CN105462987A - 水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4基因的新应用 - Google Patents

水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4基因的新应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及工程菌酿酒酵母和植物基因工程领域。本发明提供了水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，其cDNA全长序列如SEQ？ID？NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明OsBBTI4基因编码的蛋白质OsBBTI4与水稻对重金属镉的积累相关。通过将OsBBTI4基因在水稻中转基因超表达或RNAi，调控转基因水稻株系中OsBBTI4基因的表达量，可以影响转基因水稻种子中镉含量，得到低镉富集的转基因水稻品系。OsBBTI4基因可应用于工程菌及水稻针对体内镉含量改变的遗传工程育种，也可应用于其他植物的针对体内镉富集的遗传工程育种。

Description

水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4基因的新应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4(OryzasativaBowman-Birktrypsininhibitor4)及其编码基因和在调控水稻镉积累方面的应用。
背景技术
重金属镉是一种生物体非必需的毒性元素。随着现代社会的发展，环境污染越来越严重，由地壳释放到水、大气和土壤中的具有毒性的活性镉离子也越来越多。这些镉离子进入生物圈，并通过食物链进入人体，严重危害人体健康。
水稻是一种重金属镉富集的农作物。2014年4月，国土资源部和环境保护部公布数据表明，我国土地的重金属污染十分严重，按照点位超标率计算，我国土壤中镉超标的土地已达我国国土总面积的7％。按照污染发生的地区来看，重金属污染则主要分布于我国的华中华南地区、泛珠三角地区、长三角地区及东北地区，这些地区均为我国水稻的主要产区，严重影响我国的水稻粮食安全。近年来，由媒体报道的稻米镉超标事件层出不穷，引起了民众巨大的恐慌。
蛋白酶抑制剂在植物中普遍存在，通过调控蛋白酶活性应答多种细胞生理反应，包括植物生长发育、抗病性及逆境胁迫应答。BBI(Bowman-BirkInhibitor)是植物中的蛋白酶抑制剂的一种，其抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶，糜蛋白酶和弹性蛋白酶等丝氨酸蛋白酶。BBI蛋白富含半胱氨酸，含有1-3个BBI的结构域，该结构域的分子量约为7-8kD，有两个独立的活性位点，可以同时抑制两个不同的蛋白酶分子，通过充当蛋白酶的假底物而抑制蛋白酶活性。根据含有BBI结构域的数目，BBI蛋白的分子量分别为8kD，16kD和24kD左右。目前已在豆科和禾本科植物中均克隆到了编码BBI蛋白的基因，其中豆科植物中的BBI蛋白因具有明显的抑癌特征而得以广泛的研究。
植物中的BBI蛋白是由多基因的基因家族编码的，根据其BBI结构域中两个活性位点抑制底物的特异性，大豆中的BBI蛋白可分为三类：BBI-A、BBI-C和BBI-D。BBI-A的两个活性位点分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，BBI-C的两个活性位点分别抑制胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性，而BBI-D则分别抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。研究表明，大豆中BBI蛋白的生物学功能包括：调节种子萌发过程中內源蛋白酶活性；在种子休眠期储藏还原性的硫氨基酸(如半胱氨酸)；保护植物免受昆虫和其他病原微生物的侵害等。
BBI基因也参与应答多种逆境胁迫，其表达可以受到生物逆境、非生物逆境及激素的诱导。水稻OsBBPI基因是单子叶植物中克隆的第一个BBI基因(U76004)，研究表明，该基因表达受光调节，且在叶片中的表达受到切割伤害、茉莉酸和乙烯的诱导。水稻BBI基因的表达受到褐飞虱的诱导，表明该基因可能参与应答水稻对褐飞虱的伤害胁迫反应。绞股蓝CjBBI基因在酵母中表达可以提高酵母对重金属Cd和药物的耐受性，并且其表达受Cd胁迫的诱导。小麦BBI基因wali3，wali5和wali6的表达受伤害、铝毒的诱导，而另一个小麦BBI基因——WRSI5的表达受盐胁迫、铝毒和PEG胁迫的诱导，且在拟南芥转基因超表达WRSI5基因会提高转基因拟南芥的耐盐性。
在我们的前期研究中，我们一直致力于分离水稻中应答重金属镉胁迫及参与调控镉积累的水稻基因。我们通过构建水稻幼苗cDNA的酵母表达文库，通将该文库质粒转化于酵母对镉敏感的突变株Δycf1，获得了能够提高酵母镉耐受性的水稻cDNA克隆OsBBTI4(Bowman-Birktrypsininhibitor4)。然而，即使知道OsBBTI4基因镉耐受性，因其是两种机制，并不能推知OsBBTI4基因对水稻镉积累的作用。在本发明中，我们描述了该基因的表达能够影响重金属镉在生物体内的积累，提供了将该基因应用于重要粮食作物——水稻的低镉遗传育种技术，本发明也可应用于工程菌——酿酒酵母的低镉遗传改造。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种水稻蛋白酶抑制剂OsBBTI4及其编码基因OsBBTI4的新应用。
实现上述目的的技术方案如下。
氨基酸序列如SEQIDNO.2的水稻蛋白酶抑制剂OsBBTI4和/或OsBBTI4基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，所述OsBBTI4基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。
本发明的水稻胰蛋白酶抑制剂OsBBTI4，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码基因OsBBTI4的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。
本发明的另一目的是提供一种OsBBTI4的水稻超表达载体，该表达载体克隆有上述水稻OsBBTI4基因，能够使OsBBTI4在水稻体内超量表达，并使水稻降低转基因种子中的重金属镉的含量。
实现上述目的的技术方案如下。
水稻超表达载体核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的水稻超表达载体。
优选地，所述超表达载体为pCU1301，基因插入位点为BamHI。
本发明的另一目的是提供上述水稻超表达载体的制备方法。
实现该目的的技术方案如下。
一种上述水稻超表达载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4为引物，进行扩增，回收扩增产物；
(2)对水稻转基因超表达载体pCU1301进行BamHI酶切处理，回收线性化pCU1301载体；
(3)将扩增产物与线性化的pCU1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒OsBBTI4-pCU1301，即得。
本发明的另一目的是提供上述水稻超表达载体的应用。
上述水稻超表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。
本发明的另一目的是提供一种RNAi表达载体，该表达载体克隆有上述针对水稻胰蛋白酶抑制剂基因OsBBTI4的RNA干涉片段。
实现该目的的技术方案如下。
插入有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的RNAi表达载体。
优选地，所述表达载体为pTCK303。
本发明的另一目的是提供上述RNAi表达载体的制备方法。
实现该目的的技术方案如下。
RNAi表达载体的制备方法，包括有以下步骤：
(1)以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6为引物，进行扩增，回收扩增产物；
(2)将扩增产物连接于pGEMT-Vector上形成pGEMT-BBTI4RI；
(3)用SacI和SpeI双酶切pGEMT-BBTI4RI，回收得到片段F1，同时用SacI和SpeI双酶切载体pTCK303，将回收后的F1片段与经SacI和SpeI双酶切处理后的pTCK303载体连接，形成pTCK303-BBTI4RI-F1；
(4)用BamHI和KpnI双酶切pGEMT-BBTI4RI并回收得到片段F2，然后将片段F2与BamHI和KpnI双酶切处理后pTCK303-BBTI4RI-F1载体连接，即得。
本发明的另一目的是提供上述RNAi表达载体的应用。
上述RNAi表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。
本发明的另一目的是提供一种降低稻米中重金属镉积累的生物制剂。
实现上述目的的技术方案如下。
一种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂，其活性成份为上述的水稻超表达载体和/或RNAi表达载体，或含有OsBBTI4基因。
上述的OsBBTI4基因、水稻超表达载体和/或RNAi表达载体，可以制备成生物制剂，用于降低水稻中重金属镉积累，用于水稻的低镉遗传育种。
在前期的研究中，我们通过构建水稻幼苗cDNA的酵母表达文库，通将该文库质粒转化于酵母对镉敏感的突变株Δycf1，获得了能够提高酵母对镉耐受性的水稻cDNA克隆OsBBTI4(Bowman-Birktrypsininhibitor4)。由于酵母是单细胞生物，酵母对镉的耐受可以分为两种情况：(1)通过解除重金属镉胁迫产生的富裕活性氧，间接地降低镉对酵母细胞氧化胁迫的伤害，从而提高酵母的活力；或通过螯合酵母细胞质中游离的毒性镉离子，直接地降低活性镉离子对酵母细胞的毒害。如一些抗氧化蛋白谷胱甘肽转移酶GST和金属离子结合蛋白如金属硫蛋白MT等，即通过上述方式提高酵母细胞对镉的耐受性。(2)通过直接介导镉离子的外排，降低细胞内镉离子的积累，从而降低镉对酵母细胞的伤害。如金属离子转运蛋白(金属耐受蛋白MTP等)。由此可见，酵母对镉的耐受与调控镉在酵母或其他细胞中的积累并不完全相关。而本发明的发明人却发现，公开的OsBBTI4蛋白则通过介导重金属镉离子的外排从而调控镉的积累，并构建了水稻超表达载体和RNAi表达载体，从而真正实现将OsBBTI4基因应用于降低水稻中的镉积累。
本发明的有益效果如下：(1)OsBBTI4基因在酿酒酵母中的超量表达能够降低酵母细胞对重金属镉的积累，促进酵母体内镉的外排；(2)OsBBTI4基因在水稻植株中的超量表达或下调表达能够影响水稻种子对重金属镉的积累发生变化。本发明沟通构建插入有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的水稻超表达载体和RNAi表达载体，应用到水稻中，发现转基因水稻种子中的重金属镉含量明显低于野生型对照的种子，表明对OsBBTI4基因的表达调控能够降低水稻种子对重金属镉的富集量，从而证实本发明的OsBBTI4基因是影响水稻镉积累的关键基因，可以调控水稻植株对镉的吸收和转运，该基因的表达能够调控水稻对重金属镉的积累方式，从而实现了将OsBBTI4基因应用于降低水稻中的镉积累。
附图说明
图1示构建完成的酿酒酵母重组表达载体OsBBTI4-pYES2示意图。
图2示转化OsBBTI4-pYES2的转基因酵母在含镉培养基中生长后镉积累降低。
图3示构建完成的水稻转基因超表达重组载体OsBBTI4-pCU1301示意图。
图4示构建完成的水稻转基因RNA干涉载体OsBBTI4-pTCK303示意图。
图5示水稻OsBBTI4转基因超表达和RNAi植株的qRT-PCR检测。
图6示野生型水稻种子和OsBBTI4转基因超表达及RNAi水稻种子中镉含量的比较。
具体实施方式
本发明以前期构建的水稻幼苗的cDNA表达文库在酵母中的筛选结果为基础(该成果已发表，不在本专利保护范围之内)，获得了能够提高酵母对镉的耐受性的水稻cDNA，通过测序分析，该基因编码一个水稻胰蛋白酶抑制剂基因，该基因在水稻基因组数据库(MSURiceGenomeAnnotationProjectDatabaseandResource,http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中的编号为LOC_Os01g03340，命名为OsBBTI4(OryzasativaBowman-Birktrypsininhibitor4)。该基因不含内含子，编码一个包含756个核苷酸的开放阅读框，其序列如SEQIDNO.1所示。其编码蛋白具有251个氨基酸残基，其序列如SEQIDNO.2所示。
本发明以水稻幼苗叶片为材料，提取其基因组DNA，由于该基因没有内含子，可用基因组DNA为模板扩增该基因的阅读框全长。
用于构建水稻转基因超表达载体为pCU1301，该载体来源于pCAMBIA1301。基因插入位点为BamHI，在玉米泛素启动子调控下超量表达。用于构建OsBBTI4转基因超表达载体的引物为OsBBTI4OEF:5’-CGGGATCCATGAGCAACACCACCATGGC-3’和OsBBTI4OER:5’-CGGGATCCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3’，该对引物携带有BamHI酶切位点，并与水稻转基因超表达载体为pCU1301的BamHI酶切位点上下游各有15个碱基的重叠，以水稻基因组DNA为模板PCR扩增片段后，回收该片段。将水稻转基因超表达载体pCU1301进行BamHI酶切处理，回收线性化质粒。采用In-fusion技术将回收的DNA片段和线性化的pCU1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒OsBBTI4-pCU1301，测序。
用于构建水稻转基因RNA干涉载体为pTCK303，该载体同样改造于pCAMBIA1301。以水稻基因组DNA为模板进行PCR扩增。设计引物为OsBBTI4RIF:5’-GGGGTACCACTAGTATGAGCAACACCACCATGGC-3’和OsBBTI4RIR:5’-CGGGATCCGAGCTCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3’，扩增获得OsBBTI4的基因阅读框片段。将该片段连接于pGEMT-Vector上，经限制性酶切处理，分别正反向连接于表达载体pTCK303的酶切位点SacⅠ与SpeⅠ之间，和酶切位点KpnⅠ与BamHⅠ之间，由此而构建干涉载体OsBBTI4-pTCK303。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干涉载体导入正常粳稻品种中花11。经RT-PCR鉴定OsBBTI4基因的转录受到超量表达或抑制之后植株为阳性植株，将其播种于大田，获得纯合株系。将野生型水稻和转基因基因OsBBTI4超量表达和RNAi的水稻经一定浓度的重金属胁迫处理，完成一个生长周期之后，采用原子吸收光谱的方法测量水稻种子和其他组织中的重金属镉含量。结果发现，转基因水稻种子中的重金属镉含量明显低于野生型对照的种子，表明对OsBBTI4基因的表达调控能够降低水稻种子对重金属镉的富集量，从而证实本发明的OsBBTI4基因是影响水稻镉积累的关键基因，可以调控水稻植株对镉的吸收和转运，该基因的表达能够调控水稻对重金属镉的积累方式。
SEQIDNO.1
cDNA和基因组DNA序列
>OsBBTI4
ATGAGCAACACCACCATGGCTATTTCCACCATCCTTCTCTTCCTCCTCGCCGGCCTCGTCGCCGCCCACGGCGACGGCGACACCATGATCCGTCTCCCAAGCGACGGCGCCGAAGCACCACCACGCCCGCCCAAACCCTGGGACTGCTGCGACAACATCGAGATGTCCCCGCTCGAGATCTTCCCGCCGCTGTACCGCTGCAACGACGAGGTGAAGCAGTGCTCCGCCGCCTGCAAGGAGTGCGTGGAGGCGCCCGGCGACTTCCCCCGCGGCGCCTTCGTGTGCCGCGACTGGTACTCGACGGTGGACCCGGGCCACATGTGCACGGCGCCGGATCAGCCGACGACGAAGAGGCCGTGGAAGTGCTGTGACAGCATCGTGCAGCTGCCGCAGAGGATCTTCCCGCCGTTCTGGCGCTGCGACGACGAGCTGGAGCCCGGCAAGTGCACCGCCGCGTGCAAGTCGTGCAGGGAGGCGCCGGGGCCGTTCCCGGGGCCGCTCATCTGCGAGGACGTCTACTGGGGCGCCGACCCGGGCCCCTTGTGCACGCCGCGGCCATGGGGGAAATGCTGCGACAAGGCCTTCTGCAACAAGATGAACCCGCCGACCTGCCGCTGCATGGACGAGGTGAACAAGTGCGCCGCCGCGTGCAAGGATTGCCAGCGTGTGGAGTCGTCAGAGCCGCCTCGCTACGTCTGCAAGGACCGCTTCACCGGCCAGCCCGGGCCCATGTGCAAACCCCGAGCGGAGAACTAG
SEQIDNO.2
氨基酸序列
>OsBBTI4protein
MSNTTMAISTILLFLLAGLVAAHGDGDTMIRLPSDGAEAPPRPPKPWDCCDNIEMSPLEIFPPLYRCNDEVKQCSAACKECVEAPGDFPRGAFVCRDWYSTVDPGHMCTAPDQPTTKRPWKCCDSIVQLPQRIFPPFWRCDDELEPGKCTAACKSCREAPGPFPGPLICEDVYWGADPGPLCTPRPWGKCCDKAFCNKMNPPTCRCMDEVNKCAAACKDCQRVESSEPPRYVCKDRFTGQPGPMCKPRAEN
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1：OsBBTI4基因在酿酒酵母中的表达降低酵母体内镉的积累
按照常规方法，构建酿酒酵母重组表达载体OsBBTI4-pYES2，如图1所示。
培养酿酒酵母菌株Δycf1(购自欧洲酵母研究中心Euroscarf,http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/,菌株编号Y04069)，用pYES2质粒和重组的OsBBTI4-pYES2对上述酵母进行转化。由于OsBBTI基因是置于酵母半乳糖诱导的启动子PGAL1调控之下(见图1所示)，将OsBBTI4-pYES2转化酿酒酵母并置于添加半乳糖的生长选择合成培养基(SelectiveGrowthSyntheticMedium,SDmedium)上生长，即可诱导OsBBTI4在酵母中异源超量表达。
酵母转化采用的方法为醋酸锂转化法，具体步骤如下：
1)接种待转化的酵母菌株Δycf1的单菌落于5mLYPD液体培养基中，于30℃恒温摇床(200rpm)，培养过夜达到饱和。
2)按照1:100比例转移上述培养物到20mLYPD液体培养基中于30℃恒温摇床(200rpm)继续培养，摇3-5h至菌液OD600值达0.4-0.6.
3)培养液在室温条件下4000g离心5min，收集细胞。细胞用10mL无菌超纯水重悬，再于室温下5000-6000g离心5min，沉淀细胞。
4)细胞用2mL锂盐溶液重悬，锂盐溶液按照下表配制(现配现用)：
5)将2μL待转化质粒和10μL变性鲑鱼精一起加入1.5mL离心管中混匀。
6)往每个离心管中加入200μL用锂盐溶液重悬的细胞悬液，再加入1mL新鲜配制的PEG溶液。PEG溶液的配方为：
30℃摇荡温育30min。
7)于42℃热激15min，室温下离心5s，细胞沉淀用200μL-1mL1×TE缓冲液(从10×储液新鲜配制)重悬，并取其中200μL涂布在添加了半乳糖的SD固体培养基平板上。30℃培养2-5天，直到出现转化子。
在超净台中用无菌牙签挑取两种酵母转化子(转化pYES2和OsBBTI-pYES2)到2mL添加了半乳糖的生长选择合成培养基(SelectiveGrowthSyntheticMedium,SDmedium)液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD600值达2。之后将两种酵母按照1：500的体积比接种于600ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30℃摇床(200-250rpm)培养12-24小时至OD600值达2，之后分别添加CdCl2至终浓度10μM和30μM。继续培养24小时后离心收集菌体。采用双蒸水清洗菌体3遍后，将菌体65℃干燥3-5天，干燥的酵母块进行微波消解后，采用火焰法原子吸收光谱测定酵母细胞中镉的积累。
在本发明中，转化OsBBTI4-pYES2的酵母菌株在添加有10μM和30μM的CdCl2的培养基中，体内积累的镉均显著低于转化pYES2空载体的酵母菌株(见图2所示)，这表明OsBBTI4基因在酵母体内的表达降低了酵母细胞对重金属镉的富集，OsBBTI4蛋白能够促进酵母体内镉的外排。
实施例2：OsBBTI4基因的转基因超表达载体和RNAi载体的构建及水稻遗传转化
取100ng的水稻基因组DNA为模板，采用引物OsBBTI4OEF:5’-CGGGATCCATGAGCAACACCACCATGGC-3’和OsBBTI4OER:5’-CGGGATCCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3’(SEQIDNO.3和SEQIDNO.4)扩增用于构建OsBBTI4基因转基因超表达载体的片段；采用引物OsBBTI4RIF:5’-GGGGTACCACTAGTATGAGCAACACCACCATGGC-3’和OsBBTI4RIR:5’-CGGGATCCGAGCTCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3’(SEQIDNO.5和SEQIDNO.6)扩增用于构建OsBBTI4基因转基因RNAi载体的片段。本发明所用的水稻转基因超表达载体为pCU1301[ChenR,ZhaoX,ShaoZ,WeiZ,WangY,ZhuL,ZhaoJ,SunM,HeR,HeG(2007)RiceUDP-glucosepyrophosphorylase1isessentialforpollencallosedepositionanditscosuppressionresultsinanewtypeofthermosensitivegenicmalesterility.PlantCell19(3):847–861]，并在此基础上构建OsBBTI4基因的水稻转基因超表达载体OsBBTI4-pCU1301(见图3所示)。
本发明所用的转基因RNAi载体是pTCK303[WangZ,ChenC,XuY,JiangR,HanY,XuZ,ChongK(2004).APracticalVectorforEfficientKnockdownofGeneExpressioninRice(OryzasativaL.).PlantMolecualrBiologyReporter22:409-417]，并在此基础上构建OsBBTI4基因的水稻转基因RNAi载体OsBBTI4-pTCK303(见图4所示)。
构建水稻转基因超表达载体OsBBTI4-pCU1301仍采用TaKaRa(Clontech)公司的HDCloningKit进行DNA片段和载体的同源重组连接，包括以下步骤：
(1)以水稻基因组DNA为模板，以OsBBTI4OEF:
5’-CGGGATCCATGAGCAACACCACCATGGC-3’和OsBBTI4OER:
5’-CGGGATCCCTAGTTCTCCGCTCGGGGTT-3’为引物，PCR扩增，回收扩增产物；
(2)对水稻转基因超表达载体pCU1301进行BamHI酶切处理，回收线性化pCU1301载体；
(3)将扩增产物与线性化的pCU1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒OsBBTI4-pCU1301，鉴定，即得。
构建RNAi载体OsBBTI4-pTCK303则采用限制性内切酶酶切及连接的方式，该载体的构建步骤如下：采用引物对OsBBTI4RIF和OsBBTI4RIR，PCR扩增用于构建RNAi载体的OsBBTI4基因片段，采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，将该片段连接于pGEMT-Vector上形成pGEMT-BBTI4RI，经测序分析，插入的OsBBTI4为阅读框全长，序列正确，SEQIDNO.1所示。用SacI和SpeI双酶切pGEMT-BBTI4RI，回收750bp片段F1，同时用SacI和SpeI双酶切载体pTCK303，将回收后的F1片段与经SacI和SpeI双酶切处理后的pTCK303载体连接，形成pTCK303-BBTI4RI-F1，经测序正确后，用BamHI和KpnI双酶切处理pTCK303-BBTI4RI-F1载体。同时用BamHI和KpnI双酶切pGEMT-BBTI4RI并回收750bp片段F2，然后将F2片段与BamHI和KpnI双酶切处理pTCK303-BBTI4RI-F1载体连接，经测序鉴定正确后，形成OsBBTI4-pTCK303转基因RNAi载体。该转基因RNAi载体OsBBTI4-pTCK303如图4所示。该转基因干涉载体是将如SEQIDNO.1所示的序列，分别正反向插入表达载体pTCK303的酶切位点SacI与SpeI之间，和酶切位点KpnI与BamHI之间，在宿主细胞中，该转基因干涉载体在MaizeUbilpro启动子的启动下，正、反向插入序列转录，并互补形成dsRNA，而对OsBBTI4基因进行干扰。
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA，1994，PlantJournal6：271-282)将转基因超表达载体OsBBTI4-pCU1301和RNAi载体OsBBTI4-pTCK303导入正常粳稻中花11水稻品种，通过GUS染色检测，染色为蓝色的则为转基因阳性植株。在本发明中，我们采用qRT-PCR检测了3株转基因超表达株系和3株转基因RNAi株系，经田间播种后，获得纯合株系。
在本发明中，qRT-PCR主要为了检测转基因水稻株系中OsBBTI4的表达变化。主要实施步骤如下：1)待到水稻开花期分别收集成熟叶片，RNA的提取依照Magen公司HiPurePlantRNAKits(R4151)的说明书进行；
2)cDNA链的合成依照全式金公司TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix的说明书进行；
3)通过网站QuantPrime(http://www.quantprime.de/)在线设计qRT-PCR引物。水稻内参基因OsUBQ5引物为OsUBQ5F:5’-CGCCGTGCTCCAGTTCTA-3’和OsUBQ5R:5’-CGATTTCCTCCTCCTTCCTT-3(SEQIDNO.7和SEQIDNO.8)。OsBBTI4的引物为BBTI4qRTF：5’-TTGTCCCTGTTCGCTTGTGTGG-3’和BBTI4qRTR：5’-ACATGGGTGCATGCTTGCGTTG-3’(SEQIDNO.9和SEQIDNO.10)。4)参考BIO-RAD公司iTaqTNUniversalSYBRGreenSupermix的说明书配制qRT-PCR反应体系，采用两步法进行PCR检测。所有检测均采用两个生物学样本重复，每个生物学样本进行三次重复检测反应。引物第一次使用时添加程序Stage3检测溶解曲线，确认引物的特异性。qRT-PCR检测转基因水稻株系中OsBBTI4的表达情况如图5所示。在3个OsBBTI4转基因超表达株系(OsBBTI4OX18,OsBBTI4OX21,OsBBTI4OX22)中，与对照(野生型WT水稻)相比，OsBBTI4的表达量分别达到6倍，2倍和7倍，表明OsBBTI4转基因超表达效果很好。同样，在3个OsBBTI4转基因RNAi株系(OsBBTI4RI1,OsBBTI4RI2,OsBBTI4RI5)中，与对照(野生型WT水稻)相比，OsBBTI4的表达量被大大降低了，表明OsBBTI4转基因RNAi效果很好。
实施例3：采用原子吸收光谱法测定转基因水稻种子中的重金属镉含量
将上述纯合株系的种子播种到直径9cm培养皿中37℃萌发，7d后将幼苗分别移至营养液(对照)和附加0.01mM的Cd的营养液中栽培生长。营养液组成为：母液1：91.4gNH4NO3，32.4gMgSO4·7H2O，加水定容至1L；母液2：88.6gCaCl2，加水定容至1L；母液3：40.3gNaH2PO4，71.4gK2SO4，加水定容至1L；母液4：0.943gH3BO4，1.5gMnCl2·4H2O，0.074g(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.031gCuSO4·5H2O，0.035gZnSO4·7H2O，加水定容至1L；母液5：6.9gFeSO4·7H2O，9.3gNa2EDTA·2H2O，加水定容至0.5L。使用时，每4L营养液加1-5号母液各5mL，余量为水。为使水稻生长健壮，可另加偏硅酸钠50-100ppm，调节pH至5-5.1。待水稻生长至完熟期后，将水稻从营养液中移出，用流水洗净根部营养液后再用蒸馏水冲洗两次。水稻根、茎叶和种子分别收获，115℃高温杀青15min，65℃烘箱中烘至恒重。万能粉碎机将种子磨碎，储存。称取约0.3g水稻种子材料于玻璃瓶中，HNO3:H2O2＝4:1(体积比)的溶液浸泡过夜，密封玻璃瓶，80℃水浴加热至消解液澄清，打开玻璃瓶盖，100℃挥酸，再用原子吸收分光光度计(型号：GBC932AA)测定不同样本中重金属Cd离子的含量。以野生型水稻作为对照。
结果如图6显示，从图6中可以看出OsBBTI4基因的3个转基因超表达(OsBBTI4OX18,OsBBTI4OX21,OsBBTI4OX22)和3个转基因RNAi(OsBBTI4RI1,OsBBTI4RI2,OsBBTI4RI5)株系中种子的Cd含量均低于水稻野生型植株(WT)，由此表明，本发明的OsBBTI4基因是调控稻米镉含量的关键基因，伴随基因OsBBTI4表达量的变化，水稻种子对重金属镉的富集量也有改变。该基因可应用于水稻的低镉遗传育种，也可应用于其他植物中针对体内重金属镉含量的基因工程育种。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.氨基酸序列如SEQIDNO.2的水稻蛋白酶抑制剂OsBBTI4和/或OsBBTI4基因在水稻中降低重金属镉积累的应用，所述OsBBTI4基因的cDNA为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或为与SEQIDNO.1互补配对的核苷酸序列，或为编码序列氨基酸序列如SEQIDNO.2的核苷酸序列。
2.插入有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的水稻超表达载体。
3.根据权利要求2所述的水稻超表达载体，其特征是，所述超表达载体为pCU1301，基因插入位点为BamHI。
4.权利要求2所述的水稻超表达载体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.3和SEQIDNO.4为引物，进行扩增，回收扩增产物；
(2)对水稻转基因超表达载体pCU1301进行BamHI酶切处理，回收线性化pCU1301载体；
(3)将扩增产物与线性化的pCU1301载体连接，鉴定阳性克隆并提取质粒OsBBTI4-pCU1301，即得。
5.权利要求2所述水稻超表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。
6.插入有核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的OsBBTI4基因的RNAi表达载体。
7.根据权利要求6所述的RNAi表达载体，其特征是，所述表达载体为pTCK303。
8.权利要求6所述的RNAi表达载体的制备方法，其特征是，包括有以下步骤：
(1)以水稻基因组DNA为模板，以SEQIDNO.5和SEQIDNO.6为引物，进行扩增，回收扩增产物；
(2)将扩增产物连接于pGEMT-Vector上形成pGEMT-BBTI4RI；
(3)用SacI和SpeI双酶切pGEMT-BBTI4RI，回收得到片段F1，同时用SacI和SpeI双酶切载体pTCK303，将回收后的F1片段与经SacI和SpeI双酶切处理后的pTCK303载体连接，形成pTCK303-BBTI4RI-F1；
(4)用BamHI和KpnI双酶切pGEMT-BBTI4RI并回收得到片段F2，然后将片段F2与BamHI和KpnI双酶切处理后pTCK303-BBTI4RI-F1载体连接，即得。
9.权利要求6所述的RNAi表达载体在水稻中降低重金属镉积累的应用。
10.一种降低水稻中重金属镉积累的生物制剂，其特征在于，其活性成份包括有权利要求2所述的水稻超表达载体和/或权利要求6所述的RNAi表达载体。
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