CN115028696B

CN115028696B - 一种与果实品质相关的蛋白及其编码基因的应用

Info

Publication number: CN115028696B
Application number: CN202110191519.2A
Authority: CN
Inventors: 李倩; 王娟; 袁冰; 张文博; 冷平
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-02-20
Filing date: 2021-02-20
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2041-02-20
Also published as: CN115028696A

Abstract

本发明公开了一种与果实品质相关的蛋白及其编码基因的应用。本发明提供了SlPP2C4蛋白的应用，为如下(a1)和/或(a2)：(a1)在调控植物果实硬度中的应用；(a2)在调控植物果实可溶性固形物含量中的应用。本发明还提供了编码SlPP2C4蛋白的核酸分子的应用，为如下(d1)和/或(d2)：(d1)在制备果实硬度提高的转基因植物中的应用；(d2)在制备果实可溶性固形物含量提高的转基因植物中的应用。本发明对于植物果实高品质育种具有重要作用。

Description

一种与果实品质相关的蛋白及其编码基因的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种与果实品质相关的蛋白及其编码基因的应用。

背景技术

果实是人们日常生活饮食中非常重要的组成部分，是人体维生素、纤维素、矿物质和抗氧化等物质的重要来源，对维持人体正常营养化、预防疾病等方面均有非常重要的作用。果实中众多营养物质主要随着其成熟过程而大量积累，因此研究果实成熟对于了解果实成熟调控机制、培育高品质果实品种具有很重要的理论意义及实践应用价值。

果实的成熟是一个复杂且高度程序化的复杂生物学过程，涉及一系列生理生化变化及多种激素的共同参与。

发明内容

本发明的目的是提供一种与果实品质相关的蛋白及其编码基因的应用。

本发明提供了SlPP2C4蛋白的应用，为如下(a1)和/或(a2)：

(a1)在调控植物果实硬度中的应用；

(a2)在调控植物果实可溶性固形物含量中的应用。

本发明还提供了SlPP2C4蛋白的应用，为如下为如下(c1)和/或(c2)：

(c1)在提高植物果实硬度中的应用；

(c2)在提高植物果实可溶性固形物含量中的应用。

本发明还提供了编码SlPP2C4蛋白的核酸分子的应用，为如下(d1)和/或(d2)：

(d1)在制备果实硬度提高的转基因植物中的应用；

(d2)在制备果实可溶性固形物含量提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码SlPP2C4蛋白的核酸分子导入受体植物中，得到果实硬度提高的转基因植物。

本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码SlPP2C4蛋白的核酸分子导入受体植物中，得到果实可溶性固形物含量提高的转基因植物。

本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中SlPP2C4蛋白的含量和/或活性，从而使果实硬度提高。

本发明还提供了一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中SlPP2C4蛋白的含量和/或活性，从而使果实可溶性固形物含量提高。

以上任一所述SlPP2C4蛋白，获自番茄(Solanum lycopersicum)，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：

(b1)序列表的序列1所示的蛋白质；

(b2)将序列表的序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物果实发育相关的由其衍生的蛋白质；

(b3)在(b1)所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(b4)来源于番茄且与(b1)具有98％以上同一性且与植物果实发育相关的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

以上任一所述编码SlPP2C4蛋白的核酸分子是如下(e1)或(e2)或(e3)或(e4)或(e5)的DNA分子：

(e1)编码区如序列表的序列2中第1-1611位核苷酸所示的DNA分子；

(e2)序列表的序列2中第1-1627位核苷酸所示的DNA分子；

(e3)序列表的序列2所示的DNA分子；

(e4)在严格条件下与(e1)或(e2)或(e3)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(e5)来源于番茄且与(e1)或(e2)或(e3)限定的DNA分子至少具有98％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

以上任一所述将编码SlPP2C4蛋白的核酸分子导入受体植物具体可为将具有编码SlPP2C4蛋白的核酸分子的重组质粒导入受体植物。具体的，所述重组质粒可为将序列表的序列2中第1-1627位核苷酸所示的双链DNA分子插入pRI101-AN载体的多克隆位点(例如XbaI和KpnI酶切位点之间)得到的重组质粒。

以上任一所述植物可为双子叶植物。

以上任一所述植物可为茄科植物。

以上任一所述植物可为番茄属植物。

以上任一所述植物可为番茄，例如番茄Micro-Tom。

本发明的发明人发现，在番茄中过表达SlPP2C4基因，可提高果实的可溶性固形物含量及硬度。本发明对于植物果实高品质育种具有重要作用。

附图说明

图1为SlPP2C4基因在番茄果实发育成熟过程中的表达变化情况。

图2为供试植株果实硬度检测结果。

图3为供试植株果实可溶性固形物含量的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的光暗交替培养均为16h光照/8h黑暗。番茄Micro-Tom，番茄常规品种，也称为野生型番茄，用WT表示。番茄的果皮指的是果实除去外果皮、果胶和种子以外的部分。

从番茄中发现一个新蛋白，如序列表的序列1所示，命名为SlPP2C4蛋白。将编码SlPP2C4蛋白的基因命名为SlPP2C4基因。番茄cDNA中，SlPP2C4基因如序列表的序列2所示(开放阅读框如序列2中第1-1611位所示)。

实施例1、SlPP2C4基因在番茄果实发育成熟过程中的表达变化情况

根据番茄植株盛花期后坐果天数及果实大小、颜色变化情况，将果实发育成熟过程分为幼果期(IG)、绿熟期(MG)、破色期(B)、破色后3天(B+3)、破色后5天(B+5)、破色后7天(B+7)和破色后10天(B+10)。

取番茄Micro-Tom的每个时期的果皮进行液氮冻存。取液氮冻存样本，提取总RNA，反转录得到cDNA。以cDNA为模板，通过实时定量qPCR检测SlPP2C4基因的表达量(每ng总RNA含有多少拷贝数的SlPP2C4基因转录产物)。

用于检测SlPP2C4基因的引物如下：

SlPP2C4-qF(上游引物):GGTACTTTGAGTAGGGAAAGGGGTGA；

SlPP2C4-qR(下游引物):GAAATACGAGGATGGTTTAGTGCGTTA。

反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，上游引物(10mM)0.5μL，下游引物(10mM)0.5μL，cDNA 1.5μL，ddH₂O 7.5μL。

结果见图1。

实施例2、转SlPP2C4基因番茄的获得以及果实相关性状的检测

一、重组表达载体的构建

将序列表的序列2中第1-1627位核苷酸所示的双链DNA分子插入pRI101-AN载体的XbaI和KpnI酶切位点之间，得到重组质粒。重组质粒已进行测序验证。

二、制备转基因番茄植株

1、取番茄Micro-Tom的种子，用75％乙醇水溶液消毒30s，然后用次氯酸钠水溶液消毒15min，然后用无菌水冲洗6-8遍。

2、取完成步骤1的种子，置于固体1/2MS培养基，25℃光暗交替培养7-8天(此时子叶充分展开、真叶尚未形成)。

3、完成步骤2后，剪取子叶，剪除两端，中部剪成边长0.5cm左右的正方形，即为外植体；将外植体置于预培养培养基，25℃黑暗培养2天。

预培养培养基：含2.5mg/L 6-BA和0.2mg/L IAA的固体MS培养基。

4、完成步骤3后，将外植体置于侵染液中侵染5min，然后取出外植体并吸干残余菌液，然后置于共培养培养基，25℃黑暗培养2天。

侵染液：将步骤一得到的重组质粒导入农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌；用含100mg/L AS的液体MS培养基重悬重组农杆菌，使OD_600nm＝0.5，即为侵染液。

共培养培养基：含2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L IAA和100mg/L AS的固体MS培养基。

5、完成步骤4后，将外植体转移至除菌培养基，先25℃黑暗培养2-3天，再25℃光暗交替培养3-4天。

除菌培养基：含2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L IAA、200mg/L Carb、300mg/L Cef的固体MS培养基。

6、完成步骤5后，将外植体转移至筛选培养基，25℃光暗交替培养30-45天(每隔15天继代一次)，得到植株。

筛选培养基：含2.5mg/L 6-BA、0.2mg/L IAA、200mg/L Carb、300mg/L Cef、4mg/LHyg的固体MS培养基。

7、完成步骤6后，将植株转移至生根培养基，25℃光暗交替培养，得到生根的植株，即为T0代再生植株。

生根培养基：含0.2mg/L IAA和200mg/L Carb的1/2MS固体培养基。

8、从T0代再生植株中筛选转基因植株。

筛选转基因植株的方法：待植株长至根长2-4cm时取植株叶片进行PCR鉴定，如果得到扩增产物，该再生植物为PCR鉴定阳性植株，即转基因植株。

用于PCR鉴定的引物如下：

35S-F:GCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG；

SlPP2C4-R:TGTTTTCTTCTTGAATTTCCTCTGT。

9、T0代转基因植株自交，得到的后代植株即为T1代植株；从T1代植株中筛选转基因植株(方法同步骤8)。

10、T1代转基因植株自交，得到的后代植株即为T2代植株；从T2代植株中筛选转基因植株(方法同步骤8)。

对于某一T1代转基因植株，如果其自交得到的T2代植株均为转基因植株，该T1代植株为纯合的转基因植株，其自交后代为纯合的转基因株系。取4个转基因株系(即OE1株系、OE7株系、OE10株系和OE22株系)进行步骤四。

三、制备转空载体番茄植株

用pRI101-AN载体代替重组质粒，参照步骤二进行操作，得到转空载体株系。

四、果实品质分析

供试植株：OE1株系的T3植株、OE7株系的T3植株、OE10株系的T3植株、OE22株系的T3植株、野生型番茄植株、转空载体株系的T3植株。

在平行条件下正常培养供试植株，分别于盛花期后15天、35天、40天、45天、50天、55天和60天，取果实，拍照并检测果实硬度和可溶性固形物含量。

果实硬度的测定方法：取果实，去除外果皮，用KM型果实硬度计(Fujihara)测果实硬度。每个果实测定三个不同位置，每个时期至少测定10个果实(至少3个植株上的果实)。

果实可溶性固形物含量的测定：取果实，压榨出汁，利用手持式糖度计测定可溶性固形物含量，每个果实测三次，每个时期至少测定10个果实(至少3个植株上的果实)。

果实硬度结果见图2。果实可溶性固形物含量的结果见图3。结果表明，在果实发育成熟不同阶段，转基因植株的果实硬度和果实可溶性固形物含量均显著高于野生型番茄。转空载体植株的果实硬度和果实可溶性固形物含量均与野生型番茄无显著差异。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种与果实品质相关的蛋白及其编码基因的应用

<130> GNCYX210767

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 536

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 1

Met Gln Asp Cys Phe Glu Thr Gly Lys Leu Ile Tyr Asp Glu Ser Val

1 5 10 15

Leu Pro Thr Cys Ile Asp Phe Ala Gly Tyr Glu Leu Ile Pro Asn Thr

20 25 30

Thr Ser Leu Leu Ser Glu Pro Asn Lys Cys Lys Leu Pro Cys Ser Val

35 40 45

Ser Asn His Arg Val Ser Arg Asp Lys Ala Asn Leu Phe Met Thr Val

50 55 60

Ala Asp Cys His Glu Ile Arg Ile Gly Lys Ser Phe Ser Ser Thr Val

65 70 75 80

Val Gly Asn Gly Asn Cys Leu Ile Ala Ser Glu Val Glu Asp Gly Arg

85 90 95

Ser Met Asp Asn Asn Leu Ile Ser Pro Thr Asp Glu Leu Leu Gly Asn

100 105 110

Met Thr Cys Ser Asp Ser Leu Val Asp Glu Arg Val Ser Met Pro Asn

115 120 125

Gln Glu Cys Thr Gly Leu Glu Val Lys Val Gly Lys Met Pro Pro Arg

130 135 140

Asp Glu Glu Lys Lys Val Gly Val Ser Gln Ile Leu Arg Lys Ser Phe

145 150 155 160

Ser Cys Ser Leu Ala Asn Glu Leu Val Asn Glu Ser Gln Leu Val Ser

165 170 175

Asp Ile Val Ser Thr Met Val Val Gly Ala Glu Asp Tyr Lys Arg Lys

180 185 190

Leu Ser Pro Ser His Leu Glu Thr Ser Gln Glu Ile Lys Ile Ser Arg

195 200 205

Pro Asn Thr Leu Cys Phe Asp Ser Val Pro Leu Trp Gly Leu Ile Thr

210 215 220

Ile Gln Gly Lys Arg Pro Glu Met Glu Asp Thr Ala Ile Ala Leu Pro

225 230 235 240

Lys Phe Leu Lys Ile Pro Ser His Ile Leu Thr Asp Ala Pro Val Ser

245 250 255

His Ala Leu Ser Gln Thr Leu Thr Ala His Leu Tyr Gly Val Tyr Asp

260 265 270

Gly His Gly Gly Ser Gln Val Ala Asn Tyr Cys His Glu Arg Leu His

275 280 285

Met Val Leu Ala Gln Glu Ile Asp Ile Met Lys Glu Asp Pro His Asn

290 295 300

Gly Ser Val Asn Trp Lys Glu Gln Trp Ser Lys Ala Phe Leu Asn Cys

305 310 315 320

Phe Cys Arg Val Asp Asp Glu Val Gly Gly Phe Cys Ser Glu Thr Asp

325 330 335

Gly Ile Glu Pro Asp Leu Ser Val Ile Ala Pro Glu Ala Val Gly Ser

340 345 350

Thr Ala Ile Val Ala Val Val Ser Pro Ser His Ile Ile Val Ala Asn

355 360 365

Cys Gly Asp Ser Arg Ala Val Leu Cys Arg Gly Lys Leu Pro Met Pro

370 375 380

Leu Thr Ile Asp His Lys Pro Asn Arg Glu Asp Glu Cys Ser Arg Ile

385 390 395 400

Glu Glu Leu Gly Gly Lys Val Ile Asn Trp Asp Gly His Arg Val Ser

405 410 415

Gly Val Leu Ala Val Ser Arg Ser Ile Gly Asp Arg Tyr Leu Arg Pro

420 425 430

Tyr Val Ile Pro Asp Pro Glu Met Met Phe Val Pro Arg Ala Lys Glu

435 440 445

Asp Asp Cys Leu Ile Leu Ala Ser Asp Gly Leu Trp Asp Val Leu Thr

450 455 460

Asn Glu Glu Ala Cys Asp Val Ala Arg Arg Arg Ile Leu Leu Trp His

465 470 475 480

Lys Lys Asn Gly Gly Thr Leu Ser Arg Glu Arg Gly Glu Asn Val Asp

485 490 495

Pro Ala Ala Gln Asp Ala Ala Glu Tyr Leu Thr Arg Val Ala Leu Gln

500 505 510

Arg Gly Ser Arg Asp Asn Ile Ser Val Ile Val Val Asp Leu Lys Ala

515 520 525

Gln Arg Lys Phe Lys Lys Lys Thr

530 535

<210> 2

<211> 1936

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 2

atgcaagatt gttttgaaac gggaaaattg atatatgatg aatcagtatt acctacatgt 60

attgactttg ctggatatga gctgatcccc aatacaacta gcttgctgtc agaacctaac 120

aagtgcaaac ttccttgttc ggtgtcgaat catagagtgt ccagggacaa agctaacctt 180

tttatgacag ttgctgattg tcatgaaatc aggataggga agagtttttc ttcgacagtt 240

gtaggtaatg ggaattgttt gattgctagt gaggtagaag atggtagatc tatggacaac 300

aatttgattt caccaactga tgagctttta ggaaatatga cttgttctga ttctctagtt 360

gatgagcgtg tcagcatgcc taaccaagaa tgtacaggtt tggaggttaa ggttgggaaa 420

atgcctcctc gggatgagga aaagaaggtt ggtgtatccc agattctgag aaagtctttt 480

tcgtgtagtt tggctaatga gttggttaat gagtcacaac ttgtaagtga tattgtttcc 540

accatggttg tgggtgctga agattataaa agaaaattat caccatccca tcttgagacc 600

tcacaagaga taaagataag caggccaaat accctttgtt ttgattctgt accgctttgg 660

gggctcatca caatacaagg aaagaggccg gagatggaag atactgctat agctttacca 720

aagtttctga aaatcccttc ccatattttg actgatgcgc cagtttctca tgccctgagt 780

caaacactta cagcccattt atatggggtt tatgatggac atggaggctc tcaggtagct 840

aattattgtc atgagcgtct ccatatggtt ttagcacagg agatagatat catgaaagag 900

gatccacata atggaagtgt taactggaag gagcaatggt caaaggcttt cttgaattgt 960

ttctgtagag tcgatgatga ggtagggggg ttctgtagtg aaacagacgg gattgagcct 1020

gacctttcag tcattgctcc tgaagcagtt ggatctacag ctatagttgc tgttgttagt 1080

ccaagccata ttattgttgc gaattgtggt gattctaggg cagtcctttg tcggggaaaa 1140

ctgcccatgc cattaaccat tgaccataag ccaaataggg aagatgagtg ttcacgaata 1200

gaagaactgg gagggaaggt cattaattgg gatggacatc gcgtttctgg tgttcttgca 1260

gtttcaaggt caattggtga tcgatattta aggccttatg tgattccaga tccagaaatg 1320

atgtttgtac cccgagcaaa agaagacgac tgtctaattt tagcaagtga tgggctatgg 1380

gatgtcttga caaatgaaga agcttgtgat gtagcacgga gacgaattct tctctggcac 1440

aaaaaaaatg gtggtacttt gagtagggaa aggggtgaaa acgtagatcc tgctgctcaa 1500

gatgctgcag agtacttgac tcgagttgct ctccaaaggg gcagcagaga taatatatct 1560

gtgattgtgg tcgatttgaa ggcacagagg aaattcaaga agaaaacata acgcactaaa 1620

ccatcctcgt atttcatttg tggatgtaac attgggaagt tatcctacag gatgataatc 1680

attgcagatt ttagctatcc tttttaatta ggctgttacc gtacatgata gaagttattc 1740

tgacaataaa aattcagcag agttggttca aagaacaaag tattgactcc cagcacagat 1800

tatttatgca actgtagtgt aatgttgtct tcccagaact ctctcactga acaaacaact 1860

gcacaagtag aaacaagtta tgtgagtgag cttgctgttt ttcatatatg tatctatcct 1920

tttcttgagg tctaat 1936

Claims

1.SlPP2C4蛋白的应用，为如下（c1）和/或（c2）：

（c1）在提高植物果实硬度中的应用；

（c2）在提高植物果实可溶性固形物含量中的应用；

所述SlPP2C4蛋白是如下（b1）或（b2）：

（b1）序列表中序列1所示的蛋白质；

（b2）在（b1）所述蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

所述植物为番茄属植物。

2.编码SlPP2C4蛋白的核酸分子的应用，为如下（d1）和/或（d2）：

（d1）在制备果实硬度提高的转基因植物中的应用；

（d2）在制备果实可溶性固形物含量提高的转基因植物中的应用；

所述SlPP2C4蛋白为权利要求1中所述的SlPP2C4蛋白；

所述植物为番茄属植物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：编码SlPP2C4蛋白的核酸分子是如下（e1）或（e2）或（e3）或（e4）或（e5）的DNA分子：

（e1）编码区如序列表的序列2中第1-1611位核苷酸所示的DNA分子；

（e2）序列表的序列2中第1-1627位核苷酸所示的DNA分子；

（e3）序列表的序列2所示的DNA分子；

（e4）在严格条件下与（e1）或（e2）或（e3）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

（e5）来源于番茄且与（e1）或（e2）或（e3）限定的DNA分子至少具有98%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

4.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码SlPP2C4蛋白的核酸分子导入受体植物中，得到果实硬度提高的转基因植物；所述SlPP2C4蛋白为权利要求1中所述的SlPP2C4蛋白；所述植物为番茄属植物。

5.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将编码SlPP2C4蛋白的核酸分子导入受体植物中，得到果实可溶性固形物含量提高的转基因植物；所述SlPP2C4蛋白为权利要求1中所述的SlPP2C4蛋白；所述植物为番茄属植物。

6.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中SlPP2C4蛋白的含量，从而使果实硬度提高；所述SlPP2C4蛋白为权利要求1中所述的SlPP2C4蛋白；所述植物为番茄属植物。

7.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中SlPP2C4蛋白的含量，从而使果实可溶性固形物含量提高；所述SlPP2C4蛋白为权利要求1中所述的SlPP2C4蛋白；所述植物为番茄属植物。