CN105969797A - 叶绿体自发荧光相关小分子rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术以及植物学领域，具体涉及一种植物光响应小分子RNA及其应用。本发明首次发现，miR408可作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光量、自发荧光的最大荧光值以及自发荧光在目标区域的平均辐射率。本发明为运用转基因等分子育种技术培育能够改变植株光合作用最大荧光值能力以及耐低铜生长环境及铜高效循环利用的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

Description

叶绿体自发荧光相关小分子RNA及其应用

技术领域

本发明属于生物技术以及植物学领域，具体涉及一种植物光响应小分子RNA及其应用。

背景技术

非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一类广泛存在于多种生物体中，不编码蛋白质的RNA分子。真核生物中存在多种非编码RNA，转运RNA(tRNAs)、siRNA、microRNA及长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNAs)等。它们直接以RNA分子的形式在植物体内发挥重要的调节功能，通过转录后调控或者转录抑制等方式调控靶基因的表达，从而影响细胞分化、个体发育、信号转导、生物及非生物抗性等。其中，miRNA以其在多种植物多个基因中的调控作用以及对miRNA自身调控中的作用成为目前小分子RNA的研究热点。MiRNA是一类内源性、长度在19-25个碱基的小分子非编码RNA，在基因转录后调控或转录抑制中发挥重要功能。MiRNA在细胞核内由RNA聚合酶II(pol II)转录，产生miRNA前体(pri-miRNA)，通过其自身包含的互补结构折叠形成具有颈环结构发卡型双链RNA，由DCL1酶两次切割并在HYL1、SE等精确切割辅助蛋白的作用下形成21nt的miRNA：miRNA*结构的双链小RNA，并在HASTY蛋白的协助下由核内运输到细胞质。在细胞质中AGO1蛋白结合形成基因沉默复合物RISC，其中一条单链保留在这一复合体中，指导靶mRNA的降解或转录抑制，另一条单链可能与21nt的双链小RNA的再次切割形成有关。目前植物miRNA的生物途径、克隆及功能分析已经在许多植物中展开，功能分析的关注点集中于植物生长发育及逆境胁迫两个方面。

植物miRNA一直是研究的热点，目前已经确定miRNA与植物的生长发育、植物生理、抗性等方面有着密切的联系。其中，调控植株生长发育是miRNA最关键的作用之一，主要包括调控植株的形态建成、开花、结果、衰老等关键的植物生长发育阶段。针对植株光响应相关基因、成花相关基因被miRNA所调控的研究已经很多，而AGO蛋白(miRNA途径中的关键中心蛋白)的缺失突变体研究也发现其可以影响到植株的光响应导致畸形花的发生。对花发育过程中的关键基因的研究也显示miR172可以通过控制AP2基因的表达影响植株开花早晚，同时也可以造成花发育畸形。也用研究表明过表达miR159能够延长开花等。这一系列的研究都证实miRNA与植物生长发育及开花相关，miRNA参与光响应途径。而到目前为止还没有miR408与参与光合途径的相关报道。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种植物光响应小分子RNA及其应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供miR408作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光量的用途。

所述调控包括正向调控和负向调控。

进一步地，miR408作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光量包括两方面的内容：其一，将miR408作为作用对象，降低miR408表达从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控；将miR408作为作用对象，提高miR408表达从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控。

进一步地，所述自发荧光量为叶绿素自发荧光量或叶绿体自发荧光量。

本发明还提供，miR408作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光的最大荧光值。

本发明还提供，miR408作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光在目标区域的平均辐射率。

本发明的第二方面，提供miR408作为作用靶点用于筛选调控植物光合作用过程中自发荧光量的物质的用途。

所述调控包括正向调控和负向调控。

进一步地，miR408作为作用靶点用于筛选调控植物光合作用过程中自发荧光量的物质包括两方面的内容：其一，将miR408作为物质针对植物光合作用过程中自发荧光量的作用靶标应用于植物光合作用过程中自发荧光量抑制剂的筛选；将miR408作为物质针对植物光合作用过程中自发荧光量的作用靶标应用于植物光合作用过程中自发荧光量促进剂的筛选。

所述将miR408作为物质针对植物光合作用过程中自发荧光量的作用靶标应用于植物光合作用过程中自发荧光量抑制剂的筛选具体是指，将miR408作为作用对象，对物质进行筛选，以找到可以降低miR408表达从而发挥对植物光合作用过程中自发荧光量的负向调控的物质作为植物光合作用过程中自发荧光量抑制剂。

所述将miR408作为物质针对植物光合作用过程中自发荧光量的作用靶标应用于植物光合作用过程中自发荧光量促进剂的筛选具体是指，将miR408作为作用对象，对物质进行筛选，以找到可以提高miR408表达从而发挥对植物光合作用过程中自发荧光量的正向调控的物质作为植物光合作用过程中自发荧光量促进剂。

进一步地，所述自发荧光量为叶绿素自发荧光量或叶绿体自发荧光量。

本发明还提供，miR408作为作用靶点用于筛选调控植物光合作用过程中自发荧光的最大荧光值的物质。

本发明还提供，miR408作为作用靶点用于筛选调控植物光合作用过程中自发荧光在目标区域的平均辐射率的物质。

本发明的第三方面，提供miR408在制备植物光合作用过程中自发荧光量促进剂中的用途。

所述促进剂还能提高植物光合作用过程中自发荧光的最大荧光值。

所述促进剂还能提高植物光合作用过程中自发荧光在目标区域的平均辐射率。

本发明的第四方面，提供一种用于调控植物光合作用过程中自发荧光量的方法，该方法包括：调控植物中miR408的表达或活性。

所述调控包括正向调控和负向调控。

所述方法包括两方面的内容：其一，提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控；其二，降低miR408表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控。

在本发明一优选例中，提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控，包括：将miR408基因转入到植物基因组中，提高植物中miR408的表达或活性。

进一步地，提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控，包括：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有miR408的DNA序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该miR408的DNA序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上。

进一步地，提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控，还包括：

(3)选择出转入所述miR408的DNA序列的植物细胞、组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。

提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控，还能提高植物光合作用过程中自发荧光的最大荧光值。

提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控，还能提高植物光合作用过程中自发荧光在目标区域的平均辐射率。

本发明的另一优选例中，降低miR408表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控，包括：将植物基因组中的miR408基因进行突变，降低植物中miR408表达或活性。

降低miR408表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控，还能降低植物光合作用过程中自发荧光的最大荧光值。

降低miR408表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控，还能降低植物光合作用过程中自发荧光在目标区域的平均辐射率。

本发明的第五方面，提供一种由前述方法制备获得的转基因植物。

一方面，提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控所获得的转基因植物能够提高植物光合作用过程中自发荧光产量、自发荧光的最大荧光值或自发荧光在目标区域的平均辐射率。所述转基因植物能够提高植物耐低铜生长环境及铜高效循环利用能力。

另一方面，降低miR408表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控所获得的转基因植物能够降低植物光合作用过程中自发荧光产量、自发荧光的最大荧光值或自发荧光在目标区域的平均辐射率。所述转基因植物能够降低植物耐低铜生长环境及铜高效循环利用能力。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次发现，miR408可作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光量、自发荧光的最大荧光值以及自发荧光在目标区域的平均辐射率。本发明为运用转基因等分子育种技术培育能够改变植株光合作用最大荧光值能力以及耐低铜生长环境及铜高效循环利用的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

附图说明

图1：miR408突变体插入突变位置及转基因过表达载体构建示意图。

图2：miR408过表达转基因植株、突变体植株中miR408表达分析。

图3：拟南芥生长发育各个时期miR408表达量分析。

图4：拟南芥miR408过表达植株及突变体植株表型。

图5：miR408过表达植株及突变体叶片长度、宽度与野生型植株对比。

图6：两种栽培模式下(MS培养基及土栽)转基因植株荧光分析。

图7：miR408表达对植株光合作用中光适应后最大荧光值(Fm)比较分析。

图8：miR408过表达植株及突变体植株在不同铜浓度下的自发荧光表型分析。

图9：miR408过表达植株及突变体植株目标区域(ROI)平均辐射率。

具体实施方式

本申请的发明人经过长期的研究，首次从研究中发现了拟南芥中miR408与植物最大荧光直接的关系，提高miR408表达能够提高植株最大荧光值，这可能是miR408过表达植株生长量增大的原因之一。从拟南芥中克隆miR408后对其功能进行了具体分析，发现过表达miR408能够增大植株生长量，转基因植株荧光辐射率明显高于野生型植株，单位面积荧光发光强度明显大于野生型植株，且miR408突变体植株表型相反。研究结果表明，miR408过表达植株生长量增大可能与植株光合过程中Fm的增大有关，miR408通过控制植株光合作用最大荧光值调控植株生长。在此基础上完成了本发明。

本发明利用模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)展开研究。拟南芥又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草，十字花科植株，被子植物门，双子叶植物纲。基因组大约为12500万碱基对和5对染色体。

鉴于本发明的教导，本领域技术人员应该明白，本专利所述植物是其中包含小分子miR408的表达或者其表达活性受到抑制或增强的植物。本领域技术人员还应明白，除了模式植物拟南芥外本文所述的植物还有包括双子叶植物、单子叶植物等。主要包括：番茄、烟草、辣椒、马铃薯、葡萄、葡萄柚、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、甘蔗、水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、高梁、甜菜、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、咖啡、茄子、茶、蚝麻草、香蕉、橡胶和观赏植物等。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物，禾本科的水稻，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科芸薹属(拟南芥)的植物。

如本文中所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然物质，原始环境即天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的植物小分子RNA”、“分离的提高植物光合能力的miRNA”、或“分离的miR408”是指拟南芥小分子RNA中ath-miR408，拟南芥中小分子RNA中408家族不含有同源小分子RNA，即miR408家族在拟南芥中只有一个成员。本领域的技术人员能用标准的小分子RNA扩增手段在拟南芥中或者其他植物中克隆到miR408基因。成熟miR408在15％聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“高(强)光环境”或“光氧化胁迫环境”是指一种环境，其中光的强度大于常规环境。例如光强度高于1000μmol m^-2s^-1；更佳地高于3000μmol m^-2s^-1。

如本文所用，所述的“低铜环境”、“铜饥饿”是指一种环境，其中铜的含量低于5μM或铜含量为0；所述的“高铜环境”是指一种环境，其中铜的含量高于10μM。

如本文所用，所述“启动子”或“启动子区域”是指一段核酸序列，其位置通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般情况下，启动子或启动子区提供RNA聚合酶结合位点和正确起始转录所必需的其它转录因子的识别位点。本文中，所述的启动子或启动子区包括组成型启动子，该启动子为35S启动子，其在正常状态下表达，不存在时空特性，也不存在组织特性等；还包括衰老和维管组织特异性表达启动子(BFN启动子)，其在植物衰老过程中启动其链接基因的表达，以及特异性的在植物维管组织中表达(如：叶脉等)，在其他组织或者生长发育时期没有表达。

如本文所用，所述的“连接”、“插入”是指两个或多个核酸区域的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置(上游)，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“连接、插入”到该核酸序列上。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含miR408DNA序列和合适的转录、前体颈环结果形成控制的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导miRNA前体合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明的拟南芥光合相关小分子RNA的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并按本领域技术人员已知的颈环引物法特异性反转录获得miR408特异性片段，PCR扩增而得有关序列。当序列较短时，常常多次PCR扩增确定序列核苷酸组成。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

如本文所用，突变体植株是指通过T-DNA插入技术获得的插入突变植株，T-DNA插入的核算序列丧失本来的基因功能。miR408突变体插入突变位置及转基因过表达载体构建示意图如图1所示。突变体经过纯合化后获得该基因的不表达突变体株系。拟南芥突变体植株购买自拟南芥ABRC库(http://www.arabidopsis.org)，后经实验室PCR验证法获得纯合的T3代株系。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。非编码RNA可以是长链非编码RNA和小RNA。如本文所用，“miR408”、“miR408前体”分别是指21bp的miR408成熟小分子RNA序列和形成21bp的miR408成熟小分子RNA的必须具备的全部最短转录本序列，即能够形成miRNA颈环结构的mRNA序列。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

作为本发明的一种优选方式，获得miR408高表达的植株的方法如下：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有miR408的DNA序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该miR408的DNA序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述miR408的DNA序列的植株；

(4)将步骤(3)中的植株自交获得T2代自交系纯合体株系。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

本发明的启动子有两种，一种是组成型表达的，一种是诱导目的基因在特点组织中或特点生长阶段(微管组织、衰老期)下表达的。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(优选结构性核酸序列)，所述的目的基因优选非编码RNA。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加表达量，改变对应靶基因的表达量等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的miRNA序列的STTM来实现，该序列以靶基因模仿的方式引起目标基因沉默。本领域的普通技术人员熟悉这种STTM技术。任何miRNA序列可以以这种方式被调节。

任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在构建物中，更具体地如重组载体中。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够在适当的环境下表达miRNA。

在本发明的一个实施方式中，找到了一种来源于拟南芥的miRNA，称为ath-miR408。ath-miR408表达强烈地被低铜生长环境所诱导，在低铜生长环境下ath-miR408具有促进植物体内铜循环再利用的功能。

ath-miR408是一个低铜生长环境响应的、参与铜代谢关键小分子RNA。ath-miR408可改变植株大小，通过控制植物最大荧光值(Fm值)影响植物光系统II的光合效率。

ath-miR408受低铜营养生长环境诱导。在低铜和正常MS培养基上分别种植miR408过表达及野生型株系，分析表明在低铜MS培养基中过表达miR408植株生长有差异，但最大荧光值基本相同；而在缺铜MS培养基中过表达miR408株系明显生长旺盛，最大荧光值明显高于野生型植株。利用Handy Pea便携式荧光仪测定植株光合效率也证实，miR408过表达株系最大荧光值明显大于野生型植株。

本发明人筛选得到ath-miR408两个个Null突变体命名为408-m4(SALK_038860)，408-m5(SALK_121013)。利用这两个材料本发明人分析408-m4，408-m5与低铜营养环境相关的表型。在正常的培养条件下408-m4，408-m5突变体与野生型相比植株生长量小。在缺铜MS培养基中培养408-m4，408-m5突变体株系，分析表明突变体最大荧光值明显低于野生型植株。利用Handy Pea便携式荧光仪测定植株光合效率也证实，miR408突变体株系最大荧光值明显小于野生型植株。这表明铜饥饿环境对miR408突变体株系的影响比野生型更大，同时也显示ath-miR408对植物适应铜胁迫环境逆境具有重要的功能。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明为运用转基因等分子育种技术培育能够改变植株光合作用最大荧光值能力的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

(2)本发明为运用转基因等分子育种技术培育耐低铜生长环境及铜高效循环利用的农作物新品种，提供非常有价值的基因资源。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

I.材料与方法

通用材料

实验材料为模式植物Col生态型拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型植株和突变体植株(购买自ABRC库，PCR法获得纯合株系)。反转录试剂盒RNA PCR Kit(MMV)购自大连TaKaRa公司，聚合酶2 PCR Kit购自Clontech公司，Ex Taq HS购自大连TaKaRa公司。UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。10 EcoR I酶购自大连TaKaRa公司。dNTP Mixture，X-gal，IPTG，DNA Marker DL2000购自大连TaKaRa公司；其他试剂除特别说明外，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

通用方法

1.拟南芥miR408前体的PCR扩增

根据拟南芥基因组网站提供的基因组数据(http://www.arabidopsis.org/index.jsp)，利用Primer5软件设计miR408前体的全长PCR扩增引物，以反转录的第一条链cDNA为模板进行PCR扩增。获得miR408前体，然后，利用所获得的miR408前体合成成熟miR408。

所用引物如下：

miR408-F:GGCCAATTTCAAAGGTTAGATTG(SEQ ID NO.1)

miR408-R:CCATTGAGGATATGATGCAGGGAG(SEQ ID NO.2)

所获得的能够合成成熟miR408的miR408前体序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：

GGCCAATTTCAAAGGTTAGATTGGTATTGCAATGAAAGAAGACAAAGCGGTAATGAGAGAGAGACAGGGAACAAGCAGAGCATGGATTGAGTTTACTAAAACATTAAACGACTCTGTTTTGTCTCTACCCATGCACTGCCTCTTCCCTGGCTCCCTCTTTTTTTCTCTATATTTCTCTCTCTCCTTTCATTTCACAGCTTTCAATGGAATTTTATTGCTACTGCTAACGTTTGTGACAGCTGACGACAAGCTTAAGGGTTTTTGGGTTTGGTCTACCTCTCTGTCATTCATGAAGTGGAGCTGAAAGAAGCAATGGCGTCCATTTCTTGGCGCAAGAGAAGGGCATCAATGAACATGTCCAGATTCTCTCCCTGCATCATATCCTCAATGG。

成熟miR408核苷酸序列信息如下：

ath-miR408-5p：ACAGGGAACAAGCAGAGCATG(miRNA*)(SEQ ID NO.4)

ath-miR408-3p：ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC(miRNA)(SEQ ID NO.5)

2.植物表达载体的构建

用XhoI和XbaI双酶切测序正确的阳性克隆质粒和表达载体pFGC-5941，经过1％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化miR408前体序列和pFGC-5941空载体片段。用T4DNA连接酶连接两个片段构建pFGC-5941-35s-miR408重组质粒，转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含IPTG、卡那霉素和X-gal的LB固体培养基上培养、筛选，挑取白色菌落进行摇菌。对获得的重组质粒双酶切鉴定实验，然后将pFGC-5941-35s-miR408重组质粒经冻融法转化农杆菌感受态细胞。

同样方法将miR408前体序列构建到包含BFN启动子的pFGC-5941载体中，获得pFGC-5941-BFN-miR408。

加入酶切位点的PCR扩增引物如下：

上游序列：GGACTCGAGGCCAATTTCAAAGGTTAGATTG(SEQ ID NO.6)

下游序列：CACGGATCCATTGAGGATATGATGCAGGGAG(SEQ ID NO.7)

3.浸花法转化拟南芥及筛选

挑取转入pFGC-5941-35s-miR408、pFGC-5941-BFN-miR408质粒的农杆菌单菌落，转接于30mL YEB(50mg/L10利福平，50mg/L卡那霉素)液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD₆₀₀ 0.5～0.8。

转基因步骤：

a)当拟南芥抽苔后茎高约5厘米时进行转化，若待转化的植株结实率低则要在植株打顶4天后进行。

b)转化前，将已授粉的花和角果去除掉。并使土壤吸水过夜。

c)将已培养过夜的农杆菌1∶100稀释于大瓶培养基中，28℃培养24小时后，4℃5000rpm离心20分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于原菌液的两倍体积的转化缓冲液中，使OD₆₀₀在0.8左右。

d)拟南芥的除莲座叶外的地上部分完全浸入菌液中1min，取出平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日移入人工气候室正常竖直培养。

e)种子经4℃春化两天后播种到组培室，除草剂筛选抗性苗移。

f)抗性苗取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗，再经两代筛选得到转基因的T2代纯系，用于进一步分析。

实施例1：Real-time PCR鉴定miR408时空表达及转基因植株表达量分析

植物体基因表达具有时空特异性，即在不同的时间、空间条件下，有不同的功能基因表达。首先对拟南芥发育不同时期中miR408的表达量进行了分析，发现miR408在植物生长过程中都有表达，衰老前期、后期呈现表达量不断上升的趋势，见图3。

拟南芥转基因获得多个T2代株系，从ABRC购买的多个突变体株系，经PCR法纯合化后获得2个突变体株系。引物如下：

在基因T-DNA插入区域前后设计一对引物：

408-m4-LP:CGAGAACTTGGGATCTTGATG(SEQ ID NO.8)

408-m5-LP:GGCTTGTCCAGTAGGCTTTTC(SEQ ID NO.9)

408-m4，5-RP:CATTGCTTCTTTCAGCTCCAC(SEQ ID NO.10)

T-DNA引物为：LBb1.3：ATTTTGCCGATTTCGGAAC(SEQ ID NO.11)

通过PCR产物大小及测序来鉴定T-DNA的插入。

Real-time PCR对过表达植株和突变体植株中miR408的表达量进行分析，结果显示过表达株系miR408表达量分别增长约50倍、85倍，而突变体中miR408表达量急剧下降，几乎没有表达，见图2。方法及引物：

提取植物小分子RNA，定量并分析纯度；取相同的植物小分子RNA，反转录生成cDNA，用作模板用于PCR；以UBC基因为作为内参基因，进行目标基因的PCR反应；PCR产物进行电泳初分析。

miR408反转录引物:

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCCAGGGA(SEQ ID NO.12)

miR408real-time PCR引物：F：GGATGCACTGCCTCT(SEQ ID NO.13)

R:GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO.14)

内参基因反转录引物为UBC-R，real-time PCR引物如下：

UBC-F:GCGACTCAGGGAATCTTCTAAG(SEQ ID NO.15)

UBC-R:CATCCTTTCTTAGGCATAGCG(SEQ ID NO.16)。

实施例2：过表达miR408植株及突变体植株的光合特性

miR408过表达植株的表型与野生型相比有明显差别，过表达植株生长旺盛，植株体积明显大于野生型植株。过表达植株叶片长度、宽度都明显大于野生型植株。miR408突变体植株则明显表现出相反的表型特性，叶片长度、宽度都明显小于野生型植株，见图4,5。

在营养土中栽培miR408过表达及突变体植株，15天幼苗在IVSII系统(The IVIS LuminaII imaging system，PerkinElmer Inc.,USA)中观察植株自发荧光(激发光430nm，接受波长560-580nm)。结果显示，miR408过表达株系叶绿素自发荧光量明显高于野生型植株(图6，左)，而突变体植株则显示出完全相反的结果，叶绿素自发荧光量明显小于野生型植株也小于过表达植株(图6，左)。

在MS培养基中栽培miR408过表达及突变体植株，选择在包含3％蔗糖的MS培养基的同一个培养皿中同时种植35s启动子过表达miR408、BFN启动子过表达miR408、野生型植株、miR408突变体植株(每个株系40株)。结果显示，与营养土中的结果类似，过表达植株的叶绿体自发荧光量明显高于野生型和突变体植株(图6，右)。

此结果表明，无论在土壤栽培(光合作用提供糖源)还是MS培养基栽培(添加3％蔗糖)，miR408都能够调控植株的光合自发荧光量，调控植株大小。

实施例3：低铜营养环境下过表达、突变体植株叶绿素自发荧光量对比

含铜MS培养基配方

盐分及用量与文献Murashige，T.and Skoog，F.(1962)A revised medium for rapid growthand bioassays with tobacco tissue culture.Physiol Plant.15,473-497中描述的配方相同，另外加入7g/L琼脂、3％蔗糖。

无铜MS培养基

无CuSO₄成分，其它与含磷MS培养基相同。

结果

为了解miR408在低铜生长环境中的生理功能，本发明人分析miR408过表达株系和突变体株系在幼苗期的表型，在正常的培养条件下(Cu,0.5μg)miR408过表达株系、突变体株系与野生型相比，叶绿素自发荧光量略有提高(图8)。

然而在缺铜的生长环境下(Cu,0μg)，miR408过表达株系和野生型或者突变体株系相比，叶绿素自发荧光量明显提高(图8)。

这表明低铜生长环境逆境对miR408的影响比野生型更大，同时也提示miR408基因对植物适应低铜环境逆境具有重要的功能。这与前人报道的miR408在低铜条件下诱导表达结果相一致。

实施例4：miR408表达对植株光合作用中光适应后的最大荧光值(Fm)的影响

为确定miR408表达可以影响植株自发荧光量，申请人通过Handy Pea便携式荧光测定仪测定过表达株系、突变体株系和野生型的暗适应后的最大荧光值。

基本操作步骤：

选择生长一致的15天土栽拟南芥幼苗(约6片叶)每个株系各10株，逐个测定叶片最大荧光值。首先，选择拟南芥植株第6片叶作为测定对象，暗适应20分钟，打开Handy Pea便携式荧光测定仪光源，给予3000μmol m^-2s^-1的高光照强度，设定仪器为没0.1秒收集叶片荧光，收集时间为30秒。结果显示过表达植株在30秒的测定时间内叶片最大荧光始终大于野生型植株，突变体植株荧光值最小(图7)。

为进一步证明miR408与植株最大自发荧光相关，结合上一个实验实例中的结果-miR408在铜饥饿条件下诱导表达。这里申请人在缺铜条件下种植miR408突变体植株和野生型植株，结果显示野生型植株叶绿素自发荧光在30秒内始终高于miR408突变体植株，即说明在铜缺乏情况下诱导了miR408的表达，miR408的表达引起植株自发荧光量的增大(图7)。

实施例5：miR408过表达植株及突变体植株平均辐射率

为了鉴定光合相关小分子RNA(miR408)功能，本发明人构建了35S启动及BFN启动的过表达植物载体35S-miR408和BFN-miR408，并转化到拟南芥。检测拟南芥T2代植株的基因表达以及叶绿体自发荧光增强。本实验案例希望测定转基因株系、突变体株系及野生型植株的叶绿体自发荧光量。通过在3％蔗糖的MS培养基中种植35s、BFN启动子过表达、突变体和野生型株系，15天正常生长的植株进行叶绿体自发荧光发光量测定。利用IVSII荧光成像系统检测各个株系的荧光量，目标区域(region of interest，ROI)的平均辐射率35s-miR408过表达植株为4.967e+04p/sec/cm²/sr/μW/cm²(Fluorescence emission radiance per incidentexcitation intensity,单位ROI中荧光辐射率)，BFN-miR408过表达植株为5.429e+04p/sec/cm²/sr/μW/cm²，野生型为4.495e+04p/sec/cm²/sr/μW/cm²，突变体最低为3.909e+04p/sec/cm²/sr/μW/cm²(图9)。

综上，拟南芥miR408是一个铜胁迫响应的植物內源小分子RNA，它能够有效的提高植物叶绿体自发荧光量，可用于改进苗期植物的生长能力，可能通过改变植物光合作用机制提高植株产量。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (13)

1.一种miR408作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光量的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述调控包括正向调控和负向调控。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，miR408作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光量包括两方面的内容：其一，将miR408作为作用对象，降低miR408表达从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控；将miR408作为作用对象，提高miR408表达从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述自发荧光量为叶绿素自发荧光量或叶绿体自发荧光量。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，miR408还可作为作用靶点用于调控植物光合作用过程中自发荧光的最大荧光值或自发荧光在目标区域的平均辐射率。

6.miR408作为作用靶点用于筛选调控植物光合作用过程中自发荧光量的物质的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，miR408还可作为作用靶点用于筛选调控植物光合作用过程中自发荧光的最大荧光值的物质或用于筛选调控植物光合作用过程中自发荧光在目标区域的平均辐射率的物质。

8.miR408在制备植物光合作用过程中自发荧光量促进剂中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述促进剂还能提高植物光合作用过程中自发荧光的最大荧光值或提高植物光合作用过程中自发荧光在目标区域的平均辐射率。

10.一种用于调控植物光合作用过程中自发荧光量的方法，该方法包括两方面的内容：其一，提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控；其二，降低miR408表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，提高miR408的表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行正向调控，包括：将miR408基因转入到植物基因组中，提高植物中miR408的表达或活性。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，降低miR408表达或活性，从而对植物光合作用过程中自发荧光量进行负向调控，包括：将植物基因组中的miR408基因进行突变，降低植物中miR408表达或活性。

13.一种由如权利要求10～12任一权利要求所述方法制备获得的转基因植物。