CN111172174A - OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用，所述OsUGE3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述性状包括株高、生物量、分蘖数以及抗倒伏能力，所述应用为利用所述OsUGE3基因构建超表达水稻植株，并成功构建了超表达OsUGE3基因的水稻，研究显示，超表达OsUGE3基因可显著提高水稻株高、生物量、分蘖数以及抗倒伏能力，这一结果为培育优良性状水稻提供一种全新的并且简单有效的方法。

Description

OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用。

背景技术

多糖是植物细胞壁的主要组份，在维持细胞的形态、机械强度和抗逆性等方面起重要的作用。植物细胞壁多糖由供体单糖在糖基转移酶的作用下合成，其组成结构复杂多变，在不同的物种中或同一物种的不同生长发育阶段都不相同。尽管多个参与细胞壁多糖合成的糖基转移酶已经被鉴定，但其供体单糖的来源机制仍不清楚。UDP-Gal/Glu差向异构酶(UGE)通过催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的相互转化，可能为细胞壁多糖的合成以及糖蛋白和糖脂的糖基化修饰提供了供体糖。

尽管据报道UGE的无效突变体显示出植物生长受阻，但是UGE超表达对植物生长的影响仍然未知。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用，所述OsUGE3基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述性状包括株高生物量、分蘖数以及抗倒伏能力，所述应用为利用所述OsUGE3基因构建超表达水稻植株。

进一步的，利用上述OsUGE3基因构建转基因水稻植株，包括如下步骤：

用BamHI和XbaI对水稻OsUGE3基因全长CDS序列以及超表达载体pCAMBIA1300s双酶切后，得到酶切后的载体和目的基因片段，通过T4 DNA连接酶连接酶切后的载体和目的基因片段，将连接产物转化至大肠杆菌感受态，确定构建正确的超表达载体，通过农杆菌介导法转染至待转化水稻品系，经选择、分化、生根、炼苗、移栽，获得超表达水稻植株。

更进一步的，具体包括如下步骤：

S1，提取水稻mRNA并反转录合成cDNA；

S2，以合成的cDNA为模板，利用特异性引物进行扩增，获得OsUGE3基因全长CDS序列，所述引物序列如下：

正向引物：5’-TTTGGATCCATGGTGAGCGGCGGAGGAGT-3’；

反向引物：5’-AAATCTAGACTAATTCTGCTCAGCATTGG-3’；

S3，用BamH I和XbaI分别对超表达载体pCAMBIA1300s和上述获得的OsUGE3基因的CDS序列片段进行双酶切，酶切后的载体和目的基因片段分别回收，将回收的载体片段和目的基因片段按摩尔浓度比1：3进行混合，在T4 DNA连接酶作用下进行连接，于16℃条件下连接3小时，将构建的连接产物转化大肠杆菌感受态，提取转化后的大肠杆菌质粒进行BamH I和XbaI双酶切鉴定，酶切后获得目的片段大小的载体为构建正确的超表达载体。

S4，将上述构建正确的超表达载体转化农杆菌感受态，提取转化后的农杆菌质粒，将其再次转化大肠杆菌感受态，并提取大肠杆菌质粒进行酶切检测，确定构建正确的超表达载体转入农杆菌中，获得重组农杆菌；

S5，将S4获得的重组农杆菌转染至水稻品系，经选择培养、分化培养、生根培养、炼苗、移栽，获得转基因水稻植株。

进一步的，扩增程序为：模板cDNA 5μl；2×KOD buffer 25μl；dNTP 4μl；正向引物1.5μl；反向引物1.5μl；KOD 2μl；ddH2O11μl。

更进一步的，PCR反应扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，29次循环；72℃延伸5min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明构建了超表达OsUGE3基因的水稻，研究显示，超表达OsUGE3基因可显著提高水稻株高、生物量、分蘖数以及抗倒伏能力，这一结果为培育优良性状水稻提供一种全新的并且简单有效的方法，可投入大规模推广使用。

附图说明

图1为野生型与超表达株系OsUGE3基因相对表达量比较。

图2为野生型与超表达OsUGE3株系性状，其中，A株高、B生物量、C分蘖数、D倒伏指数比较。

图3为野生型与超表达OsUGE3株系表型鉴定。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

超表达OsUGE3基因的水稻的构建

1.检索基因序列，从水稻基因组注释数据库TIGR检索获得水稻OsUGE3的完整CDS序列，如SEQ ID NO.1所示；结合所使用超表达载体多克隆酶切位点信息和OsUGE3基因CDS序列，利用Primer 5软件设计扩增OsUGE3基因全长CDS的引物，

正向引物：5’-TTTGGATCCATGGTGAGCGGCGGAGGAGT-3’；如SEQ ID NO.2所示；

反向引物：5’-AAATCTAGACTAATTCTGCTCAGCATTGG-3’；如SEQ ID NO.3所示。

2.OsUGE3基因CDS序列的获得：以水稻品种kitaake基因组cDNA为模板，采用特异引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得水稻OsUGE3基因全长CDS序列。用琼脂糖凝胶电泳将目的基因DNA片段分离出来，胶回收获得目的基因DNA，测序后验证获得的目的基因DNA为OsUGE3基因的CDS序列，且无碱基突变。

PCR反应扩增体系为：

模板cDNA 5μl；2×KOD buffer 25μl；dNTP 4μl；正向引物1.5μl；反向引物1.5μl；KOD 2μl；ddH2O 11μl。

PCR反应扩增程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，29次循环；72℃延伸5min。

3.超表达载体构建：使用的超表达载体为pCAMBIA1300s，用BamH I和XbaI分别对超表达载体和上述获得的OsUGE3基因CDS序列片段进行双酶切，酶切后的载体和片段分别回收。将回收的载体片段和目的基因片段按摩尔浓度比1：3进行混合，在T4 DNA连接酶作用下进行连接，生化培养箱16℃连接3小时。将上述构建的连接产物转化大肠杆菌(DH5α)感受态，提取转化后的大肠杆菌质粒进行BamH I和XbaI双酶切鉴定，酶切后获得目的片段大小的载体为构建正确的超表达载体。

4.超表达载体转化农杆菌：将上述构建正确的超表达载体转化农杆菌(EHA105)感受态，提取转化后的农杆菌质粒，将其再次转化大肠杆菌(DH5α)感受态，并提取大肠杆菌质粒进行酶切检测，确定构建的超表达载体正确转入农杆菌中。

5.组织培养

1)愈伤组织诱导：选取饱满、无霉斑的成熟水稻kitaake种子去壳，先用无菌水冲洗3遍，然后用体积分数70％的乙醇处理1min，用无菌水冲洗3遍，每次30s，用0.1％升汞溶液消毒12min，用无菌水冲洗7遍，每次30s，将种子放在灭菌滤纸上吸干水分，然后用无菌镊子夹到诱导培养基上，28℃，暗培养4周以上。

2)愈伤组织继代培养：挑选颜色鲜亮、紧实且干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上暗培养10天，温度28℃。

3)农杆菌侵染：将构建好的农杆菌，划线培养活化一次，再预培养2天。然后转移至装有悬浮培养基的离心管里，涡旋振荡重悬农杆菌，调节农杆菌的悬浮液至OD600为0.9；挑选颜色鲜亮、紧实且干燥的胚性愈伤与农杆菌悬浮液混合，侵泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上，超净工作台上吹干；将愈伤放置在已铺有一层滤纸的共培养基上28℃培养3天。

4)选择培养：将共培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内，用灭菌的蒸馏水充分洗涤愈伤；将愈伤浸泡在含400mg/L羧苄青霉素的灭菌水中30min，不时摇动；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干水分，并在超净工作台中晾干；转移愈伤至含有50mg/L潮霉素的选择培养基上选择培养2次，每次2周(第一次羧苄青霉素筛选浓度为400mg/L，第二次为250mg/L)。

5)分化培养：将抗性愈伤转移至分化培养基上，光照下培养，温度28℃。

6)生根培养：剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基中，光培养2周以上，温度28℃。

7)待苗高10cm左右，根系发生较好，打开瓶盖，向瓶内注入无菌水，炼苗2天后，洗掉根上的残留培养基，移栽。在最初的几天，蒙上保鲜膜，避免强光照射，保持水分湿润。

6.超表达OsUGE3水稻转基因株系鉴定

1)阳性转基因株系鉴定：本发明共获得42株水稻再生苗，提取叶片DNA进行潮霉素标记PCR鉴定，共获得36个独立的转基因阳性株系。

2)OsUGE3基因上调转基因株系鉴定：以上述36个独立的转基因阳性株系为材料，取其抽穗期剑叶提取RNA，反转录获得cDNA，采用OsUGE3特异表达检测引物(引物序列)进行荧光定量PCR分析，结果发现转基因株系OXUGE3-3,OXUGE3-5和OXUGE3-9中OsUGE3基因的表达量分别是野生型中的11.46，13.15和14.85倍，结果如图1所示。

野生型与超表达OsUGE3株系株高、生物量、分蘖数以及抗倒伏能力比较如图2所示，图3为野生型与超表达OsUGE3株系表型鉴定，结果显示，超表达OsUGE3基因可显著提高水稻株高、生物量、分蘖数以及抗倒伏能力，这一结果为培育优良性状水稻提供一种全新的并且简单有效的方法。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 沈阳农业大学

<120> OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1122

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

atggtgagcg gcggaggagt agcggcggag aacggcgaga tggtggggaa cggggagggg 60

aggaagggtg cgggggcgag cgtgctggtg acggggggag cggggtacat cgggacgcac 120

acggtgctgc ggctgctgga gaaggggttc gcggtcaccg tcgtcgacaa cttccacaac 180

tccgtcccgg aggcgctcga ccgcgtccgc ctcatcgccg gcgccgccct ctccgcccgc 240

ctcgacttca tcgccgggga tctcaagagc aaggacgaca tggagaaggt gttcgccgcc 300

aagaggtatg acgccgtgat ccacttcgcc gggctgaagg cggtggggga gagcgtcgcg 360

cacccgcaga tgtactacga gaacaacgtc gccggcacca tgaacctcta ctccgccatg 420

accaagtacg gctgcaagaa gatagtgttc tcgtcgtcgg cgacggtgta cggccagccg 480

gagaagaccc cctgcgtcga ggattccaag ctgagcgctc tcaacccata cggcaccacc 540

aagctcgtcc tggagaacta cttccggcag gtgcaggccg ccgacccgga gatgagggtg 600

atcctgctca ggtacttcaa ccccatcggc gctcaccgga gcggcgacat cggggaggac 660

cccaggggca tccccaacaa ccttcttccg tacatccagc aggtcgccgt cggccgccgc 720

cccgagctca acgtctacgg cgtcgactac ccaaccaggg acggcaccgc gatcagggat 780

tacatacatg tagtggacct tgccgatggc cacattgccg cactggagaa gctcttcgct 840

actcctgaca ttggttgtgt ggcttacaat ctaggaacag ggtgtggaac aacggtgctc 900

gaggtggtga aggcgttcga ggaggcgtcc ggaaagaaaa ttcctatcaa gatttgcccc 960

agaagacctg gagattgcac tgaggtttac gcttccactg acaaggccaa gaaggagctc 1020

ggatggagtg ctcggtttgg aatagaggac atgtgcaggg accagtggaa ttgggccaag 1080

aagaatccgt acggatacag cgccaatgct gagcagaatt ag 1122

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttggatcca tggtgagcgg cggaggagt 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaatctagac taattctgct cagcattgg 29

Claims (5)

1.OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用，其特征在于，所述OsUGE3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述性状包括株高、生物量、分蘖数以及抗倒伏能力，所述应用为利用所述OsUGE3基因构建超表达水稻植株。

2.根据权利要求1所述OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用，其特征在于，利用所述OsUGE3基因构建超表达水稻植株，包括如下步骤：

用BamHI和XbaI对水稻OsUGE3基因全长CDS序列以及超表达载体pCAMBIA1300s双酶切后，得到酶切后的载体和目的基因片段，通过T4 DNA连接酶连接酶切后的载体和目的基因片段，将连接产物转化至大肠杆菌感受态，确定构建正确的超表达载体，通过农杆菌介导法转染至待转化水稻品系，经选择、分化、生根、炼苗、移栽，获得转基因水稻植株。

3.根据权利要求2所述OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1，提取水稻mRNA并反转录合成cDNA；

S2，以合成的cDNA为模板，利用特异性引物进行扩增，获得OsUGE3基因全长CDS序列，所述引物序列如下：

正向引物：5’-TTTGGATCCATGGTGAGCGGCGGAGGAGT-3’；

反向引物：5’-AAATCTAGACTAATTCTGCTCAGCATTGG-3’；

S3，用BamH I和XbaI分别对超表达载体pCAMBIA1300s和上述获得的OsUGE3基因的CDS序列片段进行双酶切，酶切后的载体和目的基因片段分别回收，将回收的载体片段和目的基因片段按摩尔浓度比1：3进行混合，在T4 DNA连接酶作用下进行连接，于16℃条件下连接3小时，将构建的连接产物转化大肠杆菌感受态，提取转化后的大肠杆菌质粒进行BamH I和XbaI双酶切鉴定，酶切后获得目的片段大小的载体为构建正确的超表达载体；

S4，将上述构建正确的超表达载体转化农杆菌感受态，提取转化后的农杆菌质粒，将其再次转化大肠杆菌感受态，并提取大肠杆菌质粒进行酶切检测，确定构建正确的超表达载体转入农杆菌中，获得重组农杆菌；

S5，将S4获得的重组农杆菌转染至水稻品系，经选择培养、分化培养、生根培养、炼苗、移栽，获得超表达水稻植株。

4.根据权利要求1所述的OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用，其特征在于，S2中，PCR反应扩增体系为：

模板cDNA 5μl；2×KOD buffer 25μl；dNTP 4μl；正向引物1.5μl；反向引物1.5μl；KOD2μl；ddH2O11μl。

5.根据权利要求4所述的OsUGE3基因在改善水稻性状中的应用，其特征在于，PCR反应扩增程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，29次循环；72℃延伸5min。

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