CN109762817B - 植物木质部特异表达启动子、其表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物木质部特异表达启动子、其表达载体及其应用，以期实现利用植物木质部特异性表达目的基因的目的。本发明筛选了一种植物木质部特异表达启动子，核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的核酸序列；或由SEQ ID NO.1所示的核酸序列衍生的具有同等功能的序列。本发明设计了一种用于植物遗传转化的真核表达载体。本发明将上述植物木质部特异表达启动子在植物木质部组织发育调控机制、植物输导组织形成、木质部分子改良中应用。本发明设计一种述植物木质部特异表达启动子驱动目的基因表达的方法。本发明的木质部特异启动子调节目的基因在木质部特异表达，有利于对木质部的发育调控机制的深度研究及利用。

Description

植物木质部特异表达启动子、其表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种植物木质部特异表达启动子、其表达载体及其应用。

背景技术

植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴未艾。自从1983年首次获得转基因植物后，至今已有35科120多种植物转基因获得成功。1986年首批转基因植物被批准进入田间试验，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种。

植物基因启动子是决定外源基因转录效率的关键因素，选择合适的启动子对于增强外源基因的表达量至关重要。目前在基因工程中常用的烟草花叶病毒CaMV 35S、水稻肌动蛋白ActinI启动子、烟草泛素Ubiquitin启动子等均属于组成型启动子，此类启动子的特点是驱动下游目的基因在各组织和各生育期持续高效表达，而不受外界环境、条件限制。

然而，实际上多数植物基因的表达具有时空表达模式，持续高表达某些基因会影响植株的生长发育、增加植物体的整体能量消耗，并在转基因高代株系出现基因沉默现象。

因此，在基因工程领域，需要根据目的基因的组织表达特性来开发并利用一些能够时序特异性、定位发育特异性表达的启动子。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物木质部特异表达启动子、其表达载体及其应用，以实现利用植物木质部特异性表达目的基因的目的，进而用于研究植物木质部发育调控机制，并应用于生物技术改良植物维管组织。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选或设计一种植物木质部特异表达启动子，其核苷酸序列为：

（1）如SEQ ID NO.1所示的核酸序列；或

（2）由SEQ ID NO.1所示的核酸序列衍生的具有同等功能的核酸序列。

设计一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体包含上述的启动子序列。

将上述植物木质部特异表达启动子在植物木质部组织发育调控机制、植物输导组织形成、木质部分子改良中应用。

利用上述植物木质部特异表达启动子驱动目的基因表达的方法，包括以下步骤：

（1）上述植物木质部特异表达启动子作为唯一启动子插入含目的基因的表达载体，得重组质粒；

（2）将所得重组质粒导入受体植物并培育，在所述受体植物中由所述植物木质部特异表达启动子启动所述重组质粒中目的基因的表达。

优选的，所述目的基因为GUS基因。

优选的，所述受体植物为双子叶植物。

进一步的，所述双子叶植物为烟草或拟南芥。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1. 鉴于植物木质部是维管植物的运输组织，负责将根吸收的水分及溶解于水里面的离子往上运输，以供其它器官组织使用，另外还具有支持植物体的作用，可利用本发明的木质部特异启动子调节目的基因在木质部特异表达，达到更经济有效的发挥目的基因的作用。

2. 本发明启动子为烟草内源性的能够特异的在拟南芥和烟草木质部特异表达的启动子，能够克服组成型启动子非特异、持续、高效表达所造成的浪费，减少目的基因对植物其它组织正常生长的影响，同时增强目的基因在木质部表达的效果。

3. 本发明在研究植物木质部特异性表达的调控方式对于植物维管组织分化及基因调控方面具有重要意义。

4. 本发明有利于对木质部的发育调控机制的深度研究及利用，例如，采用酵母单杂交技术筛选与本发明植物木质部特异表达启动子相结合的转录因子，并采用染色质免疫沉淀技术对获得的转录因子进行验证，然后进行候选基因的转基因功能验证，可确定其在植物木质部发育过程中的作用。

附图说明

图1为烟草木质素合成基因的组织表达分析；

图2为ProNtC3H-GUS-PH7GW2载体图谱图；

图3为ProNtC3H-GUS-PH7GW2转基因烟草幼苗的GUS染色图；

其中，A为Pro NtC3H-GUS-PH7GW2转基因植株；B为野生型植株；C为转基因植株茎部横切图；D为野生型植株茎部横切图；

图4为ProNtC3H-GUS-PH7GW2转基因烟草拟南芥的GUS染色图；

其中，A排依次为Pro NtC3H-GUS-PH7GW2转基因植株、其叶、其根；B排依次为野生型植株、其叶、其根；C排依次为35S-GUS-PH7GW2转基因植株、其叶、其根；

图5为野生型和转基因拟南芥的GUS活性对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的质粒载体如无特别说明，均为常规商业化产品；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：筛选植物木质部特异表达启动子

1. 普通烟草木质素合成基因的获得

目前，关于木质素的合成途径的报道，主要集中于2个方面：

一是苯丙烷类代谢途径，即木质素与其它酚类物质合成所用的公共路径，主要包括PAL（苯丙氨酸解氨酶）、C4H（肉桂酸4-羟化酶）、4CL（4-香豆酰CoA连接酶）3种关键酶类，它们的基因表达量对木质素及其它酚类物质的生物合成及含量高低有重要影响；

二是木质素单体合成的特异路径，主要包括上游的C3H（香豆酸3-羟化酶）、HCT（莽草酸羟基肉桂酰转移酶）、COMT（咖啡酸O-甲基转移酶）、CCoAOMT（咖啡酰CoA-O-甲基转移酶）和F5H（阿魏酸5-羟基化酶）以及下游的CCR（羟基肉桂酰CoA还原酶）、CAD（肉桂酸脱氢酶）和PAO（多胺氧化酶），这些合成酶基因表达量的高低不仅影响木质素含量的高低，还对其单体的组成有较大影响。

通过NCBI搜索植物木质素合成相关基因的cDNA序列，设计qRT-PCR引物，如表1所示。

表1 烟草木质素合成相关酶基因RT-PCR引物序列

注：F表示上游引物，R表示下游引物。

2. 组织表达差异分析

取普通烟草和烟草木质素合成相关酶基因RT-PCR引物，利用QuantiFast SYBRGreen PCR Kit试剂盒（Qiagen，Germany）在LightCycler 480 II型荧光定量PCR仪（Roche，Swiss）上进行qRT-PCR检测。选用烟草核糖体蛋白编码基因NtL25作为内参基因。

实验结果采用2^-ΔΔCt算法进行分析，确定各基因的相对表达量。试验设置3次重复。检测结果如图1所示。

结果表明，烟草NtC3H基因在茎部高表达，根部低表达，而在叶片无表达。NtF5H基因在根部高表达，茎部低表达，而在叶片无表达。

因此，NtC3H基因启动子只能驱动下游基因在根部和茎部表达，在叶片无表达。

实施例二：构建重组载体ProNtC3H-GUS-PH7GW2

1. ProNtC3H-PH7GW2载体构建

普通烟草NtC3H启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达载体采用pH7WG2载体。

（1）酶切位点分析：选用Sal I和EcoR I两个酶切位点为连接酶位点；

（2）酶切：用内切酶Sal I和EcoR I将pH7WG2载体中的P35S启动子切除，酶切反应体系为：25 μl pH7WG2 质粒（200 ng/μl）；1 μl 限制性内切酶1（15 U/μl）；1μl 限制性内切酶2（15 U/μl）；5 μl 限制性内切酶反应10× Buffer；18 μl 水；总体积为50 μl；37℃水浴 3小时；

（3）切胶回收载体骨架：跑凝胶电泳，进行切胶回收质粒骨架片段，再用DNA回收试剂盒对DNA片段进行回收，备用；

（4）PCR扩增NtC3H启动子序列：使用CTAB法提取普通烟草叶片基因组总DNA，再进行NtC3H启动子序列PCR扩增；

PCR反应体系为：2 μl 基因组DNA（100 ng/μl）；1 μl Primer Star DNA 聚合酶；2μl 引物1（10 μM）；2 μl 引物2（10 μM）；10 μl 5× PCR反应 Buffer；4 μl dNTPs（2.5mM）；29 μl 水；总体积为50 μl；

反应程序为：94℃预变性 3 min ；94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 2 min，35个循环；72℃延伸 10 min；16℃保温；

用于扩增NtC3H启动子序列的引物序列如表2所示：

表2 引物序列及用途

。

（5）电泳检测：PCR扩增结束后，进行凝胶电泳检测是否扩增到NtC3H启动子序列，结果显示约在2 Kb的位置有一个明显条带；

（6）切胶回收启动子DNA：电泳结束后，将NtC3H启动子DNA从凝胶中切下，并用DNA回收试剂盒进行DNA片段回收；

（7）酶切和灭活：用Sal I和EcoR I两个内切酶酶切回收后的NtC3H启动子DNA片段；

酶切反应体系为：7 ul NtC3H启动子DNA片段（50 ng/μl）；1 μl 限制性内切酶1（15 U/μl）；1 ul 限制性内切酶 2（15 U/μl）；1 ul 限制性内切酶反应10× Buffer；总体积为10 μl；37℃水浴3小时后，80℃灭活5分钟，使内切酶彻底失去活性；

（8）载体连接：将回收后的载体骨架和酶切后的NtC3H启动子DNA片段进行连接；

连接反应体系：1 μl 载体骨架；3 μl NtC3H启动子DNA片段；1 μl T4连接酶；1 μl10×T4连接酶Buffer；4 μl 水；总体积为10 μl；22℃连接2小时；

（9）筛选：热激转化DB3.1菌株，并用壮观霉素抗性的LB平板进行筛选，提取阳性克隆中的重组载体，获得改造后的载体，命名为ProNtC3H-PH7GW2，置于-20℃备用。

2. ProNtC3H-GUS-PH7GW2载体构建

采用Gateway方法将GUS基因插入到ProNtC3H-PH7GW2载体中NtC3H启动子序列下游。所用具体引物序列如表2中所示。

Gateway方法导入GUS基因的具体步骤如下：

（1）用GUS-F/GUS-R引物进行GUS基因第一轮PCR扩增，得到GUS基因第一轮PCR产物；

（2）以GUS基因第一轮PCR产物为模板，用GUS基因第二轮PCR引物进行第二轮PCR扩增；

（3）PCR反应结束后，切胶回收GUS基因DNA片段，备用；

（4）进行BP反应，具体反应体系为：1.5 μl GUS基因DNA片段回收产物；0.5 μlpDONR 201；1.0 μl BP clonase II enzyme Mix；2.0 μl水；25℃反应3～4 h后，加入0.5 μl Proteinase K solution，37℃反应10 min；

（5）将反应产物热激转导进入DH5α感受态细胞，再通过卡那霉素抗性平板进行筛选，获得阳性GUS-pDONOR 201质粒后，进行测序分析，以保证GUS基因序列完全正确；

（6）进行LR反应：将上述获得GUS-pDONOR 201质粒与之前获得的ProNtC3H-PH7GW2载体进行LR反应，将GUS基因导入ProNtC3H-PH7GW2载体中；25℃反应3～4 h后，加入0.5 μlProteinase K solution，37℃反应10 min；

具体反应体系如下：3 μl GUS-pDONOR201质粒；1 μl ProNtC3H-PH7GW2质粒；1 μlBP clonase Ⅱenzyme Mix；总体积为5 μl；

（7）将反应产物热激转导进入DH5α感受态细胞，再通过壮观霉素抗性平板进行筛选，获得阳性转化株后，再进行测序分析，以保证GUS基因序列完全正确。

（8）提取重组载体，命名为ProNtC3H-GUS-PH7GW2，置于-20℃备用，其载体图谱如图2所示。

实施例三：构建重组烟草植株

1. 热激转化将载体ProSPP-GUS-PH7GW2转入GV3101农杆菌

具体操作如下：

（1）将5 μl ProNtC3H-GUS-PH7GW2质粒（约 500 ng）与GV3101农杆菌感受态细胞在冰上静置30 min后，转入液氮中冻8 min，再转入37℃水浴锅中热激5 min；

（2）热激结束后迅速将装感受态细胞置于冰上3～5min后，在28℃摇床中160 rmp/min活化2h；

（3）将转化后的菌液涂布抗性平板中筛选，获得阳性GV3101菌株。

2. 烟草转化

（1）挑取阳性GV3101菌株接种于含有100 μg/ml壮观霉素霉素、50 μg/ml利福平的YEP培养基中，28℃，250 rpm，振荡培养约48 h，至对数生长后期（OD值0.6左右）；

（2）取20 ml菌液4000 rmp，4℃离心5分钟，倒掉上清，将菌体沉淀用20 ml MS培养液从新悬浮，待用；

（3）在超净工作台中，将烟草无菌苗叶片剪成边长0.5 cm左右，放在共同培养基上，28℃避光培养2天；

（4）将预培养后的烟草叶片侵入步骤（2）悬浮后的农杆菌菌液5～10 min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入含100 μmol/L AS的1/2MS培养基，黑暗或者弱光下，26℃共培养两天；

（5）将共培养后的外植体用灭菌水清洗后转入含0.5 mg/L 6-BA、0.05 mg/L NAA、20 mg/L潮霉素和500 mg/L Carb的筛选培养基上，26℃恒温培养，光照时间16 h/天，每15天更换一次培养基；

（6）待芽长至1 cm左右时，切下，移入生根培养基（含125 mg/L Carb，20 μg/L潮霉素的1/2 MS）中，促其生根；

（7）将获得的阳性转基因苗从生根培养基中移栽到泥炭土中培养长至幼苗。

实施例四：构建重组拟南芥植株

发明人进一步采用真空渗透法进行拟南芥的转化。

具体步骤如下：

（1）挑取克隆于YEB液体培养基（50 mg/L Spe，50 mg/L Rif）中培养，进行目标基因的菌液PCR检测；

（2）取经PCR检测正确的菌液5 μL接种于5 mL YEB液体培养基中（50 mg/L Spe，50mg/L Rif），28℃、250 rpm培养；

（3）菌液按1：100转接到100 mL YEB液体培养基中（50 mg/L Spe，50 mg/L Rif），28℃、250 rpm培养至OD₆₀₀ = 0.8时准备进行拟南芥转化；

（4）4℃、7500 rpm离心15 min，将菌体重悬于1倍体积的转化渗透液中（5%Sucrose +0.02% Silwet L-77）；

（5）将拟南芥花蕾浸入渗透液中，静置5 s。转化后将植株平放，在低光照强度下生长16～24 h后置于正常光照条件下培养。

农杆菌侵染的当代植株记为T₀代。利用载体上携带的潮霉素抗性基因，在含有50mg/L hygromycin B的MS抗性培养基上进行T₁代转基因植株的筛选。经hygromycin B抗性筛选后正常生长的植株记为T₁代，通过PCR方法检测目标片段在T₁代的转化情况。

试验例：

1. 试验分组

（1）以野生型烟草幼苗为空白对照组；

以实施例三所构建重组烟草幼苗为试验组。

（2）以野生型拟南芥植株为空白对照组；

以35S-GUS-PH7GW2阳性转基因植株为对照组

以实施例四所构建重组拟南芥植株为试验组。

2. 检测GUS的特异性表达

（1）待重组烟草和拟南芥T₁代转基因幼苗长大后，进行植株的GUS染色。

将GUS 组织化学染色的步骤如下：

样品置于 GUS 染色液中（含有 1 mmol/L EDTA， 0.1%Triton X-100， 2 mmol/L铁氰化钾， 2 mmol/L 亚铁氰化钾， 100 μg/mL 氯霉素的 50 mmol/L 磷酸缓冲液 pH=7.0），中加入 100 mg/mL X-Gluc 母液（N,N-二甲基甲酰胺溶解，终浓度为 1mg/mL）， 37°C染色过夜， 70%乙醇脱色至透明，在显微镜下（10× 10）观察幼苗各组织中蓝色区域的分布情况。

转化烟草检测结果如图3所示：

只有试验组ProNtC3H-GUS-PH7GW2阳性转基因植株能够被染上蓝色，且染色部位只在植株的木质部，见图3A和C，说明NtC3H启动子能够特异性启动GUS基因在烟草的木质部特异表达；

空白组野生型没有出现蓝色，见图3B和D；

转化拟南芥结果见图4：

试验组ProNtC3H-GUS-PH7GW2阳性转基因植株能够被染上蓝色，且染色部位只在植株的木质部，见图4A，说明NtC3H启动子能够特异性启动GUS基因在拟南芥的木质部特异表达；

空白组野生型没有出现蓝色，见图4B；

对照组35S-GUS-PH7GW2阳性转基因植株，在组成型强启动子35S驱动下，GUS基因在各组织都有表达，见图4C。

（2）检测拟南芥GUS活性

检测方法如下：

取不同组织样品（根、叶和茎），液氮研磨后取 100 mg 样品。加入1 mL 提取缓冲液（50 mmol/L 磷酸钠，10 mmol/LEDTA，0.1% TritonX-100，1% Sarcosyl，10 mmol/L β-巯基乙醇），剧烈震荡，12000 rmp 离心 20 min，获得 GUS蛋白粗提液。加入 5 mmol/L 的GUS 反应底物 4-MUG， 37°C 保温 30 min，加入0.2 mmol/L Na2CO3 反应终止液。测定荧光值（日立 850 型荧光分光光度计，激发光350 nm，发射光 455 nm）和 GUS 蛋白含量（分光光度计，激发光 595 nm）。以 1 min 水解 4-MUG 生成 1 nmol/L 4-MU 需要的酶量为一个酶活力单位，计算各启动子片段的GUS活性。

检测各组织的GUS活性，结果如图5所示：

试验组ProNtC3H-GUS-PH7GW2转基因株系的叶片（除去叶脉）无GUS活性，茎部的GUS活性显著高于对照组35S-GUS-PH7GW2转基因株系，根和和叶柄的GUS活性和对照组35S-GUS-PH7GW2转基因株系相当。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学，河南省烟草公司周口市公司

<120> 植物木质部特异表达启动子、其表达载体及其应用

<130> 2018

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gatgtcccat tgcctttgct at 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

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<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

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<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

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<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

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<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

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<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

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Claims (3)

1.一种植物木质部特异表达启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于植物遗传转化的真核表达载体，其特征在于，该载体包含权利要求1所述的启动子序列。

3.权利要求1所述植物木质部特异表达启动子驱动目的基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述植物木质部特异表达启动子作为唯一启动子插入含目的基因GUS的表达载体，得重组质粒；

（2）将所得重组质粒导入受体植物烟草或拟南芥并培育，在所述受体植物烟草或拟南芥中由所述植物木质部特异表达启动子启动所述重组质粒中目的基因的表达。

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