CN109251926B

CN109251926B - 植物茎部和/或叶柄特异表达的启动子spp、其表达载体及其应用

Info

Publication number: CN109251926B
Application number: CN201811159934.4A
Authority: CN
Inventors: 张洪映; 崔红; 王召军; 闫筱筱; 云菲
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN109251926A

Abstract

本发明公开了一种植物茎部和/或叶柄特异表达的启动子SPP、其载体及其应用，旨在解决特异性表达目的基因的技术问题。该启动子SPP的核苷酸序列见SEQ ID NO.1。设计包含启动子SPP序列的表达载体。将启动子SPP在植物茎部和叶柄组织发育调控机制、茎部和叶柄分子改良中应用。设计驱动目的基因表达的方法：将启动子SPP作为唯一启动子插入含目的基因的表达载体得重组质粒；将重组质粒导入受体植物并在茎部和叶柄中特异表达目的基因。本发明的启动子可驱动目的基因在植物茎部和叶柄组织特异性表达，能作为植物遗传转化表达外源基因的表达元件，对植物茎部和叶柄组织发育调控、茎部和叶柄的品质改良具重要价值。

Description

植物茎部和/或叶柄特异表达的启动子SPP、其表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种植物茎部和/或叶柄特异表达的启动子SPP、其表达载体及其应用。

背景技术

植物基因启动子是决定外源基因转录效率的关键因素，因而选择合适的启动子对于增强外源基因的表达量至关重要。目前在基因工程中常用的烟草花叶病毒CaMV 35S、水稻肌动蛋白ActinI启动子、烟草泛素Ubiquitin启动子等均属于组成型启动子。此类启动子的特点是能够驱动下游目的基因在各组织和各生育期持续高效表达，而不受外界环境限制；但是多数植物基因的表达具有时空表达模式，而持续高表达某些基因会影响植株的生长发育、增加植物体的整体能量消耗，并在转基因高代株系出现基因沉默现象。

在基因工程领域，需要根据目的基因的组织表达特性来开发并利用高效特异的启动子。

植物茎部和叶柄组织主要负责水分和有机物质的运输，同时对于整个植株的生物结构具有重要作用。而对于甘蔗等茎部为主要生物量的作物，茎部是利用转基因技术生产重组药用蛋白或高附加值化合物的理想器官。

因此，亟需研究开发一种植物茎部和/或叶柄组织特异表达的启动子，以期用以研究植物茎部和叶柄组织发育调控机制，以及用于生物技术改良植物茎部和叶柄。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物茎部和/或叶柄特异表达的启动子SPP、其表达载体及其应用，以实现利用植物茎部和/或叶柄特异性表达目的基因的目的，以解决当前难以利用植物茎部和/或叶柄进行发育调控、生产高附加值产物的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

克隆一种能做植物茎部和/或叶柄中特异表达的启动子SPP（Stem and PetioleSpecific Promoter），其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

设计一种用于植物遗传转化的表达载体，所述载体包含所述启动子SPP。

将所述植物茎部和/或叶柄特异表达启动子SPP在植物茎部和/或叶柄组织发育调控机制中应用。比如，采用酵母单杂交技术筛选与植物茎部和叶柄特异表达启动子相结合的转录因子，并采用染色质免疫沉淀技术对获得的转录因子进行验证，研究植物茎部和叶柄组织的发育机制。

可将所述启动子SPP应用于茎部和/或叶柄分子改良中。比如，将目的基因替换ProSPP-GUS-PH7GW2载体中的GUS基因，可以使目的基因在植物茎部和/或叶柄高效表达，进而改良作物的品质。

将所述植物茎部和/或叶柄特异表达启动子SPP在驱动目的基因表达中应用。

所述启动子SPP驱动目的基因表达的方法，包括以下步骤：

（1）将上述启动子SPP作为唯一启动子插入含目的基因的表达载体，得重组质粒；

（2）将所得重组质粒导入受体植物并培育，在所述受体植物茎部和/或叶柄中特异表达目的基因。

优选的，所述受体植物为单子叶植物。

优选的，所述出发植物为小麦。

优选的，所述目的基因为GUS基因。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明启动子SPP能够在植物茎部和/或叶柄中特异表达目的基因，可驱动GUS基因在拟南芥中表达，能作为植物遗传转化表达外源基因的表达元件。

2.本发明启动子SPP为小麦内源性的能够特异的在拟南芥茎部和叶柄特异表达的启动子，能够克服组成型启动子非特异、持续、高效表达所造成的浪费，减少目的基因对植物其它组织正常生长的影响，同时增加目的基因在茎部和叶柄中表达的效果。

3.本发明启动子有利于对茎部和/或叶柄的发育调控机制的深度研究及利用。

附图说明

图1为SPP基因的组织表达分析；

图2为ProSPP-GUS-PH7GW2载体图谱图；

图3为ProSPP-GUS-PH7GW2转基因拟南芥幼苗GUS染色图；

其中，A为ProSPP-GUS-PH7GW2转基因植株；B为野生型植株；C为35S-GUS-PH7GW2转基因植株；

图4为野生型和转基因拟南芥叶片中GUS活性对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的质粒载体如无特别说明，均为常规商业载体；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：构建重组载体ProSPP-GUS-PH7GW2

1. SPP启动子获取

本发明人在长期的生产及科研实践的基础上，通过综合分析研究小麦根、茎、幼叶三个组织的转录组信息，获得一个能在茎部高效表达的基因，进一步的组织表达分析发现该基因在小麦叶柄和茎部特异表达（见图1），命名为SPP（Stem and Petiole SpecificPromoter），其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. ProSPP-PH7GW2载体构建

小麦SPP（Stem and Petiole Specific Promoter）启动子表达载体采用pH7WG2载体。

（1）酶切位点分析：选用Sal I和EcoRI两个酶切位点为连接酶位点；

（2）酶切：用内切酶Sal I和EcoRI将pH7WG2载体中的P35s启动子切除，酶切反应体系为：25 μl pH7WG2 质粒（200 ng/μl）；1 μl 限制性内切酶1（15 U/μl）；1ul 限制性内切酶2（15 U/μl）；5 μl 限制性内切酶反应10× Buffer；18 μl 水；总体积为50 μl；37℃水浴3小时；

（3）切胶回收载体骨架：跑凝胶电泳，进行切胶回收质粒骨架片段，再用DNA回收试剂盒对DNA片段进行回收，备用；

（4）PCR扩增SPP启动子序列：使用CTAB法提取小麦叶片基因组总DNA，再进行SPP启动子序列PCR扩增；

PCR反应体系为：2 μl 基因组DNA（100 ng/μl）；1 μl Primer Star DNA 聚合酶；2μl 引物1（10 μM）；2 μl 引物2（10 μM）；10 μl 5× PCR反应 Buffer；4 μl dNTPs（2.5mM）；29 μl 水；总体积为50 μl；

反应程序为：94℃预变性 3 min ；94℃ 20 s，65℃ 20 s，72℃ 3 min，35个循环；72℃延伸 10 min；16℃保温；

用于扩增SPP启动子序列的引物序列如表1中所示：

表1 引物序列及用途

。

（5）电泳检测：PCR扩增结束后，进行凝胶电泳检测是否扩增到SPP启动子序列，结果显示约在900 bp的位置有一个明显条带；

（6）切胶回收启动子DNA：电泳结束后，将SPP启动子DNA从凝胶中切下，并用DNA回收试剂盒进行DNA片段回收；

（7）酶切和灭活：用Sal I和EcoRI两个内切酶酶切回收后的SPP启动子DNA片段；

酶切反应体系为：7 ul SPP启动子DNA片段（50 ng/μl）；1 ul 限制性内切酶1（15U/μl）；1 ul 限制性内切酶 2（15 U/μl）；1 ul 限制性内切酶反应10× Buffer；总体积为10 μl；37℃水浴3小时后，80℃灭活5分钟，使内切酶彻底失去活性；

（8）载体连接：将回收后的载体骨架和酶切后的SPP启动子DNA片段进行连接；

连接反应体系：1 μl 载体骨架；3 μl SPP启动子DNA片段；1 μl T4连接酶；1 μl10×T4连接酶Buffer；4 μl 水；总体积为10 μl；22℃连接2小时；

（9）筛选：热激转化DB3.1菌株，并用壮观霉素抗性的LB平板进行筛选，提取阳性克隆中的重组载体，获得改造后的载体，命名为ProSPP-PH7GW2，置于-20℃备用。

3. ProSPP-GUS-PH7GW2载体构建

采用Gateway方法将GUS基因插入到ProSPP-PH7GW2载体中SPP启动子序列下游。所用具体引物序列如表1中所示。

Gateway方法导入GUS基因的具体步骤如下：

（1）用GUS-F/GUS-R引物进行GUS基因第一轮PCR扩增，具体反应体系如实施例二中扩增SPP启动子序列，得到GUS基因第一轮PCR产物；

（2）以GUS基因第一轮PCR产物为模板，用GUS基因第二轮PCR引物进行第二轮PCR扩增；

（3）PCR反应结束后，切胶回收GUS基因DNA片段，备用；

（4）进行BP反应，具体反应体系为：1.5 μl GUS基因DNA片段回收产物；0.5 μlpDONR 201；1.0 μl BP clonase Ⅱenzyme Mix；2.0 μl水；25℃反应3～4 h后，加入0.5 μlProteinase K solution，37℃反应10 min；

（5）将反应产物热激转导进入DH5α感受态细胞，再通过卡那抗性平板进行筛选，获得阳性GUS-pDONOR 201质粒后，进行测序分析，以保证GUS基因序列完全正确；

（6）进行LR反应：将上述获得GUS-pDONOR 201质粒与之前获得的ProSPP-PH7GW2载体进行LR反应，将GUS基因导入ProSPP-PH7GW2载体中；25℃反应3～4 h后，加入0.5 μlProteinase K solution，37℃反应10 min；

具体反应体系如下：3 μl GUS-pDONOR201质粒；1 μl ProSPP-PH7GW2质粒；1 μlBP clonase Ⅱenzyme Mix；总体积为5 μl；

（7）将反应产物热激转导进入DH5α感受态细胞，再通过壮观抗性平板进行筛选，获得阳性转化株后，再进行测序分析，以保证GUS基因序列完全正确。

（8）提取重组载体，命名为ProSPP-GUS-PH7GW2，置于-20℃备用，其载体图谱如图2所示。

实施例二：构建重组拟南芥植株

1. 拟南芥培育

将拟南芥种子用75%酒精消毒后，均匀撒在MS固体培养基上进行培养，培养条件为25℃，每天光照14 h，培养2周，备用。

2. 热激转化将载体ProSPP-GUS-PH7GW2转入GV3101农杆菌

具体试验操作如下：

（1）将5 μl ProSPP-GUS-PH7GW2质粒（约 500 ng）与GV3101农杆菌感受态细胞在冰上静置30 min后，转入液氮中冻8 min，再转入37℃水浴锅中热激5 min；

（2）热激结束后迅速将装感受态细胞置于冰上3～5min后，在28℃摇床中160 rmp/min活化2h；

（3）将转化后的菌液涂布抗性平板中筛选，获得阳性GV3101菌株。

3. 农杆菌介导的拟南芥的转化

真空渗透法转化拟南芥，具体步骤如下：

（1）挑取克隆于YEB液体培养基（50 mg/L Spe，50 mg/L Rif）中培养，进行目标基因的菌液PCR检测；

（2）取经PCR检测正确的菌液5 μL接种于5 mL YEB液体培养基中（50 mg/L Spe，50mg/L Rif），28℃、250 rpm培养；

（3）菌液按1：100转接到100 mL YEB液体培养基中（50 mg/L Spe，50 mg/L Rif），28℃、250 rpm培养至OD₆₀₀= 0.8时准备进行拟南芥转化；

（4）4℃、7500 rpm离心15 min，将菌体重悬于1倍体积的转化渗透液中（5%Sucrose +0.02% Silwet L-77）；

（5）将拟南芥花蕾浸入渗透液中，静置5 s。转化后将植株平放，在低光照强度下生长16～24 h后置于正常光照条件下培养。

4. 转基因植株的获得

农杆菌侵染的当代拟南芥植株记为T₀代。利用载体上携带的潮霉素抗性基因，在含有50 mg/L hygromycin B的MS抗性培养基上进行T₁代转基因植株的筛选。经hygromycinB抗性筛选后正常生长的植株记为T₁代，通用PCR方法检测目标片段在T₁代拟南芥的转化情况。

实施例三：试验例

1. 试验分组

以野生型拟南芥植株为空白组；

利用组成型强启动子35S构建表达GUS基因的重组载体，命名为35S-GUS-PH7GW2，并进一步构建重组拟南芥植株，作为对照组；

以实施例二所构建重组拟南芥植株为试验组。

2. 检测GUS的特异性表达

待三组T₁代拟南芥幼苗长大些后，将其部分叶片剪下用于GUS染色。

GUS 组织化学染色方法如下：

将样品置于 GUS 染色液中（含有 1 mmol/L EDTA， 0.1%Triton X-100， 2 mmol/L 铁氰化钾， 2 mmol/L 亚铁氰化钾， 100 μg/mL 氯霉素的 50 mmol/L 磷酸缓冲液 pH=7.0），加入 100 mg/mL X-Gluc 母液（N,N-二甲基甲酰胺溶解，终浓度为 1mg/mL）， 37℃染色过夜，70%乙醇脱色至透明，在显微镜下（10× 10）观察幼苗各组织中蓝色区域的分布情况。

染色结果如图3所示：

只有试验组ProSPP-GUS-PH7GW2阳性转基因植株叶片的能够被染上颜色，且染色部位只在拟南芥茎部和叶柄，见图3A，说明SPP启动子能够特异性启动GUS基因在植物茎部和叶柄中特异表达；

空白组野生型没有出现蓝色，见图3B；

对照组35S-GUS-PH7GW2阳性转基因植株，在组成型强启动子35S驱动下，GUS基因在各组织都有表达，见图3C。

3. 检测GUS的活性

继续种植至T₃代进行GUS的活性检测。

GUS 活性检测方法如下：

取不同组织样品（根、叶和茎），液氮研磨后取100 mg样品。加入1 mL提取缓冲液（50 mmol/L 磷酸钠，10 mmol/LEDTA，0.1% TritonX-100，1% Sarcosyl， 10 mmol/L β-巯基乙醇），剧烈震荡，12000 rmp离心20 min，获得GUS蛋白粗提液。加入5 mmol/L的GUS反应底物 4-MUG， 37℃保温30 min，加入0.2 mmol/L Na₂CO₃反应终止液。测定荧光值（日立 850型荧光分光光度计，激发光350 nm，发射光 455 nm）和 GUS 蛋白含量（分光光度计，激发光595 nm）。以1 min水解4-MUG生成1 nmol/L 4-MU需要的酶量为一个酶活力单位，计算各启动子片段的GUS活性。

检测结果如图4所示：

试验组ProSPP-GUS-PH7GW2转基因株系茎部和叶柄组织的的GUS活性显著高于对照组35S-GUS-PH7GW2转基因株系。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 植物茎部和/或叶柄特异表达的启动子SPP、其表达载体及其应用

<130> 2018

<160> 1

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 926

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 1

agaagacgga tacatcgcac gtgccgcaga tccttttctt gaaagaaaga gaaaatcatt 60

ctcttcccct tccacatcat catcatcata atcagcgatg aaagttttca gtccgagaga 120

agggaaacgt gaagaatgac gtccgttttc cacagtccga gcacgttgtt tccgcctgtt 180

gctgcttgct accgccgagt gagcaattca tttcagtaac agttgggtat tgtgttccgc 240

gtgacaacca gatcttgcct gtctgcctgt agggccagtg ctttgactct cgtcagttac 300

tacttactct cctcgtaaaa tagacagatt taatttactt attttgcggg tagtagttta 360

ttatttgacc gcaaccgttt ctagtgcttc aaaagcaagc agggctccct tcaaaatcaa 420

aaaataaaag agcaagcaag gcacaacggg agccagactg tactcggttc agtaaccgcc 480

aaatcaagca acacggcgag aaaggaagct cccaatgcac acaaggacct caccgtcaat 540

cataacaaac caaaggtcca aacgacaatt agctcccggc gaaaacaaat catgagcacg 600

ccatatcatg gcacatcatc atcataatct aatcaccaaa taaaactagt actactcctc 660

ggagcagcag cactgcagca gtggtattaa ttaatcgaac ccaccccagc ggggaagaag 720

aagaagaaga agaagcctct ccttctcctt taagcttcga atcatccttc cttccccctc 780

ccccctccct ccctcccact tcatctcgcc gcgacgaagc ttccaaaacc cccaaaagga 840

tcccccaatc ttcgcctctg cctccggccc gatcaatctc tcagcagcgg ctgccgcgcg 900

gctcggcccg ggatccatgg agaggt 926

Claims

1.一种植物茎部和/或叶柄特异表达的启动子SPP，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种用于植物遗传转化的表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的启动子SPP。

3.权利要求1所述启动子SPP在植物茎部和/或叶柄组织发育调控机制中的应用。

4.权利要求1所述启动子SPP在茎部和/或叶柄分子改良中的应用。

5.权利要求1所述启动子SPP驱动目的基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述启动子SPP作为唯一启动子插入含目的基因的表达载体，得重组质粒；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述受体植物为单子叶植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述受体植物为小麦。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目的基因为GUS基因。