真核生物中内源表达的非翻译单链小分子。miRNA基因经转录加工后形成21个左右核苷酸的成熟miRNA分子，通过序列匹配来指导靶基因转录本的降解或蛋白质翻译的抑制，从而行使沉默基因的功能。近年来，通过分子遗传、生物化学、生物信息等方法，越来越多的植物miRNA功能被阐释，如miR156和miR172协同调控拟南芥营养生长和生殖生长间的转换(Wang et al.,2009,miR156-regulated SPLtranscription factors define an endogenous flowering pathway in Arabidopsisthaliana.Cell 138,738-749；Wu et al.,2009,The sequential action of miR156 andmiR172 regulates developmental timing in Arabidopsis.Cell 138,750-759.)，miR857调控拟南芥维管组织的次级生长(Zhao et al.,2015,MicroRNA857 is involvedin the regulation of secondary growth of vascular tissues inArabidopsis.Plant physiology 169,2539-2552.)，miR319调控拟南芥花瓣的发育和水稻叶形态建成(Nag et al.,2009,miR319a targeting of TCP4 is critical for petalgrowth and development in Arabidopsis.Proceedings of the National Academy ofSciences 106,22534-22539；Yang et al.,2013,Overexpression of microRNA319impacts leaf morphogenesis and leads to enhanced cold tolerance in rice(Oryzasativa L.).Plant,cell&environment 36,2207-2218)。通过基因工程手段，也有许多miRNAs被运用于植物性状的改良，如miR396调控水稻籽粒大小并提高水稻产量(Li etal.,2016,The OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1 regulatory module determines grain sizeand yield in rice.Plant biotechnology journal 14,2134-2146.)，miR397调控水稻穗分枝的数量和籽粒大小，影响水稻产量(Zhang et al.,2013,Overexpression ofmicroRNA OsmiR397 improves rice yield by increasing grain size and promotingpanicle branching.Nature biotechnology,31,848-852.)。

miR408是一类在陆生植物中成熟序列上高度保守的小RNA(参见图1)。在已报道的对miR408功能研究中，通过转基因的方法在植物中过表达miR408，可以(1)增加拟南芥的营养生长；(2)提高拟南芥对高盐、低温和氧化胁迫等逆境环境的抗性；(3)提前小麦的抽穗时间和减小小麦的剑叶夹角；(4)提高鹰嘴豆的抗旱性(Zhang et al.,2013,SQUAMOSApromoter binding protein-like7 regulated microRNA408 is required forvegetative development in Arabidopsis.The Plant Journal 74,98-109；Ma et al.,2015,miR408 is involved in abiotic stress responses in Arabidopsis.The PlantJournal 84,169-187；Zhao et al.,The tae-miR408-Mediated Control of TaTOC1Genes Transcription Is Required for the Regulation of Heading Time inWheat.Plant physiology 170,1578-1594；Hajyzadeh et al.,2015,miR408overexpression causes increased drought tolerance in chickpea.Gene 555,186-193.)。显示出miR408对于植物的性状的改良具有一定的潜在价值，但对于miR408改变植物性状的机制研究还不清楚，例如，miR408促进拟南芥营养生长的机制尚不明确，因此进一步开展对miR408的功能研究将成为探索miR408功能保守性和作用机制的新课题，以及拓展到其它经济作物农艺性状改良技术运用的新途径。

发明内容

本发明的目的在于研究植物miR408的功能，集中于其对于光合作用的调控，为定向创制高光合作用植物品种提供一种有效的方法，以期为能源问题的解决带来一定思路。

本发明发现植物miR408对光合作用具有调控功能，提供了一种提高植物光合作用的方法，即在植物中过表达miR408，显著提高转基因植物的光合作用，进而提高植物的产量。由此可见，miR408及其编码基因可以在植物育种中用于创制高光合作用的植物新品种。

本发明通过植物转基因的方法，获得了ath-miR408，nta-miR408，osa-miR408基因高表达的拟南芥、烟草和水稻材料，并对相关植物材料进行了气体交换和光谱性质两方面的光合参数测定。结果表明，转miR408的三种植物材料相较于对应的野生型，光合作用显著提高。可见，miR408对植物光合作用有着重要影响。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的巨大应用前景，应加以专利保护。

本发明提供的提高植物光合作用的植物miR408可以是拟南芥的ath-miR408，烟草的nta-miR408，水稻的osa-miR408，它们的序列(成熟序列)分别如序列表中SEQ ID No：4，5和6所示。编码ath-miR408、nta-miR408和osa-miR408的基因组序列(前体序列)分别如序列表中SEQ ID No：1，2和3所示。

以序列表中的SEQ ID No：1、2和3所示ath-miR408、nta-miR408和osa-miR408的基因组序列为模版转录得到对应的包含有茎环结构的ath-miR408、nta-miR408和osa-miR408分子前体(pre-athmiR408、pre-nta-miR408和pre-osamiR408)，该分子前体再经剪接加工成SEQ ID No：4、5和6所示的由21个核苷酸残基组成的ath-miR408、nta-miR408和osa-miR408。

上述ath-miR408、nta-miR408和osa-miR408基因，包括它们的成熟片段及其DNA编码序列，以及分子前体及其DNA编码序列都可用于植物光合作用的改良。包含有ath-miR408，nta-miR408，osa-miR408，pre-athmiR408，pre-nta-miR408和pre-osamiR408和其DNA编码序列的重组表达载体、菌株和转基因细胞系都在本发明的保护范围内。

在本发明的一个实施例中，以pre-athmiR408的DNA序列为目的基因，将此核酸片段插入到pJIM19载体中，构建过表达ath-miR408的双元表达载体pJIM19-ath-miR408(即35S::MIR408)。将质粒pJIM19-ath-miR408转入农杆菌GV3101，将col-0背景的拟南芥花器官浸泡法转染农杆菌溶液，获得转基因T0代植株，后代抗性筛选获得T1代阳性植株，标记为#2和#7两个miR408转基因拟南芥种系。同时，将此质粒pJIM19-ath-miR408转入农杆菌GV3101，经由农杆菌转入烟草品种K326的胚性愈伤组织并获得抗性愈伤，继而诱导获得抗性幼苗，标记为#2和#3两个miR408转基因烟草种系。

在本发明的另一个实施例中个，以pre-osamiR408的DNA序列为目的基因，将此核酸片段插入到pCactN载体中，构建过表达osa-miR408的双元表达载体pCactN-osa-miR408(即Actin1::MIR408)。将质粒pCactN-osa-miR408转入农杆菌EHA105，经由农杆菌转入水稻品种中花11号的胚性愈伤组织，并获得抗性愈伤，继而诱导获得抗性幼苗，标记为#5和#6两个miR408转基因水稻种系。

利用实时定量RT-PCR方法检测转基因拟南芥、烟草和水稻的miR408基因和miR408调控的靶基因的表达量结果，结果显示在转基因拟南芥#2和#7，转基因烟草#2和#3，转基因水稻#5和#6种系中，miR408基因表达均高于对应的野生型，而三个物种中miR408调控的靶基因Plantacyanin(AT2G02850),Uclacyanin 2(AT2G44790),Laccase 3(AT2G30210),Laccase 12(AT5G05390),Laccase 13(AT5G07130)，AYMY01071502，AYMY01086385,AYMY01094130,AYMY01225905,AYMY01019538,AYMY01102859,AYMY01380079,Os08g0482700，Os02g0653200，Os02g0731400，Os02g0758800，Os01g0827300，Os03g0297900表达低于野生型，表明这些转化植株中高表达有功能的miR408。

进而，对上述转基因植物进行了相关光合参数测定。结果显示，miR408转基因植物的净光合速率显著提高，说明其碳固定能力增强；转基因植物叶片在不同光强下的光受体II的电子传递速率(ETR)提高，而叶绿素荧光的非光化学淬灭(NTQ)减少，说明转基因植物增强了PSII的光能利用率；质体醌A(Q_A)还原程度1-qP降低，光受体I(PSI)氧化程度增加，说明光合电子传递的作用得到增强。

综上，在这三种植物中过表达miR408对植物的光合作用有显著的改善，也暗示了这个陆生植物保守的miR408调控植物光合作用的功能也是保守的。miR408及其编码基因可以用于定向创制高光合作用的植物品种。

附图说明

图1显示了miR408在陆生植物中的保守性，左侧为选取的代表性的51种陆生植物的物种树，右侧为每种植物对于的miR408的成熟序列。

图2显示了miR408转基因材料中miR408和miR408靶基因的表达水平，其中：a.转基因拟南芥材料#2和#7中miR408和miR408靶基因的表达水平；b.转基因烟草材料#2和#3中miR408和miR408靶基因的表达水平；c.转基因水稻材料#5和#6中miR408和miR408靶基因的表达水平；检测miR408表达量以U6为内参，检测靶基因以ACTIN为内参。

图3显示了miR408转基因材料在不同光强下的净光合速率与对应野生型的比较，其中a为转基因拟南芥在100和200μmol·m^-2·s^-1光强下的净光合速率与野生型的比较，b和c分别为转基因烟草和转基因水稻与相对应野生型的净光合作用曲线。

图4显示了miR408转基因烟草#2和#3的叶片在不同光强下的光学光谱特性与野生型的比较，包括ETR(a)，NPQ(b)，1-qP(c)和Donor-side limited PSI(d)。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到。

植物材料：拟南芥Col-0(Arabidopsis thaliana Col-0)，烟草K326(Nicotianatobaccum cv.K326)，水稻粳稻品种中花11号(Oryza sativa L.ssp.japonicacv.zhonghua 11)。

1、转MIR408基因的拟南芥、烟草和水稻的获得

(1)CTAB提取拟南芥和水稻基因组DNA

首先，将CTAB提取缓冲液置于65℃水浴中预热；称取约100～200mg的拟南芥和水稻叶片组织于预冷的1.5mL EP管中，加入钢珠，液氮冷冻后震动研碎样品；直接加入含200μL预热CTAB提取缓冲液的离心管中，颠倒混匀；将混匀的样品于65℃保温15min；加入等体积的氯仿，颠倒混匀；室温下12,000rpm离心10min，取上清于新管中；向上清中加入等体积的异丙醇沉淀DNA，颠倒混匀，室温下12,000rpm离心10min；弃上清液，加500μL 75％乙醇洗涤DNA，颠倒混匀后，室温下12,000rpm离心10min，弃上清液；室温待其风干后加入去离子水液溶解DNA。

(2)拟南芥和水稻MIR408基因片段的扩增

根据植物miRNA数据库(http://www.mirbase.org)(Griffiths-Jones et al.,2006，miRBase:microRNA sequences,targets and gene nomenclature.Nucleic AcidsResearch 34,D140-D144.)信息获得包含有茎环结构前体的拟南芥和水稻MIR408基因组序列(序列表中的SEQ ID No：1和No:2)，并根据该基因序列设计引物：

拟南芥上游引物：5’-TTTCTAGATCTTCTTCTTCGTCGATGGAT-3’，SEQ ID No：7；

拟南芥下游引物：5’-TTGAGCTCATTCTCCTGTGCTTACAATCCT-3’，SEQ ID No：8；

水稻上游引物：5’-TTTACTAGTGGGAGTTCTGTGATTGGAGA-3’，SEQ ID No：9；

水稻下游引物：5’-GGGTCTAGAACACAGAGAGAGAGAGAGAG-3’，SEQ ID No：10)。

随后采用Phusion高保真DNA聚合酶扩增拟南芥和水稻MIR408基因片段，反应体系如下：

上述PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；暂停于4℃。反应完毕后进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带的大小与特异性。

(3)拟南芥MIR408基因片段和pJIM19质粒酶切

利用限制性内切酶(NEB公司)双酶切体系切开拟南芥MIR408基因片段和pJIM19质粒相同粘性末端，酶切体系如下：

上述酶切反应体系于37℃温育1h。电泳检测酶切后的片段和质粒，使用胶回收试剂盒(TIANGEN公司)回收酶切后的片段和质粒。

(4)拟南芥MIR408基因片段和pJIM19质粒连接

使用T4连接酶(NEB公司)连接回收的拟南芥MIR408基因片段和pJIM19质粒，连接体系如下：

上述连接反应体系16℃温育过夜，连接产物命名为pJIM19-athmiR408。

(5)pJIM19-athmiR408的大肠杆菌感受态转化

从-80℃冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上待其融化，将上述全部连接产物加入感受态细胞，轻轻混匀后并上放置冰上10min；于42℃水浴锅中热激60s；立即置于冰上2min。向菌液中加入900μL无抗LB培养基，于37℃150rpm复苏60min。将复苏好的菌液均匀涂于含有Kana的LB平板，于37℃培养箱中培养12～18h。

(6)pJIM19-athmiR408质粒小量提取和鉴定

将转化平板长出的单克隆接种至5mL含Kana的LB培养基中培养过夜，室温10,000rpm离心1min沉淀菌体，弃去培养基；使用质粒小提试剂盒(TIANGEN公司)提取pJIM19-athmiR408质粒，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测质粒含量，使用MIR408基因片段的扩增上下游引物测序。

(7)拟南芥和烟草的基因转化

将质粒pJIM19-ath-miR408转入农杆菌GV3101，将col-0背景的拟南芥花器官浸泡法转染农杆菌溶液，获得转基因T0代植株，后代Basta抗性筛选获得T1代阳性植株标记为#2和#7两个miR408转基因拟南芥种系。并将该农杆菌转入烟草品种K326的胚性愈伤组织并获得抗性愈伤，继而诱导获得Basta抗性幼苗，标记为#2和#3两个miR408转基因烟草种系。

(8)水稻MIR408基因片段和pCactN质粒酶切

利用限制性内切酶(NEB公司)双酶切体系切开水稻MIR408基因片段和pCactN质粒相同粘性末端，酶切体系如下：

(9)水稻MIR408基因片段和pCactN质粒连接

使用T4连接酶(NEB公司)连接回收的水稻MIR408基因片段和pCactN质粒，连接体系如下：

上述连接反应体系16℃温育过夜，连接产物命名为pCactN-osamiR408。

(10)pCactN-osamiR408的大肠杆菌感受态转化

(11)pCactN-osamiR408质粒小量提取和鉴定

将转化平板长出的单克隆接种至5mL含Kana的LB培养基中培养过夜，室温10,000rpm离心1min沉淀菌体，弃去培养基；使用质粒小提试剂盒(TIANGEN公司)提取pCactN-osamiR408质粒，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测质粒含量，取约1μg测序，测序引物为通用引物M13F。

(12)水稻的基因转化

将上述以构建好的pCactN-osamiR408质粒转化至农杆菌EHA105中。将农杆菌菌液送至中国科学院遗传和发育生物学研究所委托进行水稻的基因转化。利用经组培诱导出的水稻粳稻品种中花11号的胚性愈伤组织，经农杆菌侵染法获得水稻抗性愈伤组织(选用50μg/mL G418筛选)。然后，将这些抗性水稻愈伤组织在抗性1/2MS培养基上诱导成苗。待抗性水稻幼苗长出3片叶时移栽至水桶中，常规田间管理。

2、miR408转基因拟南芥、烟草和水稻的miR408和miR408调控的靶基因的表达量检测

(1-1)总miRNA提取

使用miRcute miRNA提取分离试剂盒(TIANGEN公司)提取拟南芥、烟草和水稻叶片总miRNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计检测miRNA含量。

(1-2)总miRNA逆转录

使用miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒(TIANGEN公司)逆转录总miRNA，反应体系如下：

上述反应体系42℃反应60min进行miRNA加A尾和逆转录，95℃反应3min使酶失活。

(1-3)实时定量RT-qPCR(针对miRNA)

以上述反转的miRNA第一链cDNA为模板，使用miRNAcute miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(TIANGEN公司)进行ath-miR408，nta-miR408和osa-miR408和内参U6表达量检测。

Ath-miR408正向引物为：5’-ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC-3’，SEQ ID No：11；nta-miR408正向引物为：5’-ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC-3’，SEQ ID No：12；osa-miR408正向引物为：5’-CTGCACTGCCTCTTCCCTGGC-3’，SEQ ID No：13；反向引物均为试剂盒中通用引物。

内参ath-U6正向引物为：5’-CGATAAAATTGGAACGATACAGA-3’，SEQ ID No：14；反向引物为：5’-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT-3’，SEQ ID No：15。

内参nta-U6正向引物为：5’-CGATAAAATTGGAACGATACAGA-3’，SEQ ID No：16；反向引物为：5’-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT-3’，SEQ ID No：17。

内参osa-U6正向引物为：5’-CGATAAAATTGGAACGATACAGA-3’，SEQ ID No：18；反向引物为：5’-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT-3’，SEQ ID No：19。

反应体系如下：

上述PCR体系使用7500Fast Real Time PCR扩增仪(ABI公司)进行扩增，如下条件反应：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s；60℃，45s；40个循环；反应最后紧跟一个熔解曲线测定步骤。采用7500Fast Real Time PCR软件(ABI公司)分析实验结果。

(2-1)总RNA提取

使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取拟南芥、烟草和水稻叶片总RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计检测RNA含量。

(2-2)总mRNA逆转录

使用PrimeScript逆转录试剂盒(Takara公司)进行mRNA逆转录，反应体系如下：

上述反应体系42℃反应60min进行m逆转录,70℃反应15min使酶失活。

(2-3)实时定量RT-qPCR(针对miRNA)

以上述反转的mRNA第一链cDNA为模板，使用RealMaster Mix荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(TIANGEN公司)进行miR408靶基因(AT2G02850,AT2G44790，AT2G30210,AT5G05390，AT5G07130，AYMY01071502，AYMY01086385,AYMY01094130,AYMY01225905,AYMY01019538,AYMY01102859,AYMY01380079,Os08g0482700，Os02g0653200，Os02g0731400，Os02g0758800，Os01g0827300，Os03g0297900(正反向引物依次为SEQ IDNo：20-55))和内参ath-ACTIN，nta-ACTIN，osa-ACTIN(正反向引物依次为SEQ ID No：56-61)表达量检测，反应体系如下：

利用实时定量RT-PCR方法检测转基因拟南芥、烟草和水稻的miR408基因和miR408调控的靶基因的表达量结果如图2所示，在转基因拟南芥#2和#7，转基因烟草#2和#3，转基因水稻#5和#6种系中，miR408基因表达均高于对应的野生型，miRNA靶基因预测网站工具(pstarget)预测三个物种中miR408调控的靶基因Plantacyanin(AT2G02850),Uclacyanin2(AT2G44790),Laccase 3(AT2G30210),Laccase 12(AT5G05390),Laccase 13(AT5G07130)，AYMY01071502，AYMY01086385,AYMY01094130,AYMY01225905,AYMY01019538,AYMY01102859,AYMY01380079,Os08g0482700，Os02g0653200，Os02g0731400，Os02g0758800，Os01g0827300，Os03g0297900表达低于野生型，表明通过转基因技术成功地获得了在三个物种中高表达有功能的miR408的转化植株。

3、miR408转基因拟南芥、烟草和水稻光合参数测定

(1)转基因拟南芥、烟草和水稻叶片净光合速率测定

使用Li-6400光合仪(Li-Cor公司)测定转基因拟南芥、烟草和水稻(剑叶)和对于的野生型完全展开的叶片不同光强下的净光合速率。对于拟南芥，测定100和200μmol·m^-2·s^-1光强下的净光合速率；对于烟草，测定9个光强下的净光合速率，从2,000到50μmol·m^-2·s^-1；对于水稻，测定11个光强下的净光合速率，从1,800到50μmol·m^-2·s^-1。初始光强下等待20-30min达到最大净光合速率且数值稳定，后续测定同样在每个光强条件下净光合速率数值稳定后再依次测定下一个光强下的净光合速率。叶片温度设置按照植物生长条件，为22℃(拟南芥)、28℃(烟草)和30℃(水稻)，叶室CO₂浓度均设置为400μmol·mol^-1。烟草和水稻净光合速率曲线拟合公式使用非直角双曲线模型(Thornley et al.,1976,Mathematical models in plant physiology.Academic Press,London,86-110.)。

通过气体交换分析，对转miR408的拟南芥、烟草和水稻测定了不同光照条件下的净光合速率，即单位时间单位面积叶片二氧化碳的吸收量，实验结果如图3所示，可见miR408的转基因植物显著提高了植物的净光合速率，说明其碳固定能力增强。

(2)转基因烟草叶片光谱学测定

使用Imaging-Pam fluorometer(Walz公司)测定转基因烟草完全展开叶片叶绿素荧光数值，并使用Imaging-Pam软件(Walz公司)自动计算相应参数ETR,NPQ,and 1-qP。PSII最大光量子产率每30s测定一次，每次饱和脉冲光设定参数为800ms,2,700μmol quanta m^-2·s^-1，测定光强一次为0,54,129,231,366,531,931μmol·m^-2·s^-1。使用Dual-PAM-100(Walz公司)测定转基因烟草完全展开叶片PSI光谱参数并使用Dual-PAM-100软件计算数值，P700⁺最大光量子产率使用饱和脉冲远红光每20s测定一次，参数设定为800ms,10,000μmol quanta m^-2·s^-1，测定光强一次为54,127,209,325,606,to 918μmol·m^-2·s^-1。

通过光学光谱学分析，对nta-miR408转基因烟草完全展开的叶片在不同光强下的光受体II的电子传递速率(ETR)、叶绿素荧光的非光化学淬灭(NTQ)以及质体醌A(Q_A)还原程度1-qP和光受体I(PSI)氧化程度(Donor-side limited PSI)这4个参数进行测定和计算的结果如图4所示，可见miR408的转基因植物提高了ETR，并减少了NTQ，说明了转基因植物增强了PSII的光能利用率，降低了Q_A的还原程度并增加了PSI的氧化程度，表明光合电子传递的作用得到增强。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 调控植物光合作用的miR408及其应用

<130> WX2017-03-148

<150> CN 201710259353.7

<151> 2017-04-19

<160> 61

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 218

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

aaggttagat tggtattgca atgaaagaag acaaagcggt aatgagagag agacagggaa 60

caagcagagc atggattgag tttactaaaa cattaaacga ctctgttttg tctctaccca 120

tgcactgcct cttccctggc tccctctttt tttctctata tttctctctc tcctttcatt 180

tcacagcttt caatggaatt ttattgctac tgctaacg 218

<210> 2

<211> 91

<212> DNA

<213> Nicotiana tobaccum

<400> 2

gagaggatag acagggacga ggtagagcat gagatgtgca atttttgctt gcccattcta 60

tgcactgcct cttccctggc tctcctccct c 91

<210> 3

<211> 213

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

gggagttctg tgattggaga ggagaggaga cagggatgag gcagagcatg ggatggggct 60

atcaacagat gtagattatt ccttgcacaa gagatgatga tgagctgtga atgagttctg 120

agagatggct ggtgttgttg ttgctccctc ccctgcactg cctcttccct ggctcccctg 180

cacacctctc tctctctctc tctctctctg tgt 213

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

augcacugcc ucuucccugg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> Nicotiana tobaccum

<400> 5

augcacugcc ucuucccugg c 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> Oryza sativa

<400> 6

cugcacugcc ucuucccugg c 21

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tttctagatc ttcttcttcg tcgatggat 29

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgagctcat tctcctgtgc ttacaatcct 30

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttactagtg ggagttctgt gattggaga 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gggtctagaa cacagagaga gagagagag 29

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgcactgcc tcttccctgg c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgcactgcc tcttccctgg c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctgcactgcc tcttccctgg c 21

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgataaaatt ggaacgatac aga 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atttggacca tttctcgatt tat 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgataaaatt ggaacgatac aga 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atttggacca tttctcgatt tgt 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgataaaatt ggaacgatac aga 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atttggacca tttctcgatt tgt 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cacctaagat cgatcaatgg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgacacagcc atgagagtca 20

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtggatgtaa ttggtttaga g 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgaagagctt ctgacgtggc a 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tcaattcgtg atcacaccga 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gctctgttga tgacagtgat 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tcgccaaagt ccaacaccat 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aagagtgtcg ccgttgttga 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gcagaagttc actttcatga g 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

aggctgatgt tgtaccgagc t 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cctagtaagt aagatcatgt c 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

attagcgcca caatgcacag 20

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cacatatagt aagatcatgt c 21

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

agcaccacaa cacacaacac 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

acggagcagc aggagttatg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gtaataatag gcagactaag 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

atggagcagc cggagttatg 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

aacagctgaa ccccaccaat 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

gcaccatgag caaagtggtt 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

ccgataaaca actgaacaca 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ggcaaatgca gcatctgcga 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

tccagggaat tgtccattca 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tgcagcatct ggcaaaactc 20

<210> 43

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

ctagagtatc cccattgttt ac 22

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

tcttctgatc gggcccacct 20

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ccactcatct ctctcacaca ca 22

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tcggtgatgg gcctgctggt 20

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

aacgtcgcgg agaaataata gc 22

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gatcgaaaaa ccaccgtgcg 20

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

atcacgagga acccgacgat ca 22

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

cgtcgtattc gtgcagcttg 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tacacgacgc gacctttgta 20

<210> 52

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

cgccgaagtg caccatcat 19

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

cgttgtgtgt cttgcacagc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

aggagcgctt ctacgagttc 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

cccgttcacc gtgatgatct 20

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

ggtgtcatgg ttggtatggg tc 22

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

cctctgtgag tagaactggg tgc 23

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

atctgttgga aggtgctgag ag 22

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

ctggtattgc agatcgcatg ag 22

<210> 60

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

gtgctttccc tctatgct 18

<210> 61

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

ctcggcagag gtggtgaa 18

Claims

1.一种提高植物光合作用的方法，提高植物中miR408的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述miR408是拟南芥的ath-miR408，烟草的nta-miR408或水稻的osa-miR408。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，构建miR408编码基因的表达载体并转化植物，从而在植物中过表达miR408。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述miR408编码基因是序列表中SEQ ID No：1、2或3所示的DNA序列。

5.一种植物miRNA及其编码基因在植物育种中的应用，所述miRNA是miR408，所述植物育种是培育高光合作用的植物品种。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述miR408是拟南芥的ath-miR408，烟草的nta-miR408或水稻的osa-miR408。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，通过构建miR408编码基因的表达载体并转化植物，获得高光合作用的转基因植物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述miR408编码基因是序列表中SEQ ID No：1、2或3所示的DNA序列。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述表达载体是双元表达载体，通过农杆菌介导转化植物。

10.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物是拟南芥、烟草或水稻。