CN106947770B - 苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用 - Google Patents

苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了苤蓝BoPAP2和BoTT8基因及其共表达载体和应用，苤蓝BoPAP2基因的序列如SEQ ID No.3所示，苤蓝BoTT8基因的序列如SEQ ID No.6所示，将苤蓝BoPAP2和BoTT8基因共表达载体导入微型番茄(Micro‑Tom)外植体并获得稳定的遗传转化株系。转基因番茄植株呈现花青素在叶，花，根和果实等组织大量积累的表型，尤其是成熟期果实因花青素大量合成积累而呈现黑紫色。新创制的微型番茄品种具有良好的市场推广前景和经济价值，同时为其它观赏植物的新品种培育和筛选提供了良好的参考和借鉴。

Description

苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用。
背景技术
由于富含番茄红素和β-胡萝卜素等活性物质，因而具有抗氧化和预防癌症功能的番茄是一种广受欢迎的世界性蔬菜。原产南美洲的番茄大约在16世纪起就开始成为一种全球性的重要作物。从拉丁美洲引种到欧洲的番茄最早是作为观赏植物来栽培的。经过全世界育种工作者长期对番茄种质的发掘与创制，番茄的种质资源得到了极大地丰富。作为一种番茄突变体,微型番茄(Micro-Tom)保留了普通番茄的模式植物特征,且植株矮小、生命周期短,有利于节省室内空间、水费需要量小,因而更适合用于观赏植物的培育。目前用于观赏植物培育的微型番茄叶片和果实色彩较为单一，从而限制了微型番茄作为观赏花卉的产业发展。传统育种一般通过杂交来培育新品种，而该方法周期长、耗资多、育种效果并不理想且目标难以预期。
发明内容
鉴于以上内容，本发明独辟蹊径，通过大量、繁杂的试错和筛选工作，选用来自苤蓝的特定基因，成功将其导入微型番茄中，意外发现，外源基因在微型番茄中成功表达，进而得到了紫色微型番茄。
本发明的目的之一在于提供两个苤蓝基因BoPAP2和BoTT8；苤蓝BoPAP2基因，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；苤蓝BoTT8基因，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
本发明的目的之二在于提供含苤蓝基因BoPAP2和/或BoTT8的重组载体，如含有两个苤蓝基因BoPAP2和BoTT8的基因共表达载体；优选的，所述的基因共表达载体是以pBIN121载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入依次连接的CaMV35S启动子、BoPAP2开放阅读框、Nos终止子、Nos终止子、BoTT8开放阅读框和CaMV35S启动子而构建成的。
所述基因共表达载体的制备方法，作为示例，可包括如下步骤：
a.以含有SEQ ID No.3的BoPAP2基因的重组质粒为模板，以SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8为引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后用Sac I和Xba I进行双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoPAP2；
b.以含有SEQ ID No.6的BoTT8基因的重组质粒为模板，以SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10为引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后用SacI和XbaI双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8；
c.以重组质粒pBI121::BoPAP2为模板，以SEQ ID No.11和SEQ ID No.12为引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后用EcoRI酶切，再与经同样酶切的pBI121::BoTT8载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8::BoPAP2，即为双基因表达载体。
所述含SEQ ID No.3的重组质粒，作为示例，可由如下方法制备：提取苤蓝幼叶总RNA，再以反转录得到的cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物进行扩增，将扩增产物与pMD-T载体连接，得含SEQ ID No.3的重组质粒。
所述含SEQ ID No.6的重组质粒，作为示例，可由如下方法制备：提取苤蓝幼叶总RNA，再以反转录得到的cDNA为模板，以SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物进行扩增，将扩增产物与pMD-T载体连接，得含SEQ ID No.6的重组质粒。
本发明的目的之三在于提供含有所述重组载体(优选为基因共表达载体)的微生物转化体，其可通过用相应的重组质粒(如pBI121::BoTT8::BoPAP2)转化受体制备得到，受体可为农杆菌如农杆菌LBA4404，作为所述微生物转化体的制备示例，其制备方法包括如下步骤：
a、通过低温CaCL2处理的方法制备LBA4404感受态细胞
b、将重组质粒pBI121::BoTT8::BoPAP2与LBA4404感受态细胞混匀
c、通过冻融法将重组质粒导入农杆菌感受态细胞
d、将转化的细胞培养物涂布在含抗生素(如利福平+链霉素+卡那霉素)的YEB固体平板培养基
e、28℃倒置培养直至形成大小合适的单菌落
f、挑取多个单菌落，用含有抗生素(如利福平+链霉素+卡那霉素)的YEB液体培养基震荡培养
g、提取震荡培养得到的菌株的质粒，酶切提取的质粒，鉴定得到含有pBI121::BoTT8::BoPAP2重组质粒的工程菌株。
本发明的目的之四在于提供所述的BoPAP2和/或所述的BoTT8、含其的所述重组载体、或含其的所述微生物转化体用于下述至少一种用途：
1)上调微型番茄基因slDFR和/或SlANS的表达水平；
2)提高微型番茄中花青素和/或花色苷的含量；
3)培育紫色微型番茄品种。
所述BoPAP2或所述BoTT8，均通过两基因彼此联用的形式，实现上述用途，比如BoPAP2与BoTT8形成前述的重组载体，或进一步形成前述的微生物转化体。
所述上调slDFR和/或SlANS的表达水平，和/或，提高花青素和/或花色苷的含量，可表现在微型番茄的下述至少一处部位：幼叶、成熟叶、幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及茎。
所述紫色微型番茄品种，含义如本领域常规理解，如相比导入所述苤蓝基因前的微型番茄，在下述至少一处部位表现地更紫：幼叶、成熟叶、幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及茎。也可通过前述表达水平上调(slDFR等)和/或含量提高(花青素等)来确证获得本品种。作为示例，其最典型特征的是：果实为紫色。
本发明还提供了培育所述紫色微型番茄的方法，包括将所述的苤蓝基因BoTT8和权利要求2所述的苤蓝基因BoPAP2导入微型番茄(常规野生型即可)中共表达；所述共表达的实现方式可为苤蓝基因BoPAP2与BoTT8形成前述的重组载体(如基因共表达载体)，或形成前述的微生物转化体；
导入微型番茄的方法，可包括如下步骤：
a、制备含有微生物转化体的悬浮液
b、切取番茄子叶获得番茄外植体
c、将经过预处理的番茄外植体浸泡于所述微生物转化体的悬浮液中进行侵染
d、将侵染后的外植体在MS固体培养基中进行培养和筛选，直至脱分化长出具有卡那霉素抗性的再生芽
e、将所述具有卡那霉素抗性的再生芽切下，转入含有卡那霉素的生根培养基中，得到能够生根的阳性株系
f、对阳性株系进行PCR鉴定筛选，得到转基因的紫色微型番茄株系。
作为导入微型番茄的方法的更具体示例，本发明的方法包括如下步骤：
a、制备含有pBI121::BoTT8::BoPAP2重组质粒的农杆菌工程菌悬浮液
b、制备无菌的微型番茄种子并培养于MS/2固体培养基中(MS/2含义即本领域常称的培养基成分中“大量元素减半,其余组分用量不变”)
c、切取对应的番茄子叶获得番茄外植体
d、用含有激素(如激动素和2,4-D的复合激素)的MS液体培养基浸泡处理番茄外植体1h
e、吸干残留液体，将外植体放于含激素(如吲哚乙酸+玉米素的复合激素)的MS固体培养基中预培养1d
f、将经过预处理的外植体浸泡于农杆菌工程菌悬浮液中10min进行侵染
g、吸干残留菌液，将外植体放于原来的MS固体培养基中共培养2d
h、将外植体插入含有多种抗生素和激素的MS固体筛选培养基中培养
i、将长出的抗性愈伤组织继代培养，直至脱分化长出具有卡那霉素抗性的再生芽
j、将一定长度的再生芽切下转入含有卡那霉素的生根培养基中，能够生根的株系即为阳性株系
k、对阳性株系进行PCR鉴定筛选，得到转基因番茄株系。
鉴定可通过检测pBI121::BoTT8::BoPAP2载体中的报告基因NPTII或番茄内参基因SlCAC的表达情况确定。
另需说明的是，本发明所涉质粒或微生物载体，均可购买得到，也可自制。
本发明的有益效果在于：
本发明独辟蹊径，通过大量、繁杂的试错和筛选，最终选用了分离获得的两个来自苤蓝基因的BoPAP2和BoTT8，利用这两个基因开放阅读框构建了双基因共表达载体，将该载体转入微型番茄(Micro-Tom)，经多水平验证确认，所得的转基因番茄阳性植株中外源基因BoPAP2和BoTT8均得到显著表达，整个植物都呈现花青素的显著积累，成功获得了富含花青素的转基因微型番茄新品种，这对于高等植物基因工程领域的技术人员来说，是非常难以预料的；
而与传统育种方法相比，本发明采用基因工程技术，定向且高效地激活了转基因番茄植株中花青素的合成，为微型番茄的观赏品种改良做出了有益的探索，也为其他观赏植物的育种提供了参考和借鉴，所得的富含花青素的彩色微型番茄具有良好的市场前景和经济价值。
附图说明
为了使本发明的目的、技术路线图和优点更加明晰，以下内容将结合附图以对本发明作进一步的细致描述，其中：
图1为重组质粒pBI121::BoTT8::BoPAP2构建示意图。
图2为苤蓝BoTT8和BoPAP2基因PCR产物凝胶电泳分析图，其中a为BoPAP2基因全长的琼脂糖凝胶电泳分析图；b为BoTT8基因全长的琼脂糖凝胶电泳分析图；DNA分子量标准(Marker)如右侧泳道所示。
图3为重组质粒酶切产物凝胶电泳分析图，其中a为重组质粒pBI121::BoPAP2双酶切(Sac I和Xba I)产物的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中泳道1表示Marker，泳道2表示酶切产物；b为重组质粒pBI121::BoTT8双酶切(Sac I和Xba I)产物的琼脂糖凝胶电泳分析图，其中泳道1表示酶切产物，泳道2表示未酶切的质粒，泳道3表示Marker。
图4为RT-qPCR检测NPTII报告基因在转基因番茄植株中的表达情况(纵坐标表示相对表达水平，横坐标的WT表示非转基因番茄，T1、T2、T3、T4和T5为独立的转基因番茄株系，SlCAC为内参基因)。
图5为外源基因BoTT8和BoPAP2在转基因微型番茄阳性植株中的表达情况分析(纵坐标表示相对表达水平，横坐标的WT表示非转基因番茄，T1、T2、T3、T4和T5为独立的转基因番茄株系，SlCAC为内参基因)；其中a为BoPAP2在转基因番茄阳性植株中的表达情况分析；b为BoTT8在转基因番茄阳性植株中的表达情况分析。
图6为野生微型番茄和转基因微型番茄阳性植株表性分析。a表示转基因微型番茄植株发育后期果实表型，其中未成熟的果实呈现紫色，而成熟果实呈现为黑紫色；b表示野生型微型番茄植株发育后期果实表型，其中未成熟的果实呈现青绿色，而成熟果实呈现为橙红色；c为转基因微型番茄植株幼苗期表型；d为野生型微型番茄植株幼苗期表型；e表示不同发育时期花中的花青素积累情况，上半部分表示的为野生型材料，上半部分表示的为转基因材料；f表示果实成熟期果皮中的花青素积累情况，上半部分表示的为野生型材料，上半部分表示的为转基因材料。
图7为花青素在转基因微型番茄不同株系的果皮中的合成情况分析(纵坐标表示相对表达水平，横坐标的WT表示WT为非转基因番茄，T1、T2、T3、T4和T5为独立的转基因番茄株系)。其中a为不同转基因番茄株系的果皮中花青素总含量的分析测定；b为SlDFR在不同转基因番茄株系的果皮中的表达情况分析；c为SlANS在不同转基因番茄株系的果皮中的表达情况分析。
具体实施方式
以下内容为结合附图对本发明的优选实施例进行的细致描述。优选实施例中若并未注明实验的方法和具体条件，通常按照分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克(Sambrook.J.)，D.W.拉塞尔著；黄培堂等译科学出版社，2008年)中所述的条件或者制造商所推荐的条件。
本发明中使用的番茄品种为微型番茄(Micro-Tom)。pMD-T载体为宝生物(Takara)公司产品，pBI121载体和根癌农杆菌LBA4404为本实验室保存；RNAiso、反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、PrimeSTARMAX DNA聚合酶均为大连宝生物公司产品；限制性内切酶为Thermofisher公司产品；T4DNA连接酶位Promega公司产品；DNA提取试剂盒与PCR产物纯化试剂盒为OMEGA公司产品。
一、苤蓝基因BoPAP2全长序列克隆
提取紫苤蓝幼叶总RNA，然后根据反转录试剂盒说明书，以oligodT为引物合成cDNA。然后根据Brassica database数据库中甘蓝基因PAP2序列，设计克隆引物BoPAP2c-F和BoPAP2c-R，引物序列如下：
BoPAP2c-F：5'-gacgtctagacttatattatatatcgctgg-3'(SEQ ID No.1)；
BoPAP2c-R：5'-tgatgagctcaaaagtcactatgtcacaca-3'(SEQ ID No.2)；
以反转录得到的cDNA为模板，以BoPAP2c-F和BoPAP2c-R为引物，PCR扩增苤蓝BoPAP2基因全长，PCR反应体系为：5×PCR Buffer 5μL、dNTPs(10μM each)1.0μL、BoPAP2c-F和BoPAP2c-R(10μM)引物各1.0μL、模板(cDNA)1.0μL、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 15.5μL、共25μL。PCR反应程序设置为：然后98℃变性15秒，62℃退火15秒，72℃延伸30秒，共30个循环。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析拍照，如图2a所示。而后将产物采用PCR产物纯化试剂盒(OMEGA)回收纯化，将纯化的DNA产物与pMD-T载体连接，获得重组质粒pMD-T::BoPAP2。将上述质粒进行测序，获得836bp的苤蓝BoPAP2全长序列(SEQ ID No.3)。
二、苤蓝基因BoTT8全长序列克隆
提取紫苤蓝幼叶总RNA，然后根据反转录试剂盒说明书，以oligodT为引物合成cDNA。然后根据Brassica database数据库中甘蓝基因TT8序列，设计克隆引物BoTT8c-F和BoTT8c-R，引物序列如下：
BoTT8c-F：5'-cgtctctagaatggatgaat-3'(SEQ ID No.4)；
BoTT8c-R：5'-atcagagctcttagaatctaggaa-3'(SEQ ID No.5)；
以反转录生成的cDNA为模板，以BoTT8c-F和BoTT8c-R为引物，PCR扩增苤蓝BoTT8基因全长序列，PCR反应体系如下：5×PCR Buffer 5μL、dNTPs(10μM each)1.0μL、BoTT8c-F和BoTT8-R(10μM)引物各1.0μL、模板(cDNA)1.0μL、PrimeSTARMAX DNA聚合酶0.5μL，ddH2O15.5μL、共25μL。PCR反应程序设置为：然后98℃变性15秒，54℃退火15秒，72℃延伸50秒，共30个循环。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析成像，结果如图2b所示。而后将PCR产物用PCR产物纯化试剂盒(OMEGA)回收纯化，将纯化的DNA片段与pMD-T载体连接，获得重组质粒pMD-T::BoTT8。将上述质粒进行测序，获得1600bp的苤蓝BoTT8全长序列(SEQ ID No.6)。
三、构建BoTT8和BoPAP2基因的共表达载体
根据pBI121载体的多克隆位点和获得的BoTT8和BoPAP2基因序列，设计构建含BoTT8和BoPAP2基因的共表达载体引物，具体序列如下：
BoMYB2o-F：5'-gacgtctagacttatattatatatcgctgg-3'(SEQ ID No.7)，下划线标注部分为Xba I酶切位点。
BoMYB2o-R：5'-tgatgagctcaaaagtcactatgtcacaca-3'(SEQ ID No.8)，下划线标注部分为Sac I酶切位点。
BoTT8o-F：5'-cgtctctagaatggatgaattaagtattatacc-3'(SEQ ID No.9)，下划线标注部分为Xba I酶切位点。
BoTT8o-R：5'-atcagagctcttagaatctaggaactagagttt-3'(SEQ ID No.10)，下划线标注部分为Sac I酶切位点。
ORF-F：5'-cggaattcgcaggtccccagattagc-3'(SEQ ID No.11)，下划线标注部分为EcoRI酶切位点。
ORF-R：5'-acgccagggttttcccagtcacga-3'(SEQ ID No.12)。
以pMD-T::BoPAP2重组质粒为模板，以BoMYB2o-F和BoMYB2o-R为引物，配置PCR反应体系如下：5×PCR Buffer 10μL、dNTPs(10μM each)2.0μL、BoTT8c-F和BoTT8-R(10μM)引物各2.0μL、模板(cDNA)2.0μL、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 31.5μL、共50μL。PCR反应程序设置为：然后98℃变性15秒，64℃退火15秒，72℃延伸30秒，共35个循环。扩增PCR产物为两侧分别带有Xba I和Sac I酶切位点的BoPAP2全长序列；试剂盒纯化后用Sac I和Xba I酶切，再与经过同样酶切处理的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoPAP2，将上述质粒进行Sac I和Xba I酶切验证，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3a。酶切验证正确的质粒进行测序验证。
以pMD-T::BoTT8重组质粒为模板，以Bo TT8o-F和Bo TT8o-R为引物，配置PCR反应体系如下：5×PCR Buffer 10μL、dNTPs(10μM each)2.0μL、Bo TT8o-F和Bo TT8o-R(10μM)引物各2.0μL、模板(cDNA)2.0μL、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 31.5μL、共50μL。PCR反应程序设置为：然后98℃变性15秒，66℃退火15秒，72℃延伸60秒，共35个循环。扩增PCR产物为两侧分别带有Xba I和Sac I酶切位点的BoTT8全长序列；试剂盒纯化后用Sac I和Xba I酶切，再与经过同样酶切处理的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8，将上述质粒进行Sac I和Xba I酶切验证，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3b。酶切验证正确的质粒进行测序验证。
以pBI121::BoPAP2重组质粒为模板，以ORF-F和ORF-R为引物，配置PCR反应体系如下：5×PCR Buffer 10μL、dNTPs(10μM each)2.0μL、ORF-F和ORF-R(10μM)引物各2.0μL、模板(cDNA)2.0μL、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 31.5μL、共50μL。PCR反应程序设置为：然后98℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸120秒，共35个循环。扩增PCR产物为两侧分别带有Xba I和Sac I酶切位点的BoPAP2全长序列；试剂盒纯化后用Sac I和Xba I酶切，再与经过同样酶切处理的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoPAP2，将上述质粒进行测序验证。
以pMD-T::BoPAP2重组质粒为模板，以BoMYB2o-F和BoMYB2o-R为引物，配置PCR反应体系如下：5×PCR Buffer 10μL、dNTPs(10μM each)2.0μL、BoTT8c-F和BoTT8-R(10μM)引物各2.0μL、模板(cDNA)2.0μL、PrimeSTAR MAX DNA聚合酶0.5μL，ddH2O 31.5μL、共50μL。PCR反应程序设置为：然后98℃变性15秒，64℃退火15秒，72℃延伸30秒，共35个循环。扩增PCR产物为包含35S启动子，BoPAP2全长序列和NOS终止子的序列，在PCR产物5’端和靠近3’端的内侧带有EcoRI内切酶点；试剂盒纯化后用EcoRI酶切，再与经过同样酶切处理的pBI121::BoTT8载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8::BoPAP2，该载体的构建路线图见图1。将构建成功的重组质粒进行测序验证。
四、含苤蓝BoTT8和BoPAP2基因的共表达载体转化农杆菌
将取-80℃保存的根癌农杆菌LBA4404接种于含有1.5％(w/w)琼脂、50mg/L利福平和500mg/L链霉素的LB固体培养基上，28±0.5℃黑暗条件下培养2-3天直至长出单菌落；挑取农杆菌LBA4404单菌落接种于20ml YEB液体培养基中(50mg/L利福平和500mg/L链霉素)，200rpm 28℃振荡培养1.5天；取1ml接种于50ml YEB液体培养基中(50mg/L利福平和500mg/L链霉素)，在200rpm转速和28℃条件下振荡培养至OD600介于0.5-0.8之间。将菌液转入无菌离心管，5000rpm转速4℃条件下离心10min后去上清液。向离心管加入10ml预先4℃冷却的CaCl2溶液(0.1M/L)，轻柔悬浮细胞沉淀后冰上放置10min。4℃条件下5000rpm离心5min，除去上清后加入2ml预冷的CaCl2溶液(含15％甘油)。轻轻悬浮菌体后将农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管100μl液氮速冻后储存于-80℃。取1μg左右的重组质粒pBI121::BoTT8::BoPAP2加入到100ml的LBA440105感受态细胞中，轻柔混匀后依次冰浴30min，-80℃放置5min，37℃水浴5min，冰浴2min，最后加入700μl的YEB液体培养基在28℃，200rpm转速下摇培2小时后涂在含50mg/L利福平，500mg/L链霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB平板培养基上，28℃倒置培养直至形成单菌落。挑取2-3个单菌落，用含有50μg/ml利福平、500μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB液体培养基，在28±1℃和200rpm条件下震荡培养1.5天至OD600为2.0，提取重组质粒，用EcoRI进行酶切鉴定，阳性克隆即为pBI121::BoTT8::BoPAP2农杆菌工程菌株，将制备好的15％甘油工程菌冻存于-80℃备用。
五、农杆菌介导的pBI121::BoTT8::BoPAP2表达载体转化微型番茄
将含有pBI121::BoTT8::BoPAP2的农杆菌工程菌株接种于含有质量分数为1.5％的琼脂、50μg/ml利福平、500μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB固体培养基中，在28±1℃条件下活化2-3天直至形成单菌落，接种单菌落于20mL含有50μg/ml利福平、500μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB液体培养基中，在28±1℃、200rpm条件下培养1.5天，取1ml菌液转接于100ml含有50μg/ml利福平、500μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的YEB液体培养基中，在28±1℃、200rpm条件下扩大培养至OD600介于1.5-2.0，然后在28±1℃和5000rpm条件下离心菌液，弃上清后用新鲜的YEB液体培养基洗涤菌体沉淀，然后在28±1℃和3000rpm条件下离心菌液，弃上清后用含有质量分数为3％的蔗糖、pH为5.8的MS溶液30mL重悬菌体，制得农杆菌工程菌悬浮液。
用70％的酒精浸泡微型番茄种子30秒，无菌水冲洗3次；在用有效氯浓度为1％的NaClO水溶液浸泡种子10min，无菌水冲洗6次；无菌水浸泡种子24h后播种在MS/2固体培养基上，在参数设置为26℃(16h光照)/20℃(8h黑暗)光照培养箱中培养至番茄子叶展平，切取对应的番茄子叶即得到番茄外植体。将番茄外植体在MS液体培养基(含20μg/ml激动素、5μg/ml 2,4-D)中浸泡1h，用滤纸吸干残留液体后放置于含3％蔗糖、0.8％琼脂、1μg/ml吲哚乙酸、1.75μg/ml玉米素、pH为5.8的MS固体培养基中，26℃(16h光照)/20℃(8h黑暗)预培养1天后置于农杆菌工程菌液中浸染10分钟，然后放回原来的MS固体培养基中，在28±1℃条件下暗光培养48小时，再转入含有3％蔗糖、0.8％琼脂、1.0μg/ml吲哚乙酸、1.75μg/ml玉米素、500μg/ml羧苄青霉素和100μg/ml卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在26℃(16h光照强度5000-8000lx)/20℃(8h黑暗)条件下培养至形成愈伤组织与再生芽；将长3-4cm的再生芽切下接入含有3％蔗糖、0.8％琼脂、500μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml卡那霉素、pH为5.8的MS固体培养基中，在26℃(16h光照强度5000-8000lx)/20℃(8h黑暗)条件下培养至生根，即为得到的转基因微型番茄植株(T0代),繁殖得到下一代植株T1-T5。
六、转基因微型番茄阳性株系的鉴定
1.RT-qPCR技术检测NPTII报告基因在转基因番茄株系中的表达情况
根据载体pBI121::BoTT8::BoPAP2中的NPTII基因和番茄内参基因SlCAC序列，设计如下引物：
NPTII-F：5'-gacaatcggctgctctga-3'(SEQ ID No.13)；
NPTII-R：5'-aactccagcatgagatcc-3'(SEQ ID No.14)。
qCAC-F：5'-cctccgttgtgatgtaactgg-3'(SEQ ID No.19)；
qCAC-R：5'-attggtggaaagtaacatcatcg-3'(SEQ ID No.20)。
分别提取野生番茄和不同转基因番茄株系果实的总RNA，以反转录得到的cDNA为模板、以NPTII-F和NPTII-R为引物进行RT-qPCR检测分析。配置PCR反应体系如下：2×PCRMix10μL、NPTII-F和NPTII-R(10μM)引物各1.0μL、模板(cDNA)1.0μl、ddH2O 7μL，共20μL。PCR反应程序设置为,然后95℃变性5分钟，然后95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸15秒，共40个循环，紧接着PCR产物在60-95℃区间内溶解曲线的绘制。最终的PCR产物通过测序验证的确为NPTII基因序列，再以SlCAC为内参基因计算分析NPTII基因在野生番茄和不同转基因番茄株系果实的表达量。从图4中可以看出，NPTII基因在T1-T5的株系中大量表达，野生型番茄中未见明显的表达，可见T1-T5确实为转基因阳性株系。
2.RT-qPCR检测BoTT8和BoPAP2基因在转基因微型番茄阳性株系中的表达
根据苤蓝BoTT8和BoPAP2基因序列序列，设计如下引物：
qBoPAP2-F：5'-ttccttgctcttataccacacc-3'(SEQ ID No.15)；
qBoPAP2-R：5'-gtcagcttctgccatgccatta-3'(SEQ ID No.16)；
qBoTT8-F：5'-cgtgcttgatggcgttt-3'(SEQ ID No.17)；
qBoTT8-R：5'-acttcgggtggttgtgga-3'(SEQ ID No.18)。
分别提取野生番茄和不同转基因番茄株系果实的总RNA，以反转录得到的cDNA为模板、分别以qBoPAP2-F和qBoPAP2-R，qBoTT8-F和qBoTT8-R，qCAC-F和qCAC-R为引物进行RT-qPCR检测分析。结果如图5所示，在转基因微型番茄果实中，qBoPAP2和qBoTT8基因都呈现高水平表达，而在野生材料中未见明显表达。这些结果说明外源基因qBoPAP2和qBoTT8成功导入微型番茄基因组中并获得高效表达。
六、转基因微型番茄表型分析
将筛选鉴定的转基因微型番茄阳性株系和非转基因微型番茄在温室中按照一致的条件培养，主要参数设置为：26℃(16h光照)/20℃(8h黑暗)，分析转基因微型番茄与非转基因微型番茄植株中花青素的积累与相关的基因表达情况，结果图6和图7所示。
由图6可知，花青素在转基因微型番茄发育的幼苗期开始，就有显著的积累(图6c)。花青素广泛分布于包括幼叶、成熟叶，幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及茎等各个组织(图6a)。与此相反，非转基因微型番茄植株在整个发育史中均未观察到明显的花青素着色(图6b和d)。此外，转基因微型番茄果实的随着发育的进程逐渐由蓝紫色渐变为黑紫色，在色彩上呈现出更靓丽的观赏价值(图6a和f)。值得一提的是，转基因微型番茄的花瓣着色也会随着发育进程不断变化(图6f)。由此可知，紫色的转基因微型番茄的培育有效地丰富了观赏番茄的种质资源。由于紫色的植株与果实具有更好的观赏价值，从而转基因微型番茄会具有更好的市场应用前景。
为了更加细致的描述转基因微型番茄在花青素着色上的特点，我们对转基因和非转基因微型番茄成熟果皮的花青素总量和相关基因的表达水平进行了进一步的分析。由图7a可知，转基因番茄成熟果皮中的花色苷鲜重总含量达到1.6mg/g，而非转基因果皮中则未有明显的花青素被检测到。为了证明苤蓝基因BoTT8和BoPAP2在番茄中能够有效地激活花青素的合成，我们在转基因和非转基因微型番茄中采用RT-qPCR检测了花青素合成关键基因的表达情况。
根据番茄SlDFR和SlANS基因序列，设计如下引物：
qSlDFR-F：5'-gctggagcgatttggacttc-3'(SEQ ID No.21)；
qSlDFR-R：5'-cagccttctctgccagtatctt-3'(SEQ ID No.22)；
qSlANS-F：5'-ctaagcaacggaaagtacaagagc-3'(SEQ ID No.23)；
qSlANS-R：5'-cggtgacagtctcaggtaggg-3'(SEQ ID No.24)。
分别提取非转基因番茄和不同转基因番茄株系成熟果皮的总RNA，以反转录得到的cDNA为模板、分别以qSlDFR-F和qSlDFR-R，qSlANS-F和qSlANS-R，qCAC-F和qCAC-R为引物进行RT-qPCR检测分析。结果如图7b和c所示，相对于非转基因材料，在转基因微型番茄成熟果皮中，SlDFR和SlANS基因的表达水平都被显著地上调。这些结果说明外源基因qBoPAP2和qBoTT8是通过转录调控合成基因的表达进而激活花青素在转基因番茄中的大量合成积累。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110> 郑州大学
<120> 苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用
<160> 24
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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gacgtctaga cttatattat atatcgctgg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgatgagctc aaaagtcact atgtcacaca 30
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<211> 836
<212> DNA
<213> 苤蓝(Brassica oleracea var. gongylodes L.)
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gacgtctaga cttatattat atatcgctgg tccatggagg gtatgtccaa agggttgaaa 60
aaaggtgcat ggattgctga agaagataat ctcttgaggc aatgcattga taagtatgga 120
gaagggaaat ggcaccaagt tcctttaaga gctggtctaa atcggtgcag gaagagttgt 180
agactaagat ggttgaacta tttgaagcca agtatcaaga gaggaaaact caactctgat 240
gaagttgatc ttcttattcg ccttcataag cttttaggaa acaggtggtc tttaattgct 300
ggtagattac ccggtcggac cgccaatgac gtcaaaaatt actggaacac ccatttgagt 360
aagaaacatg aaccaggttg taagacccag atgaaaaaga gaaacattcc ttgctcttat 420
accacaccag cccaaaaaat cgacgttttc aaacctcgac ctcgatcctt aaccgttaac 480
aacggctgca gccatattaa tggcatgcca gaagctgaca ttgttcctct atgccttgga 540
ctcaacgaca ctaataatgt ttctgaaaat ataatcacat gtaacaaaga tgatgataaa 600
tttgagcttg ttagtaattt aatggatggt cagaataggt ggtgggaaag tttgctagat 660
gagagccaag atccagctgc gctctttcca gaagctacag caacaaaaaa gggcgcaacc 720
tccgcgtttg acgttgagca actttggagc ctgttggatg gagaaactgg aacttgatta 780
gtgtttccac tgtttgtttg tgcttgtgtg tgacatagtg acttttgagc tcatca 836
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtctctaga atggatgaat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atcagagctc ttagaatcta ggaa 24
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<213> 苤蓝(Brassica oleracea var. gongylodes L.)
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agaagagatt caagggctac ttaaggcggt ggtgcaatct gtggggtgga cttatagtgt 120
cttctggcaa ctttgtcctc aacgaaggaa attgttgtgg agtagtggaa actataacgg 180
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ggaagcgagg gcttgcacag cactgtcgcc ggaggatttg acggatcctg aatggtttta 360
tgtgctgtgt ttcacttact ctttcgaacc tccttctggg atgccaggaa aggcgtatgc 420
gaggaggaag cacatatggc taagtggtgc aaatgaggtt gacaataaaa tcttctctag 480
ggctatttct gcaaagagtg ccaaaattca gacagtggtt tgcattcccg tgcttgatgg 540
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aaagagtttc ttccacaact acccgaagtc aaacactaag cctactcttt ctgaacactt 660
catcaacgaa gagcgtgaag aagacgaaga cgaagtagaa gaagaagaaa tgacaatgtc 720
agaggagata agacttggtt ctcctgatga cgatgacgtc tccaatcaaa atctactctc 780
tgatttccat atagaagcaa ccaatagttt agatacacac atggacatga tgaatctaat 840
ggaggaaggc ggaaattatt ctcagacagt atcaacactt ctcatgtcac aacccaccag 900
tcttctttca gattcagttt ccacatcttc ttacgttcaa tcatcgttta tatcgtggag 960
agttgagaat gtcaaagagc atcagcaata tcagcgagtg gaaaaagcgg cgtcttcgtc 1020
gtcgcaatgg atgctcaaac acataatctt gaaagttcct ttcctccacg acaacactaa 1080
aaataagagg ctgccgcgag aagagcttaa ccatgtggtg gccgagcgac gcagaagaga 1140
gaagctaaat gagagattca taacgttgag atcattggtt ccatttgtga ccaagatgga 1200
taaagtctcg atccttggag acaccattga gtacgtaaac catctttcta agaggatcca 1260
tgagctggaa tctactcatc acgagccaaa ccaaaagcgg atgcgtatcg gtaagggaag 1320
aacttgggaa gaggtggagg tttccattat agagagcgat gttttgttag agatgagatg 1380
cgagtaccga gatggtttat tgctcaacat tcttcaggta cttaaggagc taggtataga 1440
gaccactgcg gttcacaccg ccttgaacga ccaccatttt gaggcagaga taagggcgaa 1500
agtgagaggg aagaaaccaa ccattgctga ggttaaaata gccatccatc aaatcatata 1560
taataataaa ctctagttcc tagattctaa gagctctgat 1600
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Claims (9)

1.基因共表达载体，其特征在于：其为SEQ ID No.3所示BoPAP2和SEQ ID No.6所示BoTT8基因的共表达载体，所述共表达载体是以pBIN121载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入依次连接的CaMV35S启动子、BoPAP2开放阅读框、Nos终止子、Nos终止子、BoTT8开放阅读框和CaMV35S启动子而构建成的。
2.微生物转化体，其通过将权利要求1所述的基因共表达载体转化农杆菌LBA4404制得。
3.紫色微型番茄的培育方法，包括将SEQ ID No.6所示的苤蓝基因BoTT8和SEQ IDNo.3所示的苤蓝基因BoPAP2导入微型番茄中共表达。
4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述共表达的实现方式为苤蓝基因BoPAP2与BoTT8形成权利要求1所述的基因共表达载体，或形成权利要求2所述的微生物转化体。
5.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述紫色微型番茄相比导入所述苤蓝基因前的微型番茄，在微型番茄选自幼叶、成熟叶、幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及茎的至少一处部位，表现出下述至少一种特征：
1)上调微型番茄基因SlDFR和/或SlANS的表达水平；
2)提高微型番茄中花青素和/或花色苷的含量。
6.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述紫色微型番茄相比导入所述苤蓝基因前的微型番茄，在下述至少一处部位表现地更紫：幼叶、成熟叶、幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及茎。
7.根据权利要求3-6任一项所述的培育方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
a、制备含有微生物转化体的悬浮液
b、切取番茄子叶获得番茄外植体
c、将经过预处理的番茄外植体浸泡于所述微生物转化体的悬浮液中进行侵染
d、将侵染后的外植体在MS固体培养基中进行培养和筛选，直至脱分化长出具有卡那霉素抗性的再生芽
e、将所述具有卡那霉素抗性的再生芽切下，转入含有卡那霉素的生根培养基中，得到能够生根的阳性株系
f、对阳性株系进行PCR鉴定筛选，得到转基因的紫色微型番茄株系。
8.权利要求2所述的微生物转化体的制备方法，包括如下步骤：
a、通过低温CaCL2处理的方法制备LBA4404感受态细胞
b、将权利要求3所述的基因共表达载体与LBA4404感受态细胞混匀
c、通过冻融法将基因共表达载体导入所述感受态细胞
d、将转化的细胞培养物涂布在含抗生素的YEB固体平板培养基
e、倒置培养直至形成单菌落
f、挑取单菌落，用含有抗生素的YEB液体培养基震荡培养
g、提取震荡培养得到的菌株的质粒，酶切提取的质粒，鉴定得到含有所述基因共表达载体的工程菌株。
9.权利要求1所述的基因共表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.以含有所述基因BoPAP2的重组质粒为模板，以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物进行PCR扩增，将扩增产物用Sac I和Xba I双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoPAP2；
b.以含有所述基因BoTT8的重组质粒为模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物进行PCR扩增，将扩增产物纯化后用Sac I和Xba I双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8；
c.以重组质粒pBI121::BoPAP2为模板，以SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物进行PCR扩增，将扩增产物用EcoR I酶切，再与经同样酶切的pBI121::BoTT8载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8::BoPAP2。
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