CN107828794A - 一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法 - Google Patents

一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列及该突变体的创制方法。属于植物生物技术领域。本发明将自选育粳稻品种WDR58通过CRISPR/Cas9技术定点编辑了水稻耐盐基因OsRR22，获得了一个具有重要应用价值的水稻耐盐基因OsRR22功能缺失突变体新种质WDR58‑cas‑1。该突变体显著提高水稻的耐盐性，可以应用于水稻的高产、耐盐育种。

Description

一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株 及该突变体的创制方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa L．)是全球三大主要粮食作物之一，是全球22亿人口包含我国65％以上人口的口粮。水稻产量是否供给充足直接影响全球粮食安全。水稻生产面临着各种非生物胁迫，例如：干旱、盐害、冷害、高温等。水稻非生物胁迫成为21世纪农业面临的重要问题之一。
水稻是对盐害极其敏感的作物，盐害已经成为影响水稻生长的主要非生物胁迫因素。目前，全世界6％以上的陆地表现出盐碱化；可耕地中19.5％的水田和2.1％的旱地受到不同程度的盐害。水田盐害主要是人类不当灌溉引起的次级盐害，我国水田的15％受到次级盐害的影响。在这些土地贫瘠产出量低的盐渍化地区，培育耐盐作物显得尤为重要。截至目前，已经克隆的耐盐相关的基因有：SKC1, DST, OsRR22,HAL2, P5CS, CMO, BADH,mtlD, gutD和SAMDC等。其中，OsRR22是调控水稻耐盐性的最重要基因之一。OsRR22基因编码一个696个氨基酸的B型反应调节蛋白转录因子，参与细胞分裂素信号转导和代谢，它的功能缺失显著提高了耐盐性。
CRISPR/Cas9系统是近几年发展的一种准确、便捷、高效率的生物基因组编辑方法。CRISPR/Cas9 的原理是crRNA（CRISPR RNA）通过碱基配对与tracrRNA（transactivating CRISPR RNA）结合形成 tracrRNA/crRNA双元复合体，此复合体引导内切酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。通过人工设计改造这两种RNA，可以形成单个具有引导作用的sgRNA（single-guide RNA），足以引导Cas9 核酸酶对DNA 进行定点切割。它可以对任何靶位点后紧随NGG（PAM）的20bp序列进行定点编辑。目前，CRISPR/Cas9系统不但在酵母、果蝇、鼠、人等生物中，而且已成功在拟南芥、烟草、水稻、小麦、高粱等植物中实现了定点基因组编辑。但是，对水稻育种中有重要价值的产量、抗性、育性等关键基因的定点编辑研究鲜有报道，更缺乏对优良水稻优良亲本进行基因编辑改良的报告。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种提高了耐盐性并保持了其自身优良综合农艺性状的水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（一）是：一种水稻耐盐基因OsRR22突变体，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（二）是：一种水稻耐盐基因OsRR22突变体编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（三）是：一种水稻耐盐基因OsRR22突变体的创制方法，包括以下步骤：
S1、引导RNA靶点序列设计与选择：根据控制水稻耐盐基因OsRR22的基因组序列和CRISPR-Cas9技术的设计靶位点的原则，设计、选择并合成1个OsRR22引导RNA靶点序列；
S2、CRISPR/Cas9-gRNA载体的构建：将步骤S1中合成的引导RNA靶点序列退火形成双链，与BsaI酶切后的pYLgRNA-OsU3/LacZ连接得到gRNA表达盒，然后通过Golden gatecloning方法将gRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到CRISPR/Cas9-gRNA载体；
S3、农杆菌介导水稻愈伤遗传转化：将步骤S2构建好的CRISPR/Cas9-gRNA载体转化到水稻品种WDR58中，获得了不含有CRISPR元件T-DNA成分的纯合OsRR22基因突变体。
进一步的，在所述步骤S1中，靶位点设计在OsRR22基因的第一个外显子上；
所述步骤S1中，所述的OsRR22引导RNA靶点序列的寡核苷酸序列为：
RR22-F:5’-ggcAGAGGGATCAATTCCCCGT-3’
RR22-R:5’-aaacACGGGGAATTGATCCCTCT-3’。
进一步的，在步骤S2中，所述Golden gate cloning方法中用到的引物为：
U3-F: 5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’
U3-R: 5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’。
进一步的，所述水稻品种WDR58为秀水123///秀水123//秀水123/75-1-127，即将75-1-127与秀水123杂交，再将其后代与秀水123回交两次再自交五代所得的稳定品系。
本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（四）是：一种水稻耐盐基因Osrr22突变体植株，上述的靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，并转化得到的转基因植株。
本发明的有益效果是：
本发明较现有水稻育种技术具有以下优点：
1、本发明通过设计特定的位点，利用CRISPR/Cas9技术定点编辑耐盐基因OsRR22，改良现有优良水稻品系的单个基因位点，获得了一个具有应用价值的水稻耐盐基因OsRR22突变体。这个突变体显著提高了耐盐性并保持了其自身优良综合农艺性状，可以直接应用于水稻的耐盐育种。
2、本发明创制的突变体获得方法的成功实施，为将来不同水稻品种进行不同基因（fgr、wx等基因）突变体的创制提供了重要参考价值，为水稻育种提供了一种新的技术手段。
附图说明
下面结合附图对本发明的水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列及该突变体的创制方法作进一步说明。
图1是OsRR22基因靶点序列引物设计示意图；
图2是OsRR22突变体的测序分析图；
图3是OsRR22纯合突变体的耐盐性表型鉴定图。
具体实施方式
实施例
本实施例涉及到水稻OsRR22基因敲除突变体的获得，即创制方法。
1、引导RNA靶点序列设计与选择
根据控制水稻耐盐基因OsRR22的基因组序列和CRISPR-Cas9技术的设计靶位点的原则，本发明把靶位点设计在OsRR22基因的第一个外显子上，设计、选择并合成1个OsRR22引导RNA靶点序列，见图1和表1。
表1 gRNA靶点的寡核苷酸序列
gRNA靶点序列 寡核苷酸序列（5’-3’）
RR22-F ggcAGAGGGATCAATTCCCCGT
RR22-R aaacACGGGGAATTGATCCCTCT
2、CRISPR/Cas9-gRNA载体的构建
参考Ma等人的方法（Ma et al., 2015, Molecular Plant, DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）, 取等量靶点gRNA寡核苷酸链的上下游引物（表1）混合(终浓度1 µmol /L)，95℃处理30 s，然后移至室温冷却完成退火形成双链接头；取pYLgRNA-OsU3/LacZ等质粒各1 μg，在25 μl反应用10 U Bsa I酶（NEB公司）切20min；然后将酶切后的pYLgRNA-OsU3/LacZ质粒与对应的双链接头利用T4 DNA ligase 22℃连接30min后得到gRNA表达盒，具体连接体系为：
成分 加入量 终浓度(量)
10×T4 DNA ligase Buffer 1 μl 1×
pYLgRNA-OsU3/LacZ质粒 0.5 μl 10~20 ng
接头 0.5μl 0.05 μM
T4 DNA ligase(Takara) 0.05 μl ~18 U
ddH2O 补足到 10 μl
然后用表2中所列引物对gRNA表达盒进行扩增，采用Golden Gate cloning (Engleret al., 2008; 2009)方法组装Cas9载体和gRNA表达盒片段。
表2扩增靶点gRNA表达盒的引物
名称 寡核苷酸序列（5’-3’）
U3-F TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG
U3-R AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC
扩增体系为1ul质粒模板，2.5 uL 10×Buffer，0.5 uL KOD plus聚合酶，1ul 25mM的MgSO4，2.5 uL 2mM的dNTPs，10 uM的上下游引物各0.5 uL，补充dd H2O至25 uL ；PCR扩增程序为：95℃ 2min，98 ℃ 10s，60℃ 15s ，68 ℃ 20 s 20个循环。
PCR产物纯化后用20 U Bsa I酶在37℃酶切30 min，然后75℃处理5 min；将酶切片段纯化后与Bsa I酶切回收的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体片段利用T4 DNA ligase(NEB) 20℃连接2 h，连接体系为：
ddH2O Up to 10 μl
10 × T4 DNA ligase Buffer 1 μl
Bsa I酶切后pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体 4 μl
靶点gRNA表达盒扩增产物 3 μl
T4 DNA ligase 1 μl
最后连接产物转化DH5α感受态细胞并挑取阳性克隆测序验证得到靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体。
3、农杆菌介导水稻愈伤遗传转化
将步骤2构建好的CRISPR/Cas9-gRNA载体通过农杆菌介导的方法侵染水稻材料WDR58的愈伤组织，具体方法参考于恒秀等（2005）进行，获得转基因水稻植株。
4、转基因水稻的DNA提取及突变体的测序分析
采用CTAB法提取步骤3中获得的水稻植株的基因组DNA，对潮霉素基因检测为阳性的植株利用引物Cas9-cexu F和Cas9-cexu R对OsRR22突变位点进行PCR扩增。其中鉴定引物为：
Cas9-cexu F：5’- AGAGGAAGGGATTGATGGG-3’
Cas9-cexu R：5’- CATGTCCCTGTTCTCCCTGA-3’
PCR扩增体系为： 20ng水稻基因组DNA模板，10 uL Taq PCR Mastermix（天根生化科技(北京)有限公司），10 uM的前后引物各1 uL，补充dd H2O至20 uL。反应程序为： 95℃预变性5 min，然后按95℃ 30 s，58℃下 30 s，72℃下 45 s进行30个循环，最后72℃下延伸 5min。
对PCR扩增产物进行的测序结果分析表明，OsRR22突变频率91.6%，其中25%为纯合突变，见图2。
5、无转基因成分OsRR22突变体的获得及耐盐性表型调查
将纯合突变体T1代转基因植株播种成苗，苗期检测潮霉素基因的有无，保留不含有潮霉素基因而含有OsRR22基因纯合突变位点的个体。水稻苗三叶一心期，放入0.75%氯化钠浓度的培养液中下处理7天后，进行耐盐性筛选（图3）。获得耐盐性比对照提高的株系，命名为WDR58-cas-1。
其中，耐盐突变体WDR58-cas-1，耐盐基因OsRR22的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
耐盐突变体WDR58-cas-1，耐盐基因OsRR22的核苷酸序列见SEQ ID NO:1 所示。
本发明的不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。
<110>上海市农业生物基因中心
<120>一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法
<160> 2
<210> 1
<211> 2092
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
atgcttctgg gtgctttgag gatggaggag aggaagggat tgatggggag ggagagggat 60
caattcccac gtcggcatgc gggtcctcgc cgtcgacgat gacccggtgt gcctcaaggt 120
tcttgagacc ctcctccggc gctgccaata ccatgtaaca tcaaccaacc aggctattac 180
tgcgttgaag ctgctcaggg agaacaggga catgtttgat cttgtcatca gtgatgtcca 240
catgcccgac atggacggat ttaagctcct tgagcttgtg gggcttgaaa tggatctccc 300
agtcatcatg ttatcagtaa atggagagac aaagactgtg atgaagggga taactcatgg 360
tgcctgtgac tatcttctaa aaccggtccg aatcgaagaa ctaaggaaca tatggcagca 420
tgttgttagg aggaagttcg gtaatcgtga gcgaaacaat cttgatttct ccaaagaatg 480
caataagccg caaagcgcgg atactgatca tggaccatac caacctacct gtggttcttc 540
tgatcaaaat gggaggtcca gcaggaaaag gaaagaacta cacggcgagg acgacgatga 600
aggcgatgat aatgattatc aagaaaatga tgagccctca gctgcaaaga agcccagagt 660
tgtatggtca gttgagctgc accgaaaatt tgttgccgct gtcaaccagc ttggaattga 720
caaagctgta ccaaaaagaa ttcttgagct tatgaatgtg gagaaactca ccagggaaaa 780
tgttgcaagt catctacaga agtacaggct ttacctcaag agactaggtg ctgtagcatc 840
acaacaagcc agcattgttg ctgcctttgg aggcagagat ccctccttct tgcatattgg 900
agcatttgaa ggactccaga gctatcaacc ttttgcacct tctgctgctc ttccatcttt 960
caatccacat ggcctgctaa cccgaactag cgccgccgcg gctttcggac ttcaggagct 1020
tgctgccccc tccagcacaa ttcagacttc tacaggaaat gtcacagttg gccattgctt 1080
ggaagaaaac cagcaggcaa atctagcaca aggcttgacc gcggcgatcg ggcaacctca 1140
gcttcaacag aactggattc atcaagaagg taatggtctg tctgatgttt tttctgggag 1200
ttctctgacc aacactttgt ccagcacact ccaaagagtt ccaagcagtt cattgccacc 1260
acaagaactc ttggagtgca aacaagccaa agttagcatg ccgccatcga tacggatacc 1320
gccttctagt tcagcacttc ttgagaggac tcttggggtt tccaccaatt tgggagattc 1380
tagtatatcc cagcagggtg ctcttccaat agatggtgga ttttctgctg acaggttacc 1440
attgcacagt tcatttgatg gcgctgttgc aacaaagcta gatactagtt tggcagcttc 1500
acagagagag attggccagc aggggaaatt ttcagttagc atgcttgtct ccccttctga 1560
caatcttgca ttagccaaaa atgccaaaac tggagctagt tcttctggca gtactataat 1620
tctccctctt gatactgcaa gacattcaga ctacttgcag ttcggaggtg caagcaattc 1680
tttgcagaaa atggatggac agaaacaaga tcatatacag agctcaaaca ttatatggag 1740
ttcaatgcca agcactcaac tgccaagtga tacccaaatt cataatactc aaaaccaaag 1800
attggacagc ggaagtttta accataatat tggtgcccat ttggctgacc aaacaaatgc 1860
aagtgcgtca atacttccgc aaatgaagtt tgacacaaga atatcagaag agaaaatgaa 1920
gcagaagaat acatatgact tgggtagttc aaagctgcag ggtggattta attctagtgg 1980
ctgcaatttt gatggccttc tcaattccat aatcaaagtg gagaaggatg atctcccatt 2040
catggacaat gaattgggct gtgacctttt tccacttggt gcctgcatat ga 2092
<210> 2
<211> 33
<212> PRT
<213>人工序列
<400> 2
MLLGALRMEERKGLMGRERDQFPRRHAGPRRRR*

Claims (8)

1.一种水稻耐盐基因OsRR22突变体，其特征在于：其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
2.一种如权利要求1所述水稻耐盐基因OsRR22突变体编码的多肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种如权利要求1所述水稻耐盐基因OsRR22突变体的创制方法，包括以下特征步骤：
S1、引导RNA靶点序列设计与选择：根据控制水稻耐盐基因OsRR22的基因组序列和CRISPR-Cas9技术的设计靶位点的原则，设计、选择并合成1个OsRR22引导RNA靶点序列；
S2、CRISPR/Cas9-gRNA载体的构建：将步骤S1中合成的引导RNA靶点序列退火形成双链，与BsaI酶切后的pYLgRNA-OsU3/LacZ连接，然后通过Golden gate cloning方法将gRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到CRISPR/Cas9-gRNA载体；
S3、农杆菌介导水稻愈伤遗传转化：将步骤S2构建好的CRISPR/Cas9-gRNA载体转化到水稻品种WDR58中，获得了不含有CRISPR元件T-DNA成分的纯合OsRR22基因突变体。
4.根据权利要求3所述水稻耐盐基因OsRR22突变体的创制方法，其特征在于：在所述步骤S1中，靶位点设计在OsRR22基因的第一个外显子上；
所述步骤S1中，所述的OsRR22引导RNA靶点序列的寡核苷酸序列为：
RR22-F:5’-ggcAGAGGGATCAATTCCCCGT-3’
RR22-R:5’-aaacACGGGGAATTGATCCCTCT-3’。
5.根据权利要求3或4所述水稻耐盐基因OsRR22突变体的创制方法，其特征在于：在步骤S2中，所述Golden gate cloning方法中用到的引物为：
U3-F: 5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’
U3-R: 5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’。
6.根据权利要求3或4所述水稻耐盐基因OsRR22突变体的创制方法，其特征在于：所述水稻品种WDR58为秀水123///秀水123//秀水123/75-1-127，即将75-1-127与秀水123杂交，再将其后代与秀水123回交两次再自交五代所得的稳定品系。
7.根据权利要求5所述水稻耐盐基因OsRR22突变体的创制方法，其特征在于：所述水稻品种WDR58为秀水123///秀水123//秀水123/75-1-127，即将75-1-127与秀水123杂交，再将其后代与秀水123回交两次再自交五代所得的稳定品系。
8.一种水稻耐盐基因Osrr22突变体植株，其特征在于：是通过将权利要求3所述的靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，并转化得到的转基因植株。
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