CN111560372A

CN111560372A - 一种恢复水稻OsCYP704B2突变体雄性育性的表达盒、载体及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN111560372A
Application number: CN202010378794.0A
Authority: CN
Inventors: 李新鹏; 陈磊; 李燕群; 陈江淑; 陈思兰; 安保光; 龙湍; 吴永忠; 黄培劲
Original assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Current assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-08-21

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种恢复水稻OsCYP704B2突变体雄性育性的表达盒、载体及其检测方法和应用。本发明提供如SEQ ID NO.1所示的植物花药启动子以及由该启动子驱动的、经序列优化的水稻OsCYP704B2基因表达盒。本发明提供的花药启动子能够驱动基因在植物花药中高效地表达；本发明提供的水稻OsCYP704B2基因表达盒能够实现OsCYP704B2基因在花药启动子的驱动下在花药中高水平表达，完全恢复由OsCYP704B2功能缺失导致的水稻雄性不育，并且具有高度的遗传稳定性，可用于水稻雄性育性的恢复或制备水稻雄性核不育保持系和不育系。

Description

一种恢复水稻OsCYP704B2突变体雄性育性的表达盒、载体及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种恢复水稻 OsCYP704B2突变体雄性育性的表达盒及其检测方法和应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，杂交水稻对提高粮食产量发挥了重要作用。杂交水稻是选用两个遗传背景不同，同时性状又能互补的水稻亲本，通过杂交产生具有杂种优势的第一代杂交种用于稻谷生产。杂交水稻具有明显的杂种优势现象，比常规稻增产可达30％。杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系法杂交稻。三系法杂交稻(三系杂交稻)是指生产这种杂交稻需要三个水稻品系来完成：水稻质核互作雄性不育系、水稻细胞质雄性不育保持系和水稻细胞质雄性不育恢复系。水稻质核互作雄性不育系(简称不育系，代号A)有野败型、红莲型等多种细胞质类型。水稻细胞质雄性不育保持系(简称保持系，代号B) 用来繁殖不育系，其细胞核基因型与不育系相同，但含有可育的细胞质基因，可产生可育花粉，能够自交结实。由于保持系的核基因不含恢复基因，因此它给不育系授粉产生的后代也是不育的。水稻细胞质雄性不育恢复系(简称恢复系，代号R)携带恢复基因，能够修复细胞质雄性不育性，与不育系杂交产生的杂种(即杂交稻)正常可育。三系育种法存在感病、品质差、育种效率低等问题，而且因受恢保关系的制约，95％的水稻资源不能用于杂交育种。两系法杂交稻利用光温敏核不育突变体，其在长日高温条件下表现雄性不育，可进行杂交制种，短日低温条件下表现雄性可育，可以自交繁殖。与三系法相比，两系法具有显著的优越性：不育系与恢复系配组自由，选配优良组合的几率大；不育系可一系两用。但是两系法不育系易受光温环境影响，育种风险巨大：比如在制种期间遇上低温，不育系将转为可育，产生自交种子，影响杂交种子的纯度；有的两系杂交种遇上高温则不育，影响结实率，导致减产。因此，寻找新的雄性不育制种方法依然是作物育种上的重要研究课题。

美国先锋公司的SPT技术利用转基因技术成功解决了玉米杂交制种中的一系列问题，并于2012年在玉米中实现商业化应用。该技术也可应用于其他作物的杂交制种(Wu等，2016，Development of a novel recessive genetic male sterility system forhybrid seed production in maize and other cross-pollinating crops)。SPT技术的核心是筛选雄性不育突变体，及构建含有育性恢复基因、花粉败育基因和筛选标记基因的载体；经过大量的筛选鉴定，获得单拷贝、遗传稳定、各元件稳定可靠工作的转化事件，用于生产新的不育系和转基因保持系。水稻杂交制种也可能通过利用这一技术实现普通核不育系及其保持系的扩繁，从而克服三系法和两系法杂交制种的缺陷，提升水稻杂交育制种技术。

水稻CYP704B2基因(即OsMs26基因)属于P450家族，其编码区含有4个外显子，编码一个544个氨基酸的蛋白(Li等，2010， Cytochrome P450 family member CYP704B2catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anthercutin biosynthesis and pollen exine formation in rice，Plant Cell，vol. 22:173-190)。CYP704B2基因在减数分裂形成小孢子前后，在绒粘层和小孢子特异性表达。CYP704B2蛋白参与脂肪酸代谢，而脂肪酸代谢产物是角质和孢粉素的前体。CYP704B2的缺失突变，使孢粉素合成转运受阻，无法正常形成小孢子外壁，小孢子进一步发育受阻，导致完全雄性不育；此外还造成突变体花药表面角质缺失。Li等将包含有CYP704B2基因的3.8kb基因组片段转入cyp704b2突变体，恢复了该突变体的雄性育性。

然而，作物的育制种工程对于遗传稳定性的要求极高，且需要便于跟踪鉴定。Li等用于恢复育性的DNA片段无法满足这两个要求。主要原因如下：首先，用作物自身的DNA片段转化，连续的同源片段越长，发生同源重组而删除基因的概率就越高；其次，在工程应用中，遗传转化后的植株需要复检和回交转育，这两个过程都需要鉴定突变位点的遗传背景，需要同时区分原基因组野生型、突变体和转化的恢复基因三个基因，而转化片段中恢复基因与野生型基因序列一致。Li 等转化的DNA片段与野生型完全相同，难以设计相应的分子标记同时区分上述三个片段。最后，转化片段越大，转化效率就越低。因此， Li等采用长达3.8kb(不包括侧翼的载体序列)的水稻原基因组序列作为恢复基因片段，在工程化生产应用中出现遗传不稳定性的可能性较高，也增加了载体构建和转化的难度；同时也难以鉴定突变位点的基因型。综上所述，Li等开发的恢复DNA片段和载体不适于工程化育制种技术，亟需开发遗传稳定性更高、更便于构建和转化、且方便突变基因型检测的恢复DNA片段和载体。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种植物花药启动子、恢复水稻OsCYP704B2突变体雄性育性的表达盒、载体及其检测方法和应用。

本发明通过筛选水稻基因组和cDNA文库，得到能够驱动内源或外源基因在水稻花药中高效表达的启动子，其序列如SEQ ID NO.1所示。

首先，本发明提供一种用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子，其具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、插入或缺失得到的具有驱动DNA在植物花药中表达功能的核苷酸序列；

(3)在严格条件下能够与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

本发明中，所述严格条件为本领域公知的核苷酸杂交的严格条件，如：在含400mMNaCl、40mM PIPES(pH6.4)和l mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1× SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

在此基础上，本发明提供所述启动子在驱动内源或外源基因在植物花药中表达的应用。

本发明还提供所述启动子在制备转基因植物中的应用。

本发明中，所述植物为单子叶或双子叶植物，包括但不限于水稻、玉米、高粱、大麦、燕麦、小麦、栗、甘蔗、大豆、棉花、烟草、苜蓿和向日葵等。

在此基础上，本发明提供含有所述用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子的表达盒。

本发明提供的启动子能够驱动任意内源或外源基因在花药中表达，因此，上述表达盒除包含所述花药启动子外，还可以包括任意的内源或外源基因，如：GUS、GFP等荧光蛋白编码基因、植物育性调控基因等，只要利用所述启动子作为基因表达元件的表达盒均在本发明的保护范围内。

OsCYP704B2基因是水稻雄性育性的重要调控基因，本发明提供的启动子能够驱动OsCYP704B2基因在花药中高效表达，而可用于水稻的雄性育性恢复。

作为本发明的一种实施方式，所述表达盒还包括水稻 OsCYP704B2基因或水稻OsCYP704B2基因的突变体，所述水稻 OsCYP704B2基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。

所述水稻OsCYP704B2基因的突变体可以包含导致编码氨基酸序列改变非同义突变或不改变编码氨基酸序列的同义突变；但是，上述非同义突变或同义突变均不应导致OsCYP704B2基因无法表达。

为便于进行水稻OsCYP704B2基因突变体与水稻基因组原位 OsCYP704B2基因的鉴别，在不改变编码氨基酸序列的情况下，分别在水稻OsCYP704B2基因中引入一个HaeIII酶切位点同时/或者消除一个HaeIII酶切位点。

本发明中，所述水稻OsCYP704B2基因的突变体具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第660位A突变为C，和/或，如SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列的第1032位G突变为A的核苷酸序列。

为使得经上述改造的表达盒具有更优的表达效果以更好地实现水稻的育性恢复，所述表达盒除包括所述用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子、所述水稻OsCYP704B2基因的突变体外，还添加了水稻OsCYP704B2基因的3’-UTR。

优选地，所述添加的3’-UTR为水稻品种93-11的OsCYP704B2基因终止密码子下游274bp片段。

为便于所述表达盒在多种植物表达载体中的切除、连接、替换片段等操作，对表达盒的序列中的一些酶切位点进行了优化，包括：将水稻OsCYP704B2基因CDS的第348位G突变为C、第525位A突变为G、第717G突变为C、第888C突变为G、第1206G突变为C、第1335C突变为G、第1422G突变为C、第1428G突变为C，上述各位点均以 OsCYP704B2基因的起始密码子的第一个碱基作为第1位计算。

经上述整体序列优化改造得到的表达盒的序列如SEQ ID NO.3所示。

如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的启动子、如SEQ IDNO.2所示的OsCYP704B2基因经第660位A突变为C、第1032位G突变为A、第348位G突变为C、第525位A突变为G、第717G 突变为C、第888C突变为G、第1206G突变为C、第1335C突变为G、第1422G突变为C、第1428G突变为C序列优化改造得到的 OsCYP704B2基因雄性育性恢复突变体和OsCYP704B2基因下游的 274bp的3’UTR。

如SEQ ID NO.3所示表达盒能够在花药中高效表达，恢复水稻育性。

更进一步地，为便于表达盒的载体构建、转化，对如SEQ ID NO.3 所示的序列进行如下任意一种或多种改造：

(1)在如SEQ ID NO.3所示的序列的5’端添加多克隆位点；

(2)在如SEQ ID NO.3所示的序列的5’-UTR和起始密码子之前添加酶切位点；

(3)在如SEQ ID NO.3所示的序列的终止密码子与3’UTR之间添加酶切位点；

(4)在如SEQ ID NO.3所示的序列的3’端添加多克隆位点。

作为本发明的优选实施方式，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其为将如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经过上述(1) ～(4)的改造得到的核苷酸序列。

本发明还提供含有所述用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子或所述表达盒的生物材料，所述生物材料包括载体、宿主细胞或工程菌。

所述载体包括但不限于克隆载体、表达载体、非复制型载体等载体，包括但不限于pCAMBIA1300载体、pCAMBIA1301载体、 pCAMBIA3300载体、pCAMBIA3301载体等。

优选地，所述宿主细胞包括微生物细胞、植物细胞。

所述微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、农杆菌等。

所述植物细胞包括但不限于植物花药细胞等。

本发明提供的用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子能够驱动基因在花药中的高效表达，因此，本发明进一步提供所述启动子或包含所述启动子的表达盒或所述生物材料在驱动基因在植物花药中表达或制备转基因植物中的应用。

本发明提供的包含用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子和 OsCYP704B2基因突变体的表达盒能够有效恢复雄性不育水稻的雄性育性，因此，本发明进一步提供所述启动子或包含所述启动子的表达盒或所述生物材料在在植物育性恢复、制备隐形雄性核不育植物、植物遗传育种或植物种质改良、或植物杂交制种中的应用。

优选地，所述植物育性恢复为OsCYP704B2功能缺失导致的雄性不育的雄性育性的恢复。

所述隐形雄性核不育植物包括但不限于雄性不育保持系、雄性不育系等。

在利用上述含有用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子和 OsCYP704B2基因突变体的表达盒或所述生物材料进行转基因植物的制备或利用制备的转基因植物进一步杂交育种时，需要高效的检测方法进行跟踪鉴定。本发明在进行OsCYP704B2基因突变体的序列优化时同时为便于后续鉴定进行了特异的酶切位点引入和消除。

因此，本发明还提供用于检测携带含有所述用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子和OsCYP704B2基因突变体的表达盒的水稻的方法，具体为，以待测水稻的基因组为模板，采用如下(1)或(2) 的引物组合进行PCR扩增，采用HaeIII酶切扩增产物，根据酶切产物的片段类型判断待测水稻是否携带含有所述用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子和OsCYP704B2基因突变体的表达盒：

(1)正向引物F1：AGGTCGGGTTTGGGGTT；

反向引物R1：GATGTTGGCAGCGTCGAA；

(2)正向引物F2：AGCTTCGGGGACGACAAGA；

反向引物R2：GCGCCGGAGCTTGTC。

其中，当采用正向引物F1和反向引物R1进行检测时，如酶切产物含有66bp的片段则待测水稻携带所述表达盒；

当采用正向引物F2和反向引物R2进行检测时，如酶切产物含有 138bp的片段，则待测水稻携带所述表达盒。

上述检测方法同样可以用于高效鉴别OsCYP704B2野生型、 OsCYP704B2突变体和OsCYP704B2育性恢复的转基因事件；

因此，本发明还提供用于鉴定OsCYP704B2野生型、OsCYP704B2 突变体和OsCYP704B2育性恢复转基因事件的方法，具体为，以待测水稻的基因组为模板，采用如下(1)或(2)的引物组合进行PCR扩增，采用HaeIII酶切扩增产物，根据酶切产物的条带类型判断水稻 OsCYP704B2基因型：

(1)正向引物F1：AGGTCGGGTTTGGGGTT；

反向引物R1：GATGTTGGCAGCGTCGAA；

(2)正向引物F2：AGCTTCGGGGACGACAAGA；

反向引物R2：GCGCCGGAGCTTGTC；

所述OsCYP704B2育性恢复转基因事件为转化所述的表达盒或含有所述的表达盒的生物材料。

优选地，所述OsCYP704B2突变体为cyp704b2-2和cyp704b2-3突变体，其分别公开于中国专利CN104894144A和CN105002191A中。

作为本发明的一种实施方式，当所述OsCYP704B2突变体为 cyp704b2-2时，采用上述正向引物F2和反向引物R2进行扩增，如酶切产物含有115bp片段，则含有水稻基因组原位的OsCYP704B2野生型基因型，如酶切产物含有113bp片段，则含有为cyp704b2-2突变体基因型，如酶切产物含有138bp片段，则含有所述OsCYP704B2育性恢复转基因事件基因型。

作为本发明的另一种实施方式，当所述OsCYP704B2突变体为 cyp704b2-3时，采用上述正向引物F1和反向引物R1进行扩增，如酶切产物含有86bp片段，则含有水稻基因组原位的OsCYP704B2野生型基因型，如酶切产物含有84bp片段，则含有为cyp704b2-3突变体基因型，如酶切产物含有66bp片段，则含有所述OsCYP704B2育性恢复转基因事件基因型。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的花药启动子能够驱动内源或外源基因在植物花药中高效地表达，在驱动基因在花药中高效表达和制备转基因植物中具有很好的应用潜力。

(2)本发明提供的含有经序列优化的水稻OsCYP704B2基因及其上下游表达调控序列的表达盒在未改变OsCYP704B2基因编码的氨基酸序列的情况下，能够实现OsCYP704B2基因在花药启动子的驱动下在花药中高水平表达，高效、完全地恢复由OsCYP704B2功能缺失导致的水稻雄性不育表型，可在实践中用于水稻雄性育性的恢复或用于制备水稻雄性核不育保持系和不育系。

(3)本发明提供的OsCYP704B2基因育性恢复表达盒与现有技术相比具有片段长度显著缩小，在保证育性恢复效果的同时，提高了遗传稳定性以及载体的构建和遗传转化效率。

(4)本发明通过在表达盒的OsCYP704B2基因的内部引入或消除酶切位点，提供了通过PCR扩增和酶切能够同时鉴定OsCYP704B2 突变体、野生型以及育性恢复表达盒的快速便捷的检测方法，可实现利用分子标记高效鉴定OsCYP704B2育性恢复表达盒的转基因植株或其杂交后代的基因型。

(5)本发明提供的OsCYP704B2育性恢复表达盒分别在 OsCYP704B2启动子5’端、启动子与编码区之间、编码区与3’-UTR区，以及3’-UTR的3’端添加了常用酶切位点，便于在后续应用中根据需要为该表达盒更换启动子、基因或3’-UTR片段。

附图说明

图1为本发明实施例2中构建的pOsMs26::OsMs26m表达盒的结构示意图。

图2为本发明实施例4的中花11背景的cyp704b2-3纯合种子的基因型鉴定电泳图，其中泳道1为cyp704b2-3纯合突变体种子，泳道2为中花11种子，泳道3～10为回交杂合单株自交获得的种子。

图3为本发明实施例6中T0代转化植株的背景基因型和表达盒基因型的鉴定电泳图，其中，泳道1为野生型中花11，泳道2为转化受体中花11背景的cyp704b2-3纯合突变体，泳道3-20为转化阳性株，其中泳道3～9,11～17，19和20为突变体背景且含有表达盒的转化株，泳道 10为含有表达盒但是野生型背景的转化株，泳道18为突变体背景但不含表达盒的假阳性植株。

图4为实施例7中野生型和T0代转化植株的花药形态和粉碘-碘化钾染色的显微镜观察结果图，其中，A为不育突变体花药，B为转化阳性株花药，C为I₂-KI染色的突变体花药，D为I₂-KI染色的转化阳性株花药。

图5为实施例8中野生型OsCYB704B2基因、cyp704b2-2突变体和 pOsMs26::OsMs26m表达盒的鉴定电泳图，其中泳道1为cyp704b2-2突变体，泳道2为野生型植株，泳道3～22为转化植株。其中3～7,11～14为杂合体背景的阳性转化株；8～10,15～20为纯合突变体背景的阳性转化株；21,22为纯合突变体背景但不含表达盒的假阳性植株。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，如无特殊说明，核苷酸位置均以基因的起始密码子的第一个核苷酸为+1位，其起始密码子上游第一个核苷酸为-1位计算。

实施例1 pOsMs26启动子的获得

通过对日本晴和93-11基因组序列分析，发现OsCYP704B2(即OsMs26)基因起始密码子与上游预测基因的终止密码子之间有1112 bp的DNA序列。通过启动子元件预测网站New PLACE (https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action＝newplace)分析，这一区间分布着高密度的花药特异启动子元件POLLEN1LELAT52序列 AGAAA。分别截取不同长度的、包含不同数量的POLLEN1LELAT52 元件的DNA片段进行启动子活性鉴定，结果显示，这些截取的片段中，有一部分片段虽然包含花药特异启动子元件POLLEN1LELAT52 序列，但是其并不具有启动子活性或启动子活性较低，经层层筛选，并进行启动子活性的比较，最终确定将含有3个POLLEN1LELAT52 元件的-712～-1bp片段(SEQ ID NO.1)作为启动子序列，其具有优异的驱动基因在花药中表达的功能，可作为驱动外源基因或水稻内源基因在花药中高效表达的启动子，将该启动子命名为pOsMs26。

实施例2 含pOsMs26启动子和OsCYP704B2基因的表达盒和载体的构建

根据实施例1的筛选结果，以序列如SEQ ID NO.1所示的 pOsMs26启动子驱动OsCYP704B2互补基因的表达，测试其驱动互补基因恢复花药败育的能力。

根据Gramene网站公开的籼稻品种93-11的OsCYP704B2 (OsMs26)基因编码区及其上下游序列，设计含序列如SEQ ID NO.1 所示的pOsMs26启动子和OsCYP704B2基因的表达盒的序列，并对其序列进行优化，通过添加或消除某些内切酶的识别位点，便于后续表达盒的酶切、转移等操作，具体如下：

(1)将序列如SEQ ID NO.1所示的pOsMs26启动子与水稻 OsCYP704B2基因的CDS序列(序列如SEQ ID NO.2所示)连接，驱动OsCYP704B2基因的表达。

(2)在不改变编码的氨基酸序列的前提下，在将OsCYP704B2的CDS 序列的第660位由A突变为C，以引入HaeIII酶切位点；第1032位 G突变为A，消除一个HaeIII和一个MspI酶切位点，以便于表达盒转化水稻后的分子标记鉴定。

(3)添加在上述得到的序列的3’端添加OsCYP704B2基因下游274 bp的3’UTR序列。

(4)对上述(3)得到的序列在不改变编码的氨基酸序列的前提下，进行整体序列的表达优化，通过筛选得到如下改造组合： G348→C348；A525→G525；G717→C717；C888→G888； G1206→C1206；C1335→G1335；G1422→C1422；G1428→C1428，得到的序列如SEQ IDNO.3所示。

(5)在上述(4)得到序列的5’端添加一个总长58bp的多克隆位点，其5’端为HindIII酶切位点，3’端为SacI酶切位点。

(6)将上述(5)得到序列的-8位的碱基A修改为GT，与上下游碱基形成一个KpnI酶切位点。

(7)在上述(6)得到的序列的OsCYP704B2基因的终止密码子与 3’UTR之间插入一个BamHI酶切位点序。

(8)在上述(7)得到的序列的3’端添加一个93bp的多克隆位点，其5’端为XbaI酶切位点，3’端为EcoRI酶切位点。

经上述(1)～(8)的改造后，得到pOsMs26::OsMs26m表达盒 (将经上述(1)～(8)碱基改造的OsCYP704B2基因CDS和3’UTR 命名为OsMs26m)，其序列如SEQ ID NO.4所示，表达盒的结构示意图如图1所示。该序列由南京金斯瑞公司合成，并克隆到pUC57载体上。通过HindIII和XbaI双酶切、连接，将合成的 pOsMs26::OsMs26m表达盒序列连接到pCAMBIA1300上，得到载体 pCAMBIA-pOsMs26::OsMs26m。

实施例3 cyp704b2-3回交转育至中花11水稻植株

在前期的研究中，发明人获得了两个籼稻93-11背景的 OsCYP704B2突变体，分别为cyp704b2-2和cyp704b2-3(其分别公开于中国专利CN104894144A和CN105002191A中)，两个突变体均表现为无花粉型雄性不育。本实施例采用专利CN105002191A实施例 9描述的突变基因回交选育的方法，以cyp704b2-3突变体为突变基因供体，以中花11为回交受体亲本，通过两代回交，从55株BC2个体中选出了1株中花11背景超过92％的cyp704b2-3-野生型杂合株，其自交种子用于纯合突变体和突变体-野生型杂合子的鉴定。

实施例4 中花11背景的cyp704b2-3纯合种子的获得

以实施例3中收获的杂合株的自交种子为待检样，剪为两半，其中含有胚的一半种子留作转化受体，另外不带胚的一半种子采用下述方法快速提取DNA：

(1)取不带胚的半个种子置入200μL的96孔PCR板孔内；

(2)使用前配制缓冲液A：800μL 20％Tween20，160μL 5mol/L NaOH， 7.04mLddH₂O(以整块96孔PCR板计)；缓冲液B：1mL 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，40μL 0.5mol/LEDTA(pH8.0)，8.96mL ddH₂O。

(3)每孔加入50μL缓冲液A，用胶盖封盖，PCR仪中加热到95℃，保持10min；

(4)取出平板，迅速加入等体积的缓冲液B，1000×g离心混匀1min，得到的提取液即可作为模板DNA进行PCR检测；

取上述提取液1μL作模板，采用专利CN105002191B的实施例9 中所用的分子标记和鉴定方法，从中鉴定出携带纯合隐性雄性不育基因的种子，结果如图2所示。将鉴定得到的携带纯合隐性雄性不育cyp704b2-3突变基因的种子对应的带胚的一半种子用于后续的农杆菌转化构建转基因植株；不育突变体-野生型杂合种子对应的带胚的一半种子继续种植，用于自交扩繁突变体和杂合种子，继续按本实施例方法鉴定筛选纯合突变体用于遗传转化，或杂合子种子用于扩繁。

实施例5 转化pOsMs26::OsMs26m表达盒的转基因水稻植株的构建

将实施例2构建的pCAMBIA-pOsMs26::OsMs26m重组质粒导入农杆菌EHA105菌株，并转化至实施例4中获得的粳稻中花11背景且携带cyp704b2-3纯合隐性雄性不育基因的种子的愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根,最终获得再生 pCAMBIA-pOsMs26::OsMs26m转化株76株，通过PCR鉴定转基因植株中转入的潮霉素抗性基因，得到PCR鉴定阳性植株62株，将阳性植株移栽至泥土中，成活58株。

实施例6 阳性植株的遗传背景和pOsMs26::OsMs26m表达盒的鉴定

剪取pCAMBIA-pOsMs26::OsMs26m阳性转基因株系叶片，使用CTAB法提取叶片DNA。

采用特异引物：正向引物F1:AGGTCGGGTTTGGGGTT；反向引物R1:GATGTTGGCAGCGTCGAA；对实施例5获得的转基因阳性个体进行PCR扩增及PCR产物的HaeIII酶切鉴定。上述引物扩增产物包含cyp704b2-3突变体变异位点，可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中观察出cyp704b2-3突变体背景植株存在的2bp的缺失突变；引物扩增产物还包含pOsMs26::OsMs26m表达盒中携带A660C突变的 OsCYP704B2基因片段(该突变引入了HaeIII酶切位点)，因此，将 pOsMs26::OsMs26m表达盒成功整合至水稻基因组中的转基因植株可被HaeIII酶切，而水稻基因组原始的OsCYP704B2基因片段则不能被HaeIII酶切。采用上述检测方法，从实施例5获得的58株移栽成活的转化植株中鉴定出遗传背景为cyp704b2-3纯合突变体，且含有pOsMs26::OsMs26m表达盒的转基因植株57株。部分植株的PCR 产物酶切鉴定结果如图3所示，其中，86bp的酶切条带为水稻基因组原始的野生型OsCYP704B2基因型，84bp的酶切条带为 cyp704b2-3突变体基因型，66bp的酶切条带为pOsMs26::OsMs26m表达盒转化片段的OsMs26m基因型；野生型植株仅产生86bp的酶切条带，野生型背景的转基因植株产生86bp和66bp两条酶切条带， cyp704b2-3纯合突变体背景的转基因植株产生84bp和66bp两条酶切条带。

实施例7 转化阳性植株的雄性育性鉴定

在实施例6得到的转化阳性植株的T0代植株抽穗后开花前，取花药压片，用碘化钾染色镜检，鉴定转基因植株花粉活力，并通过体视显微镜观察转基因植株花粉形态。结果如图4所示，cyp704b2-3 突变体植株无可见花粉，而转化阳性植株则有大量可育花粉，表现为育性恢复。在57株cyp704b2-3纯合突变体背景且携带含有 pOsMs26::OsMs26m表达盒转化基因的T0代植株中，经过镜检，其中39株花粉可育；在39株镜检花粉可育的植株中，28株套袋自交可结实，17株结实率大于50％，7株高于80％，达到了野生型的结实率。

选取转基因可育的T0单株，收获种子，取30粒进行栽种，出苗成活共16株，按本实施例上述方法镜检花粉活性，并统计T1代自交结实情况。结果表明，所有16株原遗传背景均为cyp704b2-3突变体，其中13株含转基因表达盒的单株均可自交结实，3株无转基因表达盒的单株均不可自交结实。表明该表达盒恢复育性的能力可稳定遗传。

由上述T0和T1代植株表型可知，实施例1获得的长度为712bp 的pOsMs26启动子能够驱动其后的基因在水稻花药中高效表达，该启动子的强度足以满足野生型OsCYP704B2基因回复相应突变体的雄性不育表型的需要；转化pOsMs26::OsMs26m表达盒的转基因水稻可恢复水稻OsCYB704B2基因突变引起的雄性不育表型且可以稳定遗传。

实施例8 分子标记检测方法在鉴定野生型OsCYB704B2基因、 cyp704b2-2突变体和pOsMs26::OsMs26m表达盒基因型中的应用

本实施例的目的在于验证本发明提供的分子标记检测方法在鉴定野生型、cyp704b2-2突变体和pOsMs26::OsMs26m表达盒基因型中的应用。

剪取野生型水稻93-11、cyp704b2-2突变体叶片，使用CTAB法提取叶片DNA，稀释至100ng/μL；将pCAMBIA-pOsMs26::OsMs26m 重组质粒稀释至10ng/μL。分别以上述野生型水稻93-11和cyp704b2-2 突变体叶片的基因组DNA以及pCAMBIA-pOsMs26::OsMs26m重组质粒为模板，采用正向引物F2：AGCTTCGGGGACGACAAGA和反向引物R2：GCGCCGGAGCTTGTC进行PCR扩增及HaeIII酶切验证：引物扩增区域内包含pOsMs26::OsMs26m表达盒OsMs26m基因携带的G1032→A1032碱基改造，其消除了一个HaeIII，因此， pOsMs26::OsMs26m表达盒载体在扩增酶切后仍然保持138bp；而野生型93-11和cyp704b2-2突变体的OsCYB704B2基因扩增片段仍保有这一酶切位点，酶切后的片段分别为115和113bp，检测结果如图 5所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种恢复水稻OsCYP704B2突变体雄性育性的表达盒、载体及其检测方法和应用

<130> KHP181118261.9

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 712

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttggatatat cttggcaata gtattttata ttgcttgttt atgtgagaat gttttaacta 60

gatggcaact gatttctggg acaaaatcgc ttctacaata gcattttatg gaactcgtac 120

tcgtcgatag catttcttgg atttgggtgt ttgtaaatgg catttcttgg attttctctt 180

cattaaaata gcctattcag atgaagtaga attcaggtga agtagaaacc aactactttg 240

ggttcacaat ttatatttct tttgaggata ccccatttca ttttagttgt catcaaagac 300

tagacaatat cgacagaaaa tggtaagcct ggtttcagtt ggtgacaatt taacagaatt 360

cagatggata tggttctgat attagaaggt gccatacctt tagtcgctgc aaacgcttca 420

gttatctgaa caaaacaacg aacttggctg agcaggggaa aaaaatactg tagcattcat 480

tttgtgttta catgagtaac gattcttttc taggtggaca gatcacaaaa agaaaactaa 540

agctaagatc caactcctaa gggtgttagg ttagggacac catatgaatg agacaatctt 600

aattcttggt cacacaaaga ttgtctcaag gttggtagca tcagttccca atatatcacc 660

taactatggc atccaaaatg ctacatagca tctcttgtag actgaaccct tc 712

<210> 2

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagagcc ccatggagga agctcatgca atgccagtga catcattctt cccagtagca 60

ggaatccaca agctcatagc tatcttcctt gttgtcctct catggatctt ggtccacaag 120

tggagcctga ggaaccagaa agggccaaga tcatggccaa tcatcggcgc gacagtggag 180

caactgaaga actaccacag gatgcatgac tggcttgtcg agtacttgtc gaaggacagg 240

acggtgaccg tcgacatgcc tttcacctcc tacacctaca ttgccgaccc ggtgaacgtc 300

gagcatgtcc tgaagaccaa cttcaccaat taccccaagg gtgaagtgta caggtcttac 360

atggatgtgc tgctcggtga tggcatattc aatgccgacg gcgagatgtg gaggaagcaa 420

aggaagacgg cgagcttcga gtttgcctcc aagaacttga gagacttcag cactgtggtg 480

ttcagggagt actccctgaa gctatcaagc attctgagcc aagcatgcaa ggccggcaga 540

gttgtagaca tgcaggaatt gttcatgagg atgacactgg actcgatctg caaggtcggg 600

tttggggttg agatcgggac gctgtcacct gatctcccgg agaacagctt tgcccaggca 660

ttcgacgctg ccaacatcat cgtcacgctg cggttcatcg atcctctgtg gcgtctgaag 720

aagttcttgc acgtcggatc agaggctctc ctcgagcaga gcatgaagct ggttgatgac 780

ttcacctaca gcgtgatccg ccgccgcaag gctgagatct tgcaggctcg agccagcggc 840

aagcaagaga agatcaagca cgacatactg tcgcggttca tcgagctcgg ggaggccggc 900

ggcgacgagg ggggcggcag cttcggggac gacaagagcc tccgcgacgt ggtgctcaac 960

ttcgtgatcg ccgggcgtga cacgacggcg acgacgctgt cgtggttcac gtacatggcg 1020

atgacgcacc cggccgtcgc cgacaagctc cggcgcgagc tggccgcgtt cgaggctgag 1080

cgcgcgcgcg aggagggcgt cgcgctcgcc gacgccgccg gcgaggcgtc attcgcggcg 1140

cgcgtggcgc agttcgcgtc gctgctgagc tacgacgcgg tggggaagct ggtgtacctg 1200

cacgcgtgcg tgacggagac gctccgcctc tacccggcgg tgccgcagga ccccaagggg 1260

atcgtggagg acgacgtgct ccccgacggc accaaggtgc gcgccggcgg gatggtgacg 1320

tacgtgccct actccatggg gaggatggag tacaactggg gccccgacgc ggcgagcttc 1380

cggccggagc ggtggctcag cggcgacggc ggcgcgttcc ggaacgcgtc gccgttcaag 1440

ttcaccgcgt tccaggccgg gccgcggatc tgcctcggca aggactccgc ctacctccag 1500

atgaagatgg cgctcgccat cctcttccgc ttctacacct tcgacctcgt cgaggaccac 1560

cccgtcaagt accggatgat gaccatcctc tccatggctc acggcctcaa ggtccgcgtc 1620

tccacctccg tctga 1635

<210> 3

<211> 2621

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttggatatat cttggcaata gtattttata ttgcttgttt atgtgagaat gttttaacta 60

gatggcaact gatttctggg acaaaatcgc ttctacaata gcattttatg gaactcgtac 120

tcgtcgatag catttcttgg atttgggtgt ttgtaaatgg catttcttgg attttctctt 180

cattaaaata gcctattcag atgaagtaga attcaggtga agtagaaacc aactactttg 240

ggttcacaat ttatatttct tttgaggata ccccatttca ttttagttgt catcaaagac 300

tagacaatat cgacagaaaa tggtaagcct ggtttcagtt ggtgacaatt taacagaatt 360

cagatggata tggttctgat attagaaggt gccatacctt tagtcgctgc aaacgcttca 420

gttatctgaa caaaacaacg aacttggctg agcaggggaa aaaaatactg tagcattcat 480

tttgtgttta catgagtaac gattcttttc taggtggaca gatcacaaaa agaaaactaa 540

agctaagatc caactcctaa gggtgttagg ttagggacac catatgaatg agacaatctt 600

aattcttggt cacacaaaga ttgtctcaag gttggtagca tcagttccca atatatcacc 660

taactatggc atccaaaatg ctacatagca tctcttgtag actgaaccct tcatgaagag 720

ccccatggag gaagctcatg caatgccagt gacatcattc ttcccagtag caggaatcca 780

caagctcata gctatcttcc ttgttgtcct ctcatggatc ttggtccaca agtggagcct 840

gaggaaccag aaagggccaa gatcatggcc aatcatcggc gcgacagtgg agcaactgaa 900

gaactaccac aggatgcatg actggcttgt cgagtacttg tcgaaggaca ggacggtgac 960

cgtcgacatg cctttcacct cctacaccta cattgccgac ccggtgaacg tcgagcatgt 1020

cctgaagacc aacttcacca attaccccaa gggtgaagtc tacaggtctt acatggatgt 1080

gctgctcggt gatggcatat tcaatgccga cggcgagatg tggaggaagc aaaggaagac 1140

ggcgagcttc gagtttgcct ccaagaactt gagagacttc agcactgtgg tgttcaggga 1200

gtactccctg aagctatcaa gcattctgag ccaagcgtgc aaggccggca gagttgtaga 1260

catgcaggaa ttgttcatga ggatgacact ggactcgatc tgcaaggtcg ggtttggggt 1320

tgagatcggg acgctgtcac ctgatctccc ggagaacagc tttgcccagg ccttcgacgc 1380

tgccaacatc atcgtcacgc tgcggttcat cgatcctctg tggcgtctca agaagttctt 1440

gcacgtcgga tcagaggctc tcctcgagca gagcatgaag ctggttgatg acttcaccta 1500

cagcgtgatc cgccgccgca aggctgagat cttgcaggct cgagccagcg gcaagcaaga 1560

gaagatcaag cacgacatac tgtcgcggtt catcgagctg ggggaggccg gcggcgacga 1620

ggggggcggc agcttcgggg acgacaagag cctccgcgac gtggtgctca acttcgtgat 1680

cgccgggcgt gacacgacgg cgacgacgct gtcgtggttc acgtacatgg cgatgacgca 1740

cccagccgtc gccgacaagc tccggcgcga gctggccgcg ttcgaggctg agcgcgcgcg 1800

cgaggagggc gtcgcgctcg ccgacgccgc cggcgaggcg tcattcgcgg cgcgcgtggc 1860

gcagttcgcg tcgctgctga gctacgacgc ggtggggaag ctggtgtacc tgcacgcctg 1920

cgtgacggag acgctccgcc tctacccggc ggtgccgcag gaccccaagg ggatcgtgga 1980

ggacgacgtg ctccccgacg gcaccaaggt gcgcgccggc gggatggtga cgtacgtgcc 2040

ctactcgatg gggaggatgg agtacaactg gggccccgac gcggcgagct tccggccgga 2100

gcggtggctc agcggcgacg gcggcgcgtt ccgcaacgcc tcgccgttca agttcaccgc 2160

gttccaggcc gggccgcgga tctgcctcgg caaggactcc gcctacctcc agatgaagat 2220

ggcgctcgcc atcctcttcc gcttctacac cttcgacctc gtcgaggacc accccgtcaa 2280

gtaccggatg atgaccatcc tctccatggc tcacggcctc aaggtccgcg tctccacctc 2340

cgtctgaccc ccgccgccgc tcgccggcag ccgcgccgcc gccgcccgta tcgcttaccg 2400

gagtagtaaa taagcctatg taatctggtt tgaatttgaa atttgaatgt accatgtttg 2460

attctaggat ttgttggtcc tagaccctgc ttgaaacggt gcgaatttca tctaaatggt 2520

tgagaaattt tatcgaaagc tgttccattc tacgctacaa atggtgggac tggatttaaa 2580

cattggcgac gtggacaagg ctagtggact gagactctga g 2621

<210> 4

<211> 2779

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagctttccc tggcaacagg ctgcacggtc cgacgcgttt cgaaatttaa atgagctctt 60

ggatatatct tggcaatagt attttatatt gcttgtttat gtgagaatgt tttaactaga 120

tggcaactga tttctgggac aaaatcgctt ctacaatagc attttatgga actcgtactc 180

gtcgatagca tttcttggat ttgggtgttt gtaaatggca tttcttggat tttctcttca 240

ttaaaatagc ctattcagat gaagtagaat tcaggtgaag tagaaaccaa ctactttggg 300

ttcacaattt atatttcttt tgaggatacc ccatttcatt ttagttgtca tcaaagacta 360

gacaatatcg acagaaaatg gtaagcctgg tttcagttgg tgacaattta acagaattca 420

gatggatatg gttctgatat tagaaggtgc cataccttta gtcgctgcaa acgcttcagt 480

tatctgaaca aaacaacgaa cttggctgag caggggaaaa aaatactgta gcattcattt 540

tgtgtttaca tgagtaacga ttcttttcta ggtggacaga tcacaaaaag aaaactaaag 600

ctaagatcca actcctaagg gtgttaggtt agggacacca tatgaatgag acaatcttaa 660

ttcttggtca cacaaagatt gtctcaaggt tggtagcatc agttcccaat atatcaccta 720

actatggcat ccaaaatgct acatagcatc tcttgtagac tggtaccctt catgaagagc 780

cccatggagg aagctcatgc aatgccagtg acatcattct tcccagtagc aggaatccac 840

aagctcatag ctatcttcct tgttgtcctc tcatggatct tggtccacaa gtggagcctg 900

aggaaccaga aagggccaag atcatggcca atcatcggcg cgacagtgga gcaactgaag 960

aactaccaca ggatgcatga ctggcttgtc gagtacttgt cgaaggacag gacggtgacc 1020

gtcgacatgc ctttcacctc ctacacctac attgccgacc cggtgaacgt cgagcatgtc 1080

ctgaagacca acttcaccaa ttaccccaag ggtgaagtct acaggtctta catggatgtg 1140

ctgctcggtg atggcatatt caatgccgac ggcgagatgt ggaggaagca aaggaagacg 1200

gcgagcttcg agtttgcctc caagaacttg agagacttca gcactgtggt gttcagggag 1260

tactccctga agctatcaag cattctgagc caagcgtgca aggccggcag agttgtagac 1320

atgcaggaat tgttcatgag gatgacactg gactcgatct gcaaggtcgg gtttggggtt 1380

gagatcggga cgctgtcacc tgatctcccg gagaacagct ttgcccaggc cttcgacgct 1440

gccaacatca tcgtcacgct gcggttcatc gatcctctgt ggcgtctcaa gaagttcttg 1500

cacgtcggat cagaggctct cctcgagcag agcatgaagc tggttgatga cttcacctac 1560

agcgtgatcc gccgccgcaa ggctgagatc ttgcaggctc gagccagcgg caagcaagag 1620

aagatcaagc acgacatact gtcgcggttc atcgagctgg gggaggccgg cggcgacgag 1680

gggggcggca gcttcgggga cgacaagagc ctccgcgacg tggtgctcaa cttcgtgatc 1740

gccgggcgtg acacgacggc gacgacgctg tcgtggttca cgtacatggc gatgacgcac 1800

ccagccgtcg ccgacaagct ccggcgcgag ctggccgcgt tcgaggctga gcgcgcgcgc 1860

gaggagggcg tcgcgctcgc cgacgccgcc ggcgaggcgt cattcgcggc gcgcgtggcg 1920

cagttcgcgt cgctgctgag ctacgacgcg gtggggaagc tggtgtacct gcacgcctgc 1980

gtgacggaga cgctccgcct ctacccggcg gtgccgcagg accccaaggg gatcgtggag 2040

gacgacgtgc tccccgacgg caccaaggtg cgcgccggcg ggatggtgac gtacgtgccc 2100

tactcgatgg ggaggatgga gtacaactgg ggccccgacg cggcgagctt ccggccggag 2160

cggtggctca gcggcgacgg cggcgcgttc cgcaacgcct cgccgttcaa gttcaccgcg 2220

ttccaggccg ggccgcggat ctgcctcggc aaggactccg cctacctcca gatgaagatg 2280

gcgctcgcca tcctcttccg cttctacacc ttcgacctcg tcgaggacca ccccgtcaag 2340

taccggatga tgaccatcct ctccatggct cacggcctca aggtccgcgt ctccacctcc 2400

gtctgaggat cccccccgcc gccgctcgcc ggcagccgcg ccgccgccgc ccgtatcgct 2460

taccggagta gtaaataagc ctatgtaatc tggtttgaat ttgaaatttg aatgtaccat 2520

gtttgattct aggatttgtt ggtcctagac cctgcttgaa acggtgcgaa tttcatctaa 2580

atggttgaga aattttatcg aaagctgttc cattctacgc tacaaatggt gggactggat 2640

ttaaacattg gcgacgtgga caaggctagt ggactgagac tctgagtcta gaatgcgcat 2700

gcgatcgcga ctgctgaacc gatacaaccg tcctggtgaa agactgtgta catcggaagc 2760

cttgggactg caggaattc 2779

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggtcgggtt tggggtt 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatgttggca gcgtcgaa 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agcttcgggg acgacaaga 19

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgccggagc ttgtc 15

Claims

1.一种用于驱动DNA在植物花药中表达的启动子，其特征在于，其具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2.含有权利要求1所述的启动子的表达盒。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，还包括水稻OsCYP704B2基因或水稻OsCYP704B2基因的突变体，所述水稻OsCYP704B2基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述水稻OsCYP704B2基因的突变体具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第660位A突变为C，和/或，如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第1032位G突变为A的核苷酸序列。

5.根据权利要求3或4所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒还包括水稻OsCYP704B2基因的3’-UTR；

所述水稻OsCYP704B2基因的突变体为将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第660位A突变为C、第1032位G突变为A、第348位G突变为C、第525位A突变为G、第717G突变为C、第888C突变为G、第1206G突变为C、第1335C突变为G、第1422G突变为C、第1428G突变为C的核苷酸序列；

优选地，所述表达盒的序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求3～5任一项所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒为在如SEQ IDNO.3所示的序列经如下任意一种或多种改造得到：

(1)在如SEQ ID NO.3所示的序列的5’端添加多克隆位点；

(4)在如SEQ ID NO.3所示的序列的3’端添加多克隆位点；

优选地，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.含有权利要求1所述的启动子或权利要求2～6任一项所述的表达盒的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括载体、宿主细胞或工程菌。

8.权利要求1所述的启动子或权利要求2～6任一项所述的表达盒或权利要求7所述的生物材料的如下任意一种的应用：

(1)在驱动基因在植物花药中表达的应用；

(2)在制备转基因植物中的应用；

(3)在植物育性恢复中的应用；

(4)在制备隐形雄性核不育植物中的应用；

(5)在植物遗传育种或种质改良中的应用；

(6)在植物杂交制种中的应用。

9.用于检测携带权利要求4～6任一项所述表达盒的水稻的方法，其特征在于，以待测水稻的基因组为模板，采用如下(1)或(2)的引物组合进行PCR扩增，采用HaeIII酶切扩增产物，根据酶切产物的片段类型判断待测水稻是否携带权利要求4～6任一项所述的表达盒：

(1)正向引物F1：AGGTCGGGTTTGGGGTT；

反向引物R1：GATGTTGGCAGCGTCGAA；

(2)正向引物F2：AGCTTCGGGGACGACAAGA；

反向引物R2：GCGCCGGAGCTTGTC。

10.用于鉴定OsCYP704B2野生型、OsCYP704B2突变体和OsCYP704B2育性恢复转基因事件的方法，其特征在于，以待测水稻的基因组为模板，采用如下(1)或(2)的引物组合进行PCR扩增，采用HaeIII酶切扩增产物，根据酶切产物的条带类型判断水稻OsCYP704B2基因型：

(1)正向引物F1：AGGTCGGGTTTGGGGTT；

反向引物R1：GATGTTGGCAGCGTCGAA；

(2)正向引物F2：AGCTTCGGGGACGACAAGA；

反向引物R2：GCGCCGGAGCTTGTC；

所述OsCYP704B2育性恢复转基因事件为转化如权利要求4～6任一项所述的表达盒或权利要求7所述的生物材料。