CN106893731A - 大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1，它是来自于大豆根系突变体材料M18，所述的大豆根系突变体材料M18是大豆（Glycine max）品种吉农18的突变体，经实验证明，GmXTH1是一种抗旱基因，过量表达GmXTH1基因的转基因株系具有更强大的根系，干旱胁迫处理下，SOD活性、POD活性、CAT活性有显著升高，有较高的光能吸收和转化作用，抗旱性强。
Description
技术领域
本发明属分子生物学领域，具体涉及大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1及应用。
背景技术
木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase,XTH) 是植物细胞壁重构过程中的关键酶，是一种细胞壁松弛酶(van Sandt et al.,2007)，它能够内切木葡聚糖聚合体，将产生的还原性末端连接到另外一个木葡聚糖链或水分子上，在细胞壁重构、影响植物生长发育方面有重要作用。
XTH 通过切割和重新“移植”木葡聚糖的作用，在不降低细胞壁机械性质的前提下提供细胞壁的延展性，从而支持由膨压驱动的细胞体积增长。已有的研究显示 XTH 基因的转录活性与植物根和茎的伸长具有显著的相关性，暗示XTH 活性对植物生长具有重要意义，同时有研究表明XTH 基因可响应赤霉素、生长素、油菜内脂等植物激素，以及其它环境信号，可能在植物生长调控的生理过程中扮演着重要的角色。对拟南芥的大量基因表达分析表明，XTH 基因具有器官和组织特异性，例如：AtXTH1 在长角果中表达，AtXTH9 则在茎尖分生组织中，花芽和花枝中表达，其生理作用与茎和花枝的伸长有关(Hyodo et al.,2003)，而 AtXTH17、AtXTH18、AtXTH19 和 AtXTH20 在根中表达(Yokoya-maandNishitani, 2001)。虽然这4个根特异表达的基因在系统发生上紧密相关，但是它们在根中具有不同的组织特异性：AtXTH17，AtXTH18 在根的伸长区和分化区的所有细胞类型中表达，AtXTH19 在根的分生区、伸长区和分化区表达，AtXTH20 仅在根成熟区维管束中表达(Vissenberg et al., 2005)。
XTHs 为多基因家族编码的一类蛋白质，属于糖苷水解酶家族 GH16(vanSandtetal,et. 2006;2007)。模式植物基因组数据显示，XTHs 在拟南芥、水稻和毛果杨基因组中分别有 33、29 和 41 个成员。XTH 家族的蛋白含有一个特征基序 DEIDFEFLG，包含介导催化活性的氨基酸残基。近期关于 XTH 基因家族的研究主要集中在对家族成员生理作用和表达谱的研究与探讨方面，一系列研究的结果表明：(1) XTH 家族成员可能在植物生长、发育及对环境胁迫的响应等诸多方面发挥重要的生理作用。XTH 基因家族在功能上具有多样性。(2)XTH家族成员在表达特性上明显不同，这种差异与家族成员在植物生长发育过程中所起的作用密切相关。(3)XTH 基因响应多种信号，不同家族成员对信号的响应明显不同。基因的生理作用和基因表达部位及对各种信号的响应密切相关。
目前对 XTH 基因的研究多集中在拟南芥等模式植物，有关 XTH 基因的应用基础研究也相对薄弱，虽然已从一些物种中分离得到了 XTH 的同源基因，但仍缺乏以改良植物性状为目标的基因转化研究报道，对大豆中XTH基因的功能的了解则更为有限。本研究通过基因工程技术克隆大豆来源的XTH新基因GmXTH1，通过在大豆中过量表达和干扰表达GmXTH1基因，来鉴定目的基因的功能，探讨GmXTH1基因对大豆苗期根系生长发育的影响及对干旱胁迫的响应，为利用分子生物学手段调控大豆根系生长发育奠定理论基础、为培育根系发达的抗旱大豆新品种提供基因资源和基础材料。
发明内容
本发明的目的是为了增强植物的根系发育，提高植物的耐旱能力，而提供一种大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1及应用。
大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1，它是下述方法制备的：
1）提取大豆根系突变体材料M18苗期根系组织总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板；
2）用引物：
XTHCDS-s：ATCAATCCATGGTGGTTCAT
XTHCDS-as：CCTATATGATGCTGTGAATG
扩增；
所述的GmXTH1为人工合成。
GmXTH1蛋白，它是序列表SEQ ID NO.1所示基因表达的蛋白。
pCAMBIA3301- GmXTH1植物过表达载体，它是在pCAMBIA3301中插入了如序列表SEQ ID NO.1所示基因。
大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1在培育抗旱植转基因植物品种的应用；
所述的植物为大豆。
本发明提供了大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1，它是来自于大豆根系突变体材料M18，所述的的大豆根系突变体材料M18是大豆（Glycine max）品种吉农18的突变体，经实验证明，GmXTH1是一种抗旱基因，过量表达GmXTH1基因的转基因株系具有更强大的根系，干旱胁迫处理下， SOD活性、POD活性、CAT活性有显著升高，有较高的光能吸收和转化作用，抗旱性强。
过量表达GmXTH1基因的转基因株系比对照M18具有更强大的根系，根系主要表型性状的参数平均值都得到了显著的增加，说明GmXTH1基因的过量表达明显促进了苗期大豆植株根系的生长发育；相反的，GmXTH1基因的干扰表达使苗期的大豆根系发达程度受到了抑制，各指标要明显低于对照，暗示GmXTH1基因的表达对苗期大豆根系的生长发育有重要影响。
干旱胁迫处理下，各株系的SOD活性、POD活性、CAT活性均有显著升高，平均值表现为GmXTH1基因过表达株系＞对照M18＞GmXTH1基因干扰表达株系，且差异达到极显著水平(P ＜ 0.01)，表明过表达株系的抵御活性氧和自由基伤害的能力较对照M18和干扰表达株系有明显增强，其抗旱能力较强。
GmXTH1基因的表达明显影响了大豆苗期的根系活力，过表达株系有着较高的根系活力，有较强的抗旱性。
干旱胁迫处理下，各株系的叶片含水量都有显著下降，无论是正常条件下还是干旱处理条件下，过表达株系的叶片含水量都相对较高，说明过表达GmXTH1基因可以使大豆幼苗的叶片含水量维持在较高的水平，有利于保持其叶绿体结构和 PSⅡ功能的完整，从而使其保持较高的光合作用水平，可见过表达株系的抗旱性强于对照M18和干扰表达株系。
干旱胁迫下大豆幼苗叶片的叶绿素含量较正常处理有显著降低，表明干旱处理可以抑制叶绿素合成，并加速其分解，可能与干旱胁迫使叶绿体发生膜脂过氧化而产生的活性氧、丙二醛对叶绿素的破坏有关。但无论是干旱处理还是正常水分处理，叶绿素含量均表现为GmXTH1基因过表达株系＞对照M18＞GmXTH1基因干扰表达株系，表明过表达株系的叶片在光合作用中有较高的光能吸收和转化作用，说明过表达株系较对照M18和干扰表达株系具有较强的抗旱性。
过表达GmXTH1基因的转基因株系的抗旱能力要显著高于对照M18，相反的，GmXTH1基因受到干扰的转基因株系抗旱能力要弱于对照。而且过表达株系苗期根系的生长状况明显优于对照M18，其农艺性状较对照并未有明显改变。过量表达GmXTH1基因的转基因株系OEA1、OEA3农艺性状较好，抗旱性强，可以作为大豆抗旱育种的基础材料加以利用。
附图说明
图 1 GmXTH1基因核心片段的 PCR 扩增电泳图，M: DNA 标准分子量； 1-4：PCR产物；
图 2 GmXTH1基因3´端片段的 PCR 扩增电泳图，M: DNA 标准分子量； 1-4：PCR 产物；
图 3 GmXTH1基因 5´端片段 PCR 扩增电泳图，M: DNA 标准分子量； 1-4：PCR 产物；
图 4 GmXTH1 基因全长片段的 PCR 扩增电泳图，M: DNA 标准分子量； 1-4：PCR 产物；
图5 植物过表达载体的构建及验证，A. 过表达载体的构建；B. 过表达载体的验证；C.表达载体的T-DNA结构区；
图6 植物干扰表达载体的构建及验证，A. 正义片段连入表达载体；B. 内含子片段连入表达载体；C. 反义片段连入表达载体；D.干扰表达载体的T-DNA结构区；E.干扰表达载体的验证；
图7 T0代过表达转化植株的PCR检测，A. 目标基因GmXTH1；B. 筛选标记基因bar，M：DNA分子量标准；P：质粒阳性对照；N：水阴性对照；CK：未转基因植株(阴性对照）；1-5：转基因阳性植株OEA1-OEA5；
图8 T1代过表达转化植株的PCR检测，A. 目标基因GmXTH1；B. 筛选标记基因bar，M：DNA分子量标准；P：质粒阳性对照；N：水阴性对照；CK：未转基因植株(阴性对照）；1-5：转基因阳性植株OEA1-OEA5；
图9 T2代过表达转化植株的PCR检测，A. 目标基因GmXTH1；B. 筛选标记基因bar，M：DNA分子量标准；P：质粒阳性对照；N：水阴性对照；CK：未转基因植株(阴性对照）；1-5：转基因阳性植株OEA1-OEA5；
图10 T2代过表达转化植株的Southern blot检测， M：DNA分子量标准；P:阳性对照;C:阴性对照(未经转化的大豆植株);1-5:转基因植株OEA1-OEA5；
图11 T0代干扰表达转化植株的PCR检测A. 筛选标记基因bar；B.启动子35S；M：DNA分子量标准；P：质粒阳性对照；N：水阴性对照；CK：未转基因植株(阴性对照）；1-5：转基因阳性植株IEA1-IEA6；
图12 T1代干扰表达转化植株的PCR检测，A. 筛选标记基因bar；B.启动子35S，M：DNA分子量标准；P：质粒阳性对照；N：水阴性对照；CK：未转基因植株(阴性对照）；1-5：转基因阳性植株IEA1、IEA3-IEA6；
图13 T2代干扰表达转化植株的PCR检测，A. 筛选标记基因bar；B.启动子35S，M：DNA分子量标准；P：质粒阳性对照；N：水阴性对照；CK：未转基因植株(阴性对照）；1-5：转基因阳性植株IEA1、IEA3-IEA6；
图14 T2代干扰表达Southern blot检测 ，M：DNA分子量标准；P:阳性对照;C:阴性对照(未经转化的大豆植株);1-5:转基因植株OEA1-OEA5；
图15 目标基因GmXTH1的相对表达量；
图16干旱胁迫对不同转基因株系生理生化指标的影响。
具体实施方式
实施例1基因 GmXTH1的 cDNA 序列的克隆
大豆（Glycine max）根系突变体材料M18（大豆吉农18的突变体），由吉林农业大学植物生物技术中心提供。
使用TAKARA公司生产的RNAiso试剂盒从大豆根系突变体材料M18苗期根系组织提取总RNA，根据RNA-seq测序结果序列，设计嵌套引物XTHgsp，扩增目的片段并测序，验证扩增得到正确的目的片段。
采用TAKARA公司的RACE试剂盒克隆3´端片段。以大豆苗期根系的cDNA为模板，使用引物XTHgsp-s和试剂盒中3′ RACE Outer Primer进行Outer PCR扩增反应，再以反应产物为模板使用引物XTHgsp-as和试剂盒中的3′RACE Inner Primer进行Inner PCR反应。扩增得到目的基因3´端片段。
采用TAKARA公司的RACE试剂盒克隆5´端片段。以大豆苗期根系总RNA为模板，使用引物XTHgsp-s和试剂盒中5′ RACE Outer Primer进行Outer PCR反应，以反应产物为模板再使用引物XTHgsp-as和试剂盒中的5′ RACE Inner Primer进行Inner PCR反应。扩增得到目的基因5´端片段。
将3´RACE与5´RACE反应结果进行拼接，设计扩增全长基因片段的特异性引物XTHCDS。以大豆根系总RNA对应的cDNA为模板，通过RT-PCR方法扩增其对应片段。
表1 PCR引物序列
GmXTH1基因全长 cDNA 序列的克隆
根据前期筛选得到的GmXTH1核心片段设计特异引物 XTHgsp，经RT-PCR 扩增后，得到一条约 303bp的核酸条带（图1），将 PCR 产物克隆至 PMD18-T 载体后进行测序。测序结果与 NCBI中序列号为 XM_003542112.3 的序列相比同源性达到 100%，证明克隆得到了目的基因的部分核心片段，可以作为 5`RACE、3`RACE 的核心片段。
基因 GmXTH1 的 3´端片段的克隆使用特异性引物XTHgsp-s和试剂盒中 3′ RACEOuter Primer 进行第一次 PCR 反应，结果未得到目的产物；使用上游特异性引物XTHgsp-as 和试剂盒中 3′RACE Inner Primer 进行第二次 PCR 反应，扩增得到一条约422bp 的片段（图2）。测序结果表明，得到大豆木葡聚糖转移酶/水解酶基因GmXTH1 的 3´端片段的基因序列，共包括 422bp，其中新扩增的核酸片段为142bp，其中编码区 45bp，3`非编码区 97bp。
通过 TAKARA 公司的 5´RACE 试剂盒克隆目的基因的 5´端片段。使用特异性引物 XTHgsp-s 和试剂盒中的 5′RACE Inner Primer 进行 Inner PCR 反应，扩增得到一条约632bp 的片段（图3），测序结果表明获得了大豆GmXTH1基因的 5´端片段序列，其中包括编码区 570bp，5`非编码区 62bp，新扩增的片段区域为 632bp。
基因 GmXTH1全长克隆。将目的基因 3´端片段的克隆测序结果和 5´端片段的克隆测序结果进行拼接，去掉冗余部分，设计扩增全长序列的特异性引物XTHCDS。PCR 反应扩增全长 cDNA 序列，测序结果证明得到基因全长 1015bp（图4）。通过 NCBI 的BLAST 程序在 Genbank 中搜索相似序列，结果没有搜索到完全相似的序列的基因序列，证明了分离得到一个新基因的核酸序列。
将GmXTH1基因全序列连入克隆载体pMD18-T Vector，对重组载体进行测序后进行生物信息学分析，测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。
实施例2 植物表达载体的构建及遗传转化
利用限制性内切酶BglII和BstEII对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，T4连接酶作用下将克隆得到的GmXTH1全长基因替换3301上原有的GUS基因。构建以Bar为筛选标记，CaMV35S启动子启动目标基因GmXTH1的pCAMBIA3301- GmXTH1植物过表达载体。
采用同样方法，将3301上原有的GUS基因替换为GmXTH1核心正义+内含子+ GmXTH1核心反义片段，构建pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi植物干扰表达载体。
将构建好的植物过表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1和植物干扰表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi，采用农杆菌介导的方法转化大豆突变体材料M18。
植物表达载体的验证及遗传转化
利用BglII和BstEII限制性内切酶对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，得到大小为10kb的3301载体大片段和2042bp的GUS基因片段；利用引物XTHover对克隆载体Pmd18-T-GmXTH1进行PCR扩增，得到大小840bp的GmXTH1基因ORF全长片段（图5A），利用T4连接酶将GmXTH1基因ORF全长片段连入植物表达载体pCAMBIA3301。
对构建成功的植物过表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1-over进行PCR和双酶切鉴定，均得到与预期大小相符的GmXTH1基因ORF全长片段840bp（图5B），对其进行测序，测序结果正确，说明植物过表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1构建成功（图5C）。
利用BglII和MfeI限制性内切酶对植物表达载体pCAMBIA3301进行双酶切，得到大小为10kb的3301载体大片段和2042bp的GUS基因片段；利用引物XTHZ对克隆载体Pmd18-T-GmXTH1进行PCR扩增，得到大小为303bp的目的基因正义片段（图6A），利用T4连接酶将GmXTH1正义片段连入植物表达载体pCAMBIA3301，得到中间载体A pCAMBIA3301-XTHZ。
利用MfeI和VspI限制性内切酶对植物表达载体A pCAMBIA3301-XTHZ进行双酶切，得到大小为10kb的3301载体大片段和818bp的GUS基因部分片段；利用引物SSR对克隆载体Pmd18-T-SSR进行PCR扩增，得到大小为205bp的SSR内含子片段（图6B），利用T4连接酶将SSR内含子连入植物表达载体pCAMBIA3301-XTHZ，得到中间载体B pCAMBIA3301-XTHZ-SSR。
利用VspI和BstEII限制性内切酶对植物表达载体pCAMBIA3301-XTHZ-SSR进行双酶切，得到大小为10kb的3301载体大片段和894bp的GUS基因部分片段；利用引物XTHF对克隆载体Pmd18-T-GmXTH1进行PCR扩增，得到大小为303bp的目的基因反义片段（图6C），利用T4连接酶将GmXTH1反义片段连入植物表达载体pCAMBIA3301-XTHZ-SSR，得到植物干扰表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi（图6D）。
对构建成功的植物干扰表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi进行PCR和酶切鉴定。分别对GmXTH1正义片段、SSR内含子、GmXTH1反义片段进行特异性扩增，得到的扩增条带都与预期大小相符。用BglII和BstEII双酶切该质粒，得到一条大小约为811bp的XTHZ-SSR-XTHF干扰片段；用BglII、MfeI双酶切该质粒，得到一条大小约为303bp 的GmXTH1正义片段；用MfeI和VspI双酶切得到一条大小约为205bp的SSR内含子片段；用VspI和BstEII双酶切该质粒，得到一条大小约为303bp 的GmXTH1反义片段（图6E）。
以大豆突变体材料M18做为受体，将构建好的植物过表达载体pCAMBIA3301-GmXTH1和植物干扰表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi采用农杆菌介导的方法转化大豆子叶节，经萌发培养、恢复培养、共培养、选择培养、伸长培养、生根和炼苗移栽，获得抗性转化植株，并在温室内进行培养和加代。
实施例3转化植株的分子检测
采用改良的CTAB法，从大豆叶片中提取基因组DNA，将其作为模板，以载体质粒为阳性对照，以未转化植株为阴性对照，分别以GmXTH1基因、筛选标记基因bar和35S启动子的特异性引物（表1）进行PCR扩增。
对PCR检测为阳性的转基因植株，进行Southern杂交检测。以纯化的筛选标记基因bar为模板制备探针，采用随机引物标记法进行标记，杂交及检测的其他步骤均按照DIGHigh Prime DNA Labeling and Detection Starter KitII试剂盒的说明书操作。
利用 Total RNA Extraction Kit 提取试剂盒提取转基因阳性植株和未转化植株的根系总 RNA，反转录成 cDNA，利用 Mx3000P 荧光定量 PCR 仪对目标基因GmXTH1进行实时荧光定量检测。
转化植株的分子检测
采用农杆菌介导的方法获得了转植物过表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1的T0代抗性植株8株，对目标基因GmXTH1和筛选标记基因bar分别进行PCR检测（图7），两个基因均检测到的植株有5株，标号OEA1-OEA5（OEA，over expression- agrobacterium-mediatedmethod）。
将检测为阳性的植株在人工气候室内培养至成熟，收获籽粒，在温室内进行加代，对T1代植株进行PCR检测，OEA1-OEA5的T1代植株均检测到了目标基因GmXTH1和筛选标记基因bar（图8）。
收获检测为阳性的OEA1-OEA5的T1代植株籽粒，种植于吉林农业大学转基因试验种植基地，在T2代植株长至R1期时，每个株系随机选择20株进行PCR检测，图9是部分阳性材料的检测结果。
对T2代过表达转基因阳性植株进行southern杂交检测，选用Hind Ⅲ限制性内切酶，对外源筛选标记基因bar进行Southern杂交分析，检测外源基因在大豆M18的整合情况，进一步验证转化事件的准确性。杂交结果显示PCR检测为阳性的5株转基因植株均有明显的杂交信号，且杂交带的大小、位置互不相同，说明外源基因bar已经整合到大豆的基因组中，且整合形式均为单拷贝（图10）。
采用农杆菌介导的方法获得了转干扰表达载体pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi的T0代抗性植株11株，对筛选标记基因bar和启动子35s分别进行PCR检测（图11），两个基因均检测到的植株有6株，标号IEA1-IEA6（IEA，interference expression- agrobacterium-mediated method）。
将检测为阳性的植株在人工气候室内培养至成熟，收获籽粒，在温室内进行加代，对T1代植株进行PCR检测（图12），IEA1-IEA6的T1代植株均检测到了筛选标记基因bar和启动子35s，但IEA2植株的T1代植株中仅检测到了2株阳性，故没有进行后续的加代培养和试验。
收获检测为阳性的IEA1、IEA3-IEA6的T1代植株籽粒，种植于吉林农业大学转基因试验种植基地，在T2代植株长至R1期时，每个株系随机选择20株进行PCR检测，图13是部分阳性材料的检测结果。
对T2代干扰表达转基因阳性植株进行southern杂交检测，选用Hind Ⅲ限制性内切酶，对外源筛选标记基因bar进行Southern杂交分析，检测外源基因在大豆M18的整合情况，进一步验证转化事件的准确性。杂交结果显示PCR检测为阳性的5株转基因植株均有明显的杂交信号，且杂交带的大小、位置互不相同，说明外源基因bar已经整合到大豆的基因组中，且整合形式均为单拷贝（图14）。
实施例4 GmXTH1基因的功能分析
采用砂培法，将转化植株和受体材料种植于直径7cm高22cm的圆柱形塑料筒，于人工培养箱内进行培养。植株长至三节期(V3期)时，用流水冲洗净根系上的砂粒，用 EPSON扫描仪(Seiko Epson Corp, Tokyo, Japan) 对根系进行扫描，观察根系形态（每份转基因阳性品系取5株，每株材料3次重复）。扫描后保存图像，采用WinRHIZO (version 4.0b, RegentInstruments Inc., Quebec ,Canada 2000) 分析程序对图像进行分析。分析主根长(RL)、侧根总长度、根表面积(SA)和根体积(RV)，测定根干重和根鲜重。用DPS数据分析软件进行相关分析和方差分析，对参数的平均值进行LSR多重比较，进行差异显著性检验(α=0.05)。
采用反复干旱法对三节期(V3期)的转化植株和对照植株同时进行水分胁迫，干旱处理 10d 后复水，使土壤水分达田间持水量的 80% ±5%，3 次干旱处理后，采用氮蓝四唑(NBT)光化还原比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性；愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性；紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）的活性；称重法测定叶片相对含水量(RWC)；丙酮比色法测定叶绿素含量。用GraphPad Prism 5软件进行数据整理和作图。
田间试验在吉林省吉林农业大学转基因试验基地进行，采取随机区组设计，三行区，行长 4.5m，每行播种 60 粒，每个品系重复 3次，待秋季大豆成熟后，每小区随机采取10 株大豆进行考种，其余收获测产。试验数据采用 Excel2003 及DPS软件进行分析，检验各处理平均值之间的差异显著性。
转化植株目标基因GmXTH1的表达量分析
大豆苗期（V3期）提取T2代阳性转化植株的根部组织总RNA，反转录成相对应的cDNA，进行实时定量PCR检测。GmXTH1基因的表达量分析根据公式2-ΔΔCt法计算，实时定量PCR结果如图15所示。与对照受体植株相比，过量表达GmXTH1基因的转基因株系中，GmXTH1基因在根中的相对表达量显著增加，其中OEA3株系的相对表达量平均值最高，是对照株系的4.3327倍，其次是OEA1株系，是对照株系的3.66403倍。干扰表达GmXTH1基因的转基因株系中，GmXTH1基因在根中的相对表达量显著降低，其中IEA4降低幅度最大，降低了56.3163%，其次是IEA5，比对照株系降低了47.303%。
转化植株根系形态指标鉴定
对过表达GmXTH1基因的转化株系OEA1、OEA3，干扰表达GmXTH1基因的转化株系IEA4、IEA5，以及受体对照M18的苗期（V3期）的根系表观形态进行扫描测定，结果表明，过表达株系OEA1、OEA3的主根长、一级侧根数、侧根总长度、根表面积、根体积、根干重、根鲜重等指标的平均值均高于对照，而干扰表达株系IEA4、IEA5的这七项指标的平均值均低于对照，且都达到了显著水平。说明GmXTH1基因的过量表达明显促进了苗期大豆植株根系的生长发育，根系主要表型性状的参数平均值都得到了显著的增加；相反的，GmXTH1基因的干扰表达使苗期的大豆根系发达程度受到了抑制，各指标要明显低于对照。暗示GmXTH1基因的表达对苗期大豆根系的生长发育有重要影响。
表2 不同转基因株系的根系表型性状
干旱胁迫对不同转基因株系生理生化指标的影响
对 SOD 活性的影响
超氧化物歧化酶(SOD)是植物体内的一种保护酶，逆境中 SOD 保护酶活性升高可控制膜脂质过氧化作用, 减少干旱对膜结构的伤害, 增强植物自身保护的调节能力。正常条件下，过表达株系OEA1、OEA3的SOD活性要显著高于对照M18，相反干扰表达株系IEA4、IEA5的SOD活性显著低于对照。干旱胁迫条件下，对照株系、过表达转基因株系、干扰表达转基因株系的SOD活性都有显著上升，SOD活性平均值表现为GmXTH1基因过表达株系＞对照M18＞GmXTH1基因干扰表达株系，且差异达到极显著水平(P ＜ 0.01)，GmXTH1基因过表达株系OEA3的叶片SOD活性最高，表明其抵御活性氧和自由基伤害的能力较强。
对POD活性的影响
正常条件下，过表达株系、干扰表达株系和对照株系间进行比较表明，其叶片POD活性差异不显著。干旱胁迫条件下，对照株系、过表达转基因株系、干扰表达转基因株系的POD活性都有显著上升，其中，OEA1、OEA3株系的POD活性平均值比对照株系分别高18.39%、17.08%，差异达到显著水平；IEA4、IEA5株系的POD活性平均值比对照株系略有降低，分别降低了2.8%、1.19%，差异并未达到显著水平。
对CAT活性的影响
正常条件下，CAT活性平均值表现为GmXTH1基因过表达株系＞对照M18＞GmXTH1基因干扰表达株系，干扰表达株系的CAT活性下降显著。干旱胁迫条件下，对照株系、过表达转基因株系、干扰表达转基因株系的CAT活性都有显著上升，不同株系间的变化趋势差异较大，其中，OEA1、OEA3株系的CAT活性平均值比对照株系分别高26.19%、28.36%， IEA4、IEA5株系的POD活性平均值比对照株系分别降低了29.93%、31.77%，差异达到显著水平。
对根系活力的影响
正常水分处理下，根系活力平均值表现为：OEA3＞OEA1＞CK＞IE5＞IE4，且过表达株系、对照株系、干扰表达株系间差异显著，说明GmXTH1基因的表达明显影响了大豆苗期的根系活力。在干旱处理条件下不同株系间的根系活力均呈下降趋势，根系活力平均值OEA3＞OEA1＞CK＞IE4＞IE5。无论是正常水分条件下，还是干旱胁迫处理条件下，根系活力平均值都表现为：过表达株系＞对照株系＞干扰表达株系，说明过表达株系有着较高的根系活力，有较强的抗旱性。
对叶片相对含水量的影响
正常条件下，叶片含水量表现为GmXTH1基因过表达株系＞对照M18＞GmXTH1基因干扰表达株系，干扰表达株系的叶片含水量显著低于对照和过表达株系。干旱胁迫处理下，各株系的叶片含水量都有显著下降，叶片含水量平均值表现为GmXTH1基因过表达株系＞对照M18＞GmXTH1基因干扰表达株系，且差异显著。说明无论是正常条件下还是干旱处理条件下，过表达株系的叶片含水量都相对较高，说明过表达GmXTH1基因可以使大豆幼苗的保水力较其他材料有所提高。叶片含水量高的材料比较抗（耐）旱，叶片含水量是抗旱性鉴定的可靠指标。
对叶绿素含量的影响
叶绿素是光合作用中重要的色素，在光合作用中占重要地位。无论是干旱处理还是正常水分处理，叶绿素含量均表现为GmXTH1基因过表达株系＞对照M18＞GmXTH1基因干扰表达株系。干旱胁迫下大豆幼苗叶片的叶绿素含量较正常处理有显著降低，其中过表达株系的下降幅度（18.708-18.687%）小于干扰表达株系的下降幅度（24.512-26.728%）。
转化材料的农艺性状分析
由调查结果可知，在正常田间管理条件下，转基因株系与对照株系M18在叶形、花色、毛色、生育期和结荚习性等方面无明显差异，均表现为圆叶，紫花，棕色茸毛，结荚习性为无限型。转基因大豆在株高、节数、荚数、百粒重、单株粒重等方面与非转基因大豆没有显著差异。产量表现为OEA3＞OEA1＞CK＞IEA5＞IEA4，其中OEA3株系增产明显，增产幅度为8.19%，其余材料间差异未达到显著水平(表3)。
表3 转基因大豆产量性状调查结果
<110> 吉林农业大学
<120> 大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1及应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
tattaatcaa tccatggtgg ttcatatgta tctttcagct tctcagtgga tgggacccca 60
ataagagaat tcaagaacat ggggttcggc tcgagccaga tgcccagcgc gctcgtggcg 120
ctggtgctcg gcctctgctg cgtcggcggc gcacgcccga cggggaggat cgacgagggg 180
caggaggtca tgtggggcga cggccggggg agcgtctcgc cggacggcca ggtgatggcg 240
ctgtcgctcc accacacctc cggctccggg tggtgctcca agaacacgta cctgttcgcg 300
cgcgtcacca cctgctactt catgacggaa ggggagtcgg atatccacga tgaggtggac 360
ctggagttcc tcggcaacgt caccgggcag ccgtacacgc tgcacaccat cgtcttcgcc 420
aatggcaccc gcggcaaaga gcagcagttc cacctctggt tcgaccccac caccgacttc 480
caccacgtcg tcttctacgt gcacggcgtc cggatccggg agttccgccg ccgcggcgac 540
cggaccgtgc cgttccggac gtcgcagccg atggaatcga aaagagtttc attcccaaag 600
gagcagccaa tgcggatata ctcaagccta tggaatgctg atgactgggc aacaagaggt 660
ggcattgtga agactgattg gagccaagct ccattcacag catcatatag gaacttcaat 720
gccaatgcct gtgtccattc tggaccatca tcttgcactt ccaactctgc ctcctccaat 780
gcctggttca accaacagtt ggattcaaca agccaagaca gactgtgttg ggtgcagaag 840
aattacatgt ttaacaatta ctgcactgtc accaatagat ttccacaagg ccttccccca 900
gagtgccaag catcatgagg atatactcaa gcctatggaa tgctgactgg gcaacaagag 960
gtggcattgt gaaactgatt ggagccaagc tccattcaca gcatcatata ggaa 1014
Claims (7)
1. 大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1，它是下述方法制备的：
1）提取大豆根系突变体材料M18苗期根系组织总RNA，反转录成cDNA，并以其为模板；
2）用引物：
XTHCDS-s：ATCAATCCATGGTGGTTCAT
XTHCDS-as：CCTATATGATGCTGTGAATG
扩增。
3.如权利要求1所述的大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1，其特征在于：所述的GmXTH1为人工合成。
4. GmXTH1蛋白，它是序列表SEQ ID NO.1所示基因表达的蛋白。
5. pCAMBIA3301- GmXTH1植物表达载体，它是在pCAMBIA3301中插入了如序列表SEQID NO.1所示基因。
6.权利要求1所述的大豆木葡聚糖转移酶水解酶基因GmXTH1在培育抗旱植转基因植物品种的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的植物为大豆。
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