CN113416238A

CN113416238A - ZmbHLH148蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN113416238A
Application number: CN202010143364.0A
Authority: CN
Inventors: 陈丽梅; 武维华; 王瑞芳; 李希东; 郝杰; 王喜庆
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2020-03-04
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2040-03-04
Also published as: CN113416238B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及ZmbHLH148蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明发现，ZmbHLH148基因过表达后，干旱处理条件下转基因植株生长明显好于野生型，且干旱条件下转基因植株叶片相对含水量显著高于对照，正常生长条件下的转基因株系离体叶片失水速率明显低于对照，说明该基因过表达后能够显著提高植物抗旱性。本发明为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明ZmbHLH148在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

Description

ZmbHLH148蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及ZmbHLH148蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。

背景技术

干旱影响植物正常生长发育，严重的干旱是导致作物产量下降的最重要的非生物逆境之一。植物本身会采取关闭气孔来减少体内水分的直接消耗，而另一方面植物体内基因发生变化以及渗透活性物质发生变化来响应干旱，但大多数作物对于干旱较敏感，因此培育抗旱新品种是应对干旱胁迫的有效途径之一。

传统的育种方法耗时周期长，存在不可预测的结果，转基因技术的迅速发展为提高作物产量、抗逆性以及抗病性方面提供了重要的途径。利用转基因技术及转基因植物材料，从植物生理生化和分子水平上研究基因的功能，为提高干旱情况下作物的产量，创制新材料和分子育种提供理论支持具有巨大的现实意义。通过培育新品种，提高作物在干旱条件下的产量，是改善作物抗逆性的主要途径，对解决作物因干旱减产造成的影响具有重要的现实意义。

bHLH家族转录因子作为真核生物中一类重要的转录因子，在生物的生长发育以及非生物胁迫中发挥着重要的作用，其调节种子在萌发过程中的光形态建成、细胞伸长、气孔运动等生长发育过程。bHLH家族转录因子PIL5是确定的第一个与植物色素相互作用的蛋白，又是Phy介导的促进种子萌发并抑制下胚轴伸长的负调节因子，其与种子萌发有着极大的关系。

bHLH转录因子除在调控植物种子萌发中发挥作用外，在应对非生物逆境胁迫中也发挥着重要的作用。根据文献报道，同属于bHLH家族的ZmPIF1可以显著被干旱和ABA处理诱导，转ZmPIF1的水稻株系可以减少气孔开放、降低蒸腾速率而进一步提高植物的抗旱性。但是本发明中的ZmbHLH148基因的氨基酸序列与ZmPIF1的氨基酸序列除保守区域外同源性为16.32％，不具有较高的同源性(见图6)。另外，玉米ZmPIFs家族在调节玉米光信号和光形态发生中也有着保守分子特性和独特分子特性。现有研究结果表明，ZmPIF家族对红光有响应，并且通过CRISPR/Cas9技术生成的Zmpif3，Zmpif4和Zmpif5敲除突变体均显示严重抑制了植物幼苗的中胚轴伸长。而本发明发现，ZmbHLH148基因过量表达会使玉米中胚轴变短，这一结果与ZmPIF家族正好相反。

除此之外，有研究通过全基因组关联分析鉴定了玉米中的208个bHLH家族蛋白，其中一些已被报导。例如，玉米BA1(ZmbHLH85)参与芽构型的调控，MS23(ZmbHLH164)和MS32(ZmbHLH62)参与调控植物再生长，而MS23是最早研究出控制绒毡层分化的作用因子。所有这些证据表明，这些不同的bHLH家族蛋白在各种生物学过程中起着各自不同的重要作用。

在干旱来临时，玉米会受到不同程度的伤害，严重时甚至颗粒无收，因此研究玉米的生长发育以及玉米对干旱的抗性有着重要的意义。利用基因工程技术获得在遗传上具有抗旱能力的品种，进而提高玉米在不同生育阶段的抗旱性成为现代遗传育种的一种方式。

目前植物中已有一些bHLH家族蛋白在逆境功能研究的相关报道，但大多集中于拟南芥和水稻的研究中，玉米的相关报导较少，其作用机制也不甚清楚。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决上述技术问题，本发明提供了ZmbHLH148蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用，该蛋白及其编码基因对植物(尤其是玉米)种子萌发和抗旱性具有显著影响。

(二)技术方案

本发明提供了ZmbHLH148蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物抗旱性和/或调控植物种子萌发中的应用。

本发明提供了ZmbHLH148蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育抗旱性提高的转基因植物中的应用。

本发明提供了ZmbHLH148蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐旱种质资源改良中的应用。

本发明提供了ZmbHLH148蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高干旱环境下植物存活率中的应用。

由于ZmbHLH148基因过表达后会引起种子萌发期中胚轴长度变短，在种子萌发上发挥重要作用。因此，后续可以利用CRISPR/Cas9技术将该基因进行编辑，从而在有利于种子萌发或不影响种子萌发的前提下，提高其抗旱能力。

作为优选，所述ZmbHLH148蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。

作为优选，ZmbHLH148蛋白的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

玉米ZmbHLH148基因Genomic DNA由1876个碱基组成，共5个转录本。该基因有6个外显子，5个内含子。基因来源于B73自交系，在玉米基因组数据库中的编号为GRMZM2G080054。由于玉米同一段DNA序列可产生不同转录本，翻译出不同蛋白质，该段序列产生的不同转录本以及翻译出的不同蛋白质均在本专利保护范围内。

在一些实施方式中，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

作为优选，本发明中所述的植物为双子叶植物或单子叶植物；优选水稻、小麦、大豆、高粱、小米、棉花、大麦或玉米。

本发明进一步提供构建抗旱的转基因玉米的方法，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米表达或过表达ZmbHLH148基因。

在一些实施方式中，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导或基因编辑技术的方法将包含ZmbHLH148基因的重组表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。所述的基因编辑技术可以为CRISPR-Cas9等。

(三)有益效果

本发明发现，ZmbHLH148基因过表达后，干旱处理条件下转基因植株生长明显好于野生型，且干旱条件下转基因植株叶片相对含水量显著高于对照，正常生长条件下的转基因株系离体叶片失水速率明显低于对照，说明该基因过表达能够显著提高植物抗旱性。本发明实例中采用转基因过表达技术获得了抗旱的植株，与传统育种方式相比时间短，目的性强，为培育和改良抗旱植物新品种提供了基因资源，为阐明ZmbHLH148在植物干旱逆境信号应答中的分子机制提供了理论依据。

附图说明

图1为ZmbHLH148转基因株系表达量；

图2为ZmbHLH148转基因株系在蛭石中萌发3天和4天的表型，其中，左图为萌发第3天在蛭石中的生长情况，中图由上至下分别为第3天和第4天的株系照片，右图为胚芽长度统计结果；

图3为ZmbHLH148转基因株系在PEG6000中萌发表型，其中，A图为在H₂O和20％PEG6000处理条件下种子的萌发情况，B图为在H₂O处理条件下的根长统计数据，C图为在20％PEG6000处理条件下的根长统计数据；

图4为ZmbHLH148转基因株系的干旱表型，其中，左图为正常浇水情况，右图为干旱处理的情况；

图5为ZmbHLH148转基因株系叶片的相对含水量及离体叶片失水率，其中，左图为株系叶片的相对含水量统计结果，右图为离体叶片的失水曲线统计结果；

图6为ZmbHLH148和ZmPIF1的氨基酸序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实例所使用的为LH244生态型；农杆菌菌株为EHA105；作为PCR模板的B73的cDNA以及由玉米UBI启动子驱动的过表达载体pBCXUN与文章“Maize ZmRPH1 encodes amicrotubule-associated protein that controls plant and ear height”所述一致。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1 ZmbHLH148基因载体的构建和检测

在利用H₂O以及20％PEG6000筛选不同基因的过量表达材料在萌发期的表型时，偶然发现ZmbHLH148过表达载体后代的不同株系均表现出在PEG6000处理条件下种子根长于对照LH244的种子根长(如图3，其中，A图为在H₂O和20％PEG6000处理条件下种子的萌发情况，B图为在H₂O处理条件下的根长统计数据，C图为在20％PEG6000处理条件下的根长统计数据)，经查询得到该载体利用转基因技术从玉米基因组中定向过量表达ZmbHLH148基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。其载体构建为如下：

从B73玉米(Zea mays L.)提取总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，引物如下。利用上下游引物和高保真酶扩增出目的基因ZmbHLH148，使用1％的琼脂糖凝胶及凝胶回收的方法纯化PCR产物，将纯化后的片段通过TA克隆的方法与采用XcmI酶切后的启动子为Ubiquitin的pBCXUN载体连接，通过转化大肠杆菌并筛选阳性克隆，即一步法完成克隆构建。将构建的质粒进行测序，比对分析测序结果和目的序列，确保载体中含有完整的目的基因序列。

F引物：TATGGAAGATGGCAGTGCTCC(SEQ ID NO.3)

R引物：TCACTCCATGAAGTTATACGAGGAACT(SEQ ID NO.4)

实施例2转基因植株的构建和鉴定

将构建完成含有目的基因的pBCXUN载体转化到农杆菌EHA105菌株中，在无菌条件下转入到受体材料LH244幼胚中，经过脱分化形成愈伤组织，再分化形成组织器官的组织培养得到转基因的玉米幼苗。此幼苗标记为T0代。

将转基因材料T0移栽于中国农业大学西校区温室里，于玉米V3期鉴定转基因株系中筛选标记bar基因的拷贝数，收获拷贝数较低的转基因株系的T1种子，将T1种子种植在中国农业大学涿州试验站，待幼苗到V3期鉴定bar基因纯合单株，收获纯合自交的T2种子。

为了检测T2代转基因株系中ZmbHLH148基因的表达效率，分别提取了受体材料LH244和三个转基因株系OE1、OE4、OE6苗期叶片的总RNA，并逆转录成相应的cDNA，进行荧光定量实验，检测其表达量(图1)。收获稳定的高表达植株T3代种子，以进行后续种子萌发及苗期干旱实验。

实施例3 ZmbHLH148过表达材料种子萌发表型检测

正常情况进行处理和播种，人工气候室25℃培养条件下进行萌发，结果显示，第3天LH244已经突破蛭石至表面，而转基因株系并未突破蛭石(见图2左图)，第3天和第4天从蛭石中取出，进行照相(见图2中图，由上至下分别为第3天和第4天的株系照片)，可以看到转基因ZmbHLH148株系的胚芽长度明显短于对照材料LH244。对其胚芽长度进行统计，结果显示转基因材料胚芽长度显著短于对照(图2右图)。表明该基因参与了玉米种子萌发的调控。

实施例4 ZmbHLH148过表达材料PEG模拟干旱处理表型检测

将野生型和ZmbHLH148基因过表达材料三个株系各20粒种子分别置于装有20mLH₂O和20％PEG6000的塑料方皿中，并将培养皿置于25℃黑暗培养箱中，每天观察其萌发情况，萌发至第4天时进行拍照并用ImageJ测量根长。图3中，A图表示在H₂O和20％PEG6000处理条件下野生型和ZmbHLH148基因过表达材料种子的萌发情况。根长统计数据(见图3中的B图和C图)表明：ZmbHLH148基因过表达材料种子在20％PEG6000处理条件下根长较野生型长，表现出一定的抗旱表型。

实施例5 ZmbHLH148过表达材料土壤干旱处理表型检测

将野生型和ZmbHLH148基因过表达材料播种于以黑土：草炭土：蛭石＝1：1：1混合的土中，每小盆140g，每盆种4粒种子，待幼苗长至三叶一心期时进行间苗，每盆保留生长大小、状态相对一致的植株3株，幼苗在温室中继续生长。一周后，在托盘中加入3L水，待水分充分吸收后，将所有小盆转移至另一个干燥的托盘中，此时，将种植的野生型和过表达材料分别分为两份，一份继续正常培养，按时浇水，另外一份不再浇水，进行干旱胁迫处理，每天定时观察，11-12天拍照记录。图4表示干旱处理条件下的表型结果，左图为正常浇水情况，右图为干旱处理的情况，从两者中可以看出，ZmbHLH148基因过表达材料与对照材料相比，具有明显的抗旱表型。

以上实验中野生型和过表达材料各种植15盆，其中各有9盆用来干旱处理；共进行三次以上独立实验，具有类似的结果。

实施例6 ZmbHLH148过表达材料相对含水量检测

观察盆内幼苗的状态，当出现干旱表型时，取正常浇水及干旱条件下过表达材料、对照材料的叶片各9片，称取叶片的重量记为W₁；再将叶片截成小段放入50mL大离心管中，加入蒸馏水，使叶片吸水至饱和(约24h)，然后将叶片上的水用吸水纸擦干，重新称重记为W₂；称重后将叶片烘干(80℃8h以上)，测干重记为W₃。计算相对含水量，相对含水量＝(W₁-W₃)/(W₂-W₃)×100％。每次实验野生型和过表达材料各做三个重复，三次独立重复实验。相对含水量统计结果见图5左图。

实施例7 ZmbHLH148过表达材料离体叶片失水率检测

野生型和ZmbHLH148过表达材料在温室中生长12天左右，分别取地上部分最上一片展开叶，用万分之一电子天平称量鲜重；在温度为24℃，湿度为30％～45％的条件下放置0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0小时后，进行称量。计算失水率，失水率＝(起始重量-失水后重量)/起始重量×100％。每次实验野生型和过表达材料各做三个重复，三次独立重复实验。根据失水率和时间制作成失水曲线，见图5右图，结果显示ZmbHLH148三个过表达材料失水率均明显低于野生型，说明三个过表达材料较对照材料具有抗旱性。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> ZmbHLH148蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

<130> KHP201110015.1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1876

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagagactcg ggtacatggt atcgggttac agtccaaaca ggaaattcta aggccgatgg 60

aagataagga tatgggtaca gtcacccagt cctgccatga cgcgaaagct tatagaaatc 120

aggtggcata aatactgtgc agggctaaag gttggtgggt cgaacggacc aggccatcag 180

gttatctaga aagctctcat gctcttccat ttctaggcta gcctaggtct ggaccagtta 240

gagtagacac gcaagtatca atcgattcat aagaggagga ggccattgag ggagccaagt 300

agaaggcagt cactgcaaac aacggtatgc attgcaagga ggaaatatag ctttcagccg 360

ttgcttttca tatgcgtttc agaaagtttg atcatctccc tttcgatttt tttaaagaaa 420

gtttaatcat cattcttgct cagaatcaag ttcttagctc ttagacacat ttagtatctt 480

gttgttagaa agctggtgag caactttgtc aagcctcaag agctcatgga agatggcagt 540

gctccaagac ggtctactcc acccacccgc agaagcagat ctgccgagtt ccacaatttt 600

tcagaaaggg taggttgtta tgcatcatgc atattttgta tggacggatc atgaccagtt 660

accggcattt gatctctttt gcttggaaca tttgtagagg agaagggata agatcaacga 720

gaagctgaaa gcattacagg agcttcttcc aaactgcaac aaggtaacat gcattgcgtc 780

ttaattttaa tccgaccata ccccttctgc tgttctcttt ttcgtttgat ctcagaatag 840

cttgtttcag accgacaaag tttcgatgct agacgaagca atcgactacc taaaatccct 900

tcagctacag cttcaggtac tgaatgaaat catatcagat acacaattgt tggttacact 960

agacatttat ttatttttat ctttctctcc tgcatccttt cctgttttat ttattcagcc 1020

tccagatatt atgggtgcta tagtagatca tcacattgtc atatatgcac acagatgctg 1080

gtcatgggga agggaatgtc accagtggtt cctcttgagc tgcagcaata catgcattac 1140

atcacggctg accctgccca gttgcctcca ttgcgcccat ccggccagca gcaccggcaa 1200

tttcagataa ctcaagccaa cccccagcga caatctaacg tcgagtcgga tttcttgagc 1260

cagatgcaga acttgcactc ttctgagccg cctcagaact ttctcaggcc gccgaaattg 1320

caactttata caccggtaat atgttcaaac attatagata tcaaagttaa ttttaacctt 1380

ttcttgtctt tattcttctt ttctcgtatt tcacgcattt caagatttaa gatttttctt 1440

tgtggggaaa gatgaaaatt taagctgcta gatcagggat atacagttca aatgccaaca 1500

ctgtcagctt ttacctgaac ggtgctagct actcatcacg ccttatgaga agtttacctc 1560

tgattcagga acagaggggt ggcctaccca acacgagcca caacactgga tggatttctg 1620

ggagttcctc gtataacttc atggagtgat gtgctcctaa tgacaaaatt tgacacggca 1680

ggcgtgcagc cttgaactcg gaagagatcg ttcagtttgg gacctgcagc atggttcacc 1740

tgagagaatt ccatgaatgt gtagtactag ttaactagct agctagttgt gttattaaat 1800

aaaacgttgt gattgtgatg ctgctcattt tgctatctga atcttaccgt ccaattctcc 1860

tccatgttca tgcaaa 1876

<210> 2

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Asp Gly Ser Ala Pro Arg Arg Ser Thr Pro Pro Thr Arg Arg

1 5 10 15

Ser Arg Ser Ala Glu Phe His Asn Phe Ser Glu Arg Arg Arg Arg Asp

20 25 30

Lys Ile Asn Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gln Glu Leu Leu Pro Asn Cys

35 40 45

Asn Lys Thr Asp Lys Val Ser Met Leu Asp Glu Ala Ile Asp Tyr Leu

50 55 60

Lys Ser Leu Gln Leu Gln Leu Gln Met Leu Val Met Gly Lys Gly Met

65 70 75 80

Ser Pro Val Val Pro Leu Glu Leu Gln Gln Tyr Met His Tyr Ile Thr

85 90 95

Ala Asp Pro Ala Gln Leu Pro Pro Leu Arg Pro Ser Gly Gln Gln His

100 105 110

Arg Gln Phe Gln Ile Thr Gln Ala Asn Pro Gln Arg Gln Ser Asn Val

115 120 125

Glu Ser Asp Phe Leu Ser Gln Met Gln Asn Leu His Ser Ser Glu Pro

130 135 140

Pro Gln Asn Phe Leu Arg Pro Pro Lys Leu Gln Leu Tyr Thr Pro Glu

145 150 155 160

Gln Arg Gly Gly Leu Pro Asn Thr Ser His Asn Thr Gly Trp Ile Ser

165 170 175

Gly Ser Ser Ser Tyr Asn Phe Met Glu

180 185

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tatggaagat ggcagtgctc c 21

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcactccatg aagttatacg aggaact 27

Claims

1.ZmbHLH148蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高植物抗旱性和/或调控植物种子萌发中的应用。

2.ZmbHLH148蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育抗旱性提高的转基因植物中的应用。

3.ZmbHLH148蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐旱种质资源改良中的应用。

4.ZmbHLH148蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高干旱环境下植物存活率中的应用。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其特征在于，所述ZmbHLH148蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：

1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

6.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其特征在于，ZmbHLH148蛋白的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或

7.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。

8.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；优选水稻、小麦、大豆、高粱、小米、棉花、大麦或玉米。

9.构建抗旱的转基因玉米的方法，其特征在于，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，使玉米表达或过表达ZmbHLH148基因。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导或基因编辑技术的方法将包含ZmbHLH148基因的重组表达载体导入玉米，获得转基因玉米株系。