CN113366112A

CN113366112A - 塔格糖的酶法生产

Info

Publication number: CN113366112A
Application number: CN201980084028.9A
Authority: CN
Inventors: D·J·维歇莱茨基
Original assignee: Bonumos Co ltd
Current assignee: Bonumos Co ltd; Bonumose Inc
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2021-09-07
Also published as: US20210388404A1; EP3867393A4; KR20210096084A; MX2021004035A; WO2020081959A1; JP2022512728A; CA3117105A1; BR112021007438A2; AU2019362044A1; JP2024075570A; MA53928A; EP3867393A1

Abstract

本发明公开了制备塔格糖的改进方法，其包括步骤：由F6PE催化将F6P转化为T6P；由T6PP催化将T6P转化为塔格糖，使用与以前在生产塔格糖的方法中使用的F6PE和T6PP相比具有更高活性的酶。

Description

塔格糖的酶法生产

相关申请案的交叉引用

本申请要求2018年10月19日提交的美国申请号62/747,877和于2019年1月10日提交的美国申请号62/790,788的优先权，每个均通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及与D-塔格糖生产有关的生物技术领域。更具体地说，本发明提供了能够将糖类(如多糖、寡糖、二糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖)酶促转化为D-塔格糖的改进的D-塔格糖制备方法。

背景技术

D-塔格糖(以下称为塔格糖)是一种低热量的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的92％，但仅有38％的卡路里。由于其高昂的售价，其作为甜味剂的用途受到限制。塔格糖具有无数的健康益处：它不致龋齿；低热量；具有非常低的血糖指数(血糖指数为3)；可使葡萄糖的血糖指数降低20％；可以降低平均血糖水平；通过促进高密度脂蛋白(HDL)胆固醇，来帮助预防心血管疾病、中风和其他血管疾病；是经过验证的益生元和抗氧化剂(Lu et al.,Tagatose,a New Antidiabetic and Obesity Control Drug,Diabetes Obes.Metab.10(2):109-34(2008))。因此，塔格糖显然在消费品和各种工业中具有多种应用，如制药、生物技术、学术、食品、饮料、膳食补充剂和食品杂货行业。

塔格糖主要通过乳糖酶水解乳糖以形成D-葡萄糖和D-半乳糖来生产(参见WO2011/150556、CN 103025894、US 5,002,612、US 6,057,135和US 8,802,843)。然后将D-半乳糖在碱性条件下经氢氧化钙化学异构化，或在中性pH条件下经L-阿拉伯糖异构酶酶促异构化，生成D-塔格糖。最终产物通过过滤和离子交换色谱法相结合进行分离。这种方法由于分离D-葡萄糖和D-半乳糖成本高、产品收率低而受到影响。目前正在开发几种通过微生物细胞发酵的方法，但是由于它们依赖于昂贵的原料(如半乳糖醇和D-阿洛酮糖)，低产品产量和昂贵的分离成本，没有一种方法被证明是可行的替代方法。制备塔格糖的其他方法也已有报道。参见，如Lee et al.,Scientific Reports|7:1934|DOI:10.1038/s41598-017-02211-3,pp.1-8；美国专利公开号2018/0023073；国际专利申请公布号WO 2014/196811、WO2018/004310、WO 2018/021894、WO 2018/182344、WO 2018/182345、WO 2018/182354、WO2018/182355和WO 2016/064146。

最近，国际专利申请公布号WO 2017/059278描述了塔格糖的酶合成，该方法涉及将果糖-6-磷酸(F6P)经果糖-6-磷酸差向异构酶催化转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)的步骤，以及将T6P经塔格糖-6-磷酸磷酸酶催化转化为塔格糖的步骤。然而，尽管酶法塔格糖的生产有所改进，但是仍然希望和需要提供生产塔格糖的进一步改进的方法，例如，该方法可以以较低的酶使用量提供更高的产率量。降低塔格糖生产的成本具有强烈的工业和商业利益，这种降低涉及减少酶的使用量和使用比之前使用的酶更有效的酶的组合。

发明内容

本发明提供了改进的塔格糖制备方法，所述方法能够将糖类(如多糖、寡糖、二糖、蔗糖、D-葡萄糖和D-果糖)酶促转化为塔格糖。一方面，本发明用于由糖类生产塔格糖的改进方法包括使用果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将果糖-6-磷酸(F6P)转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)的步骤，其中F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。另一方面，本发明用于由糖类生产塔格糖的改进方法包括使用塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖的步骤，其中T6PP包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，改进的方法包括使用果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将果糖-6-磷酸(F6P)转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)的步骤，其中F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，以及使用塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖的步骤，其中T6PP包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些改进方法中，用于制备塔格糖的方法还包括将葡萄糖-6-磷酸(G6P)转化为F6P的步骤，其中该步骤由葡萄糖磷酸异构酶(PGI)催化。本发明的某些方法还包括将葡萄糖-1-磷酸(G1P)经葡萄糖磷酸变位酶(PGM)催化转化为G6P的步骤。本发明的某些方法还包括由至少一种酶催化的将糖类转化为G1P的步骤。

在任何方法中使用的糖类可以选自由淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物和蔗糖组成的组。淀粉或其衍生物可以是直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖、麦芽三糖或葡萄糖。在本发明的一些改进的方法中，制备塔格糖的方法涉及通过淀粉的酶促水解或酸水解将淀粉转化为淀粉衍生物。在其他方法中，通过由异淀粉酶、支链淀粉酶、α-淀粉酶或这些酶中的两种或更多种的组合催化的酶促水解淀粉来制备淀粉衍生物。本发明的一些方法还可涉及添加4-葡聚糖转移酶(4GT)。

本发明的制备塔格糖的其他方法还包括由至少一种酶催化的将果糖转化为F6P的步骤。本发明的其他方法还包括由至少一种酶催化的将蔗糖转化为果糖的步骤。在一些制备塔格糖的方法中，使用的G6P也可以通过由至少一种酶催化的将葡萄糖转化为G6P而产生，葡萄糖又可以通过由至少一种酶催化的将蔗糖转化成葡萄糖来产生。

本发明的方法在反应条件，包括在约37℃至约85℃的温度，约5.0至约9.0的pH进行和/或进行约1小时至约48小时时间的条件下进行，或作为连续反应进行。在一些实施方案中，在那些反应条件下，制备塔格糖方法的步骤是在一个生物反应器中进行的。在其他实施方案中，在那些反应条件下，这些步骤在多个串联布置的生物反应器中进行。

在本发明的一些方法中，制备塔格糖的步骤是在不含ATP，不含NAD(H)，约0.1mM至约150mM的磷酸盐浓度下进行的，磷酸盐可循环利用，和/或将T6P转化为塔格糖的步骤涉及能量有利的化学反应。

附图说明

图1是将淀粉或其衍生产物转化为塔格糖的酶促途径的示意图。使用以下缩写：αGP，α-葡聚糖磷酸化酶或淀粉磷酸化酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；PGI，磷酸葡萄糖异构酶；F6PE，果糖-6-磷酸差向异构酶；T6PP，塔格糖-6-磷酸磷酸酶；IA，异淀粉酶；PA，支链淀粉酶；MP，麦芽糖磷酸化酶；PPGK，多磷酸盐葡萄糖激酶。

图2显示了将纤维素或其衍生产物转化为塔格糖的酶促途径。CDP，纤维糊精磷酸化酶；CBP，纤维二糖磷酸化酶；PPGK，多磷酸盐葡萄糖激酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；PGI，磷酸葡萄糖异构酶；F6PE，果糖-6-磷酸差向异构酶；T6PP，塔格糖-6-磷酸磷酸酶。

图3是将果糖转化为塔格糖的酶促途径的示意图。PPFK，多磷酸盐果糖激酶；F6PE，果糖-6-磷酸差向异构酶；T6PP，塔格糖-6-磷酸磷酸酶。

图4是将葡萄糖转化为塔格糖的酶促途径的示意图。PPGK，多磷酸盐葡萄糖激酶；PGI，磷酸葡萄糖异构酶；F6PE，果糖-6-磷酸差向异构酶；T6PP，塔格糖-6-磷酸磷酸酶。

图5显示了将蔗糖或其衍生产物转化为塔格糖的酶促途径。SP，蔗糖磷酸化酶；PPFK，多磷酸盐果糖激酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；PGI，磷酸葡萄糖异构酶；F6PE，果糖-6-磷酸差向异构酶；T6PP，塔格糖-6-磷酸磷酸酶。

图6显示了基于将葡萄糖-1-磷酸转化为塔格糖形成吉布斯能的中间体之间的反应吉布斯能。

图7显示了实施例3中所述的由F6P转化为塔格糖的HPLC色谱图。(实线)0小时色谱图；(短划线)使用F6PE(Uniprot ID B5YBD7)和T6PP(Uniprot ID O29805)2小时；以及(点划线)使用F6PE(Uniprot ID A0A0P6XN50)和T6PP(Uniprot ID D6YBK5)改进的方法2小时；显示的峰是(1)空白，(2)F6P和T6P，(3)游离磷酸盐，(4)塔格糖和(5)果糖。

具体实施方式

本发明总体上涉及将糖类转化为塔格糖的改进的酶促方法。例如，本发明涉及使用无细胞酶混合物将如淀粉、纤维素、蔗糖、葡萄糖和果糖的糖类及其衍生产物转化为塔格糖的改进方法。与基于细胞的制造方法相比，本发明涉及塔格糖的无细胞制备，细胞膜通常会减缓底物/产物进出细胞的转运，由于细胞膜的消除，从而具有相对较高的反应速率。本发明的方法还致使最终产物不含富营养的发酵培养基/细胞代谢产物。

一方面，本发明涉及用于制备塔格糖的改进方法，其包括步骤：使用F6PE催化将F6P转化为T6P；以及使用T6PP催化将T6P转化为塔格糖，使用与先前在生产塔格糖的方法中使用的F6PE和/或T6PPs相比具有更高活性的酶。例如，参见国际专利申请公布WO2017/059278公开的F6PE和T6PPs：源自嗜热厌氧绳菌UNI-1(Anaerolinea thermophile UNI-1)(Uniprot ID E8N0N6)的F6PE；源自热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorkronotskyensis)(Uniprot ID E4SEH3)的F6PE；源自嗜气暖绳菌(Caldilinea aerophila)(Uniprot ID I0I507)的F6PE；源自深海热线菌(Caldithrix abyssi)(Uniprot IDH1XRG1)的F6PE；源自嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)(Uniprot ID B5YBD7)的F6PE；源自闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(Uniprot ID O29805)的T6PP；源自深处古生球菌(Archaeoglobus profundus)(Uniprot ID D2RHV2_ARCPA)的T6PP；源自混毒古生球菌(Archaeoglobus veneficus)(Uniprot ID F2KMK2_ARCVS)的T6PP。使用具有较高活性的酶允许使用较少量的酶，从而降低了整个方法的成本。

在本发明的改进方法中，与先前公开的嗜热网球菌(Uniprot ID B5YBD7)的嗜热F6PE相比，F6PE具有更高的活性(参见国际专利申请公布WO2017/059278)。优选地，相对于嗜热网球菌(Uniprot ID B5YBD7)的嗜热F6PE的活性，在本发明的方法中使用的F6PEs具有提高至少10％、至少30％、至少80％、至少100％、至少150％、至少180％或至少200％的酶活性。例如，如实施例1所示，源自达氏嗜热菌(Thermanaerothrix daxensis)(UniprotA0A0P6XN50)的嗜热F6PE具有相对于源自嗜热网球菌(Uniprot ID B5YBD7)的嗜热F6PE提高约150％的酶活性；源自嗜热假丝酵母念珠菌3(Candidatus Thermofonsia Clade 3)(Uniprot ID A0A2M8QBR9)的嗜热F6PE具有相对于源自嗜热网球菌(Uniprot ID B5YBD7)的嗜热F6PE提高约120％的酶活性；而热解糖厌氧芽孢杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)(Uniprot A0A223HVJ3)的嗜热F6PE具有相对于源自嗜热网球菌(Uniprot ID B5YBD7)的嗜热F6PE提高约178％的酶活性。以下实施例为本领域技术人员提供了确定F6PEs活性的方案，包括将酶与其底物一起孵育，然后通过HPLC测定反应物和产物的量。任何两种酶的相对活性的测定均在相同的反应条件(如缓冲液、pH、温度等)下进行。

在本发明的方法中使用的F6PE对F6P和T6P特异性的。F6PE催化的差向异构化反应是可逆的。特异性意味着F6P/T6P的活性高于反应中存在的其他磷酸化单糖。例如，F6PE对F6P/T6P比对G6P具有更高的差向异构化活性。

用于本发明的改进方法中，F6PEs的实例包括但不限于以下蛋白质：源自达氏嗜热菌(Uniprot ID A0A0P6XN50)的嗜热F6PE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；源自热解糖厌氧芽孢杆菌(Uniprot ID A0A223HVJ3)的嗜热F6PE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；源自Candidatus Thermofonsia Clade 3(Uniprot ID A0A2M8QBR9)的嗜热F6PE，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；以及与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的F6PEs。本发明由糖类生产塔格糖的改进方法包括使用F6PE将果糖-6-磷酸(F6P)转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)的步骤，其中F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的方法中，使用的F6PEs是可将F6P转化为T6P的差向异构酶。F6PEs利用二价金属辅助因子，如镁、锰、钴或锌，优选镁。用于本发明方法的F6PE包含与SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％、至少95％、至少97％、99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，并且优选包含醛缩酶型TIM桶(参见Wichelecki et al.,(2015)J.Biol.Chem.,v290,pp.28963-76)。

在本发明的改进方法中，T6PPs比先前公开的闪烁古生球菌(Uniprot ID O29805)的T6PP具有更高的活性(参见国际专利申请公布WO2017/059278)。优选地，相对于源自闪烁古生球菌(Uniprot ID O29805)的T6PP的酶活性，用于本发明方法的T6PPs具有提高至少10％、至少30％、至少80％、至少100％、至少150％、至少300％、至少500％、至少600％、至少900％、至少1200％、至少1500％、至少1800％或至少2100％的酶活性。例如，如实施例2所示，源自嗜热甲烷八叠球菌CHTI-55(Methanosarcina thermophila CHTI-55)(Uniprot IDA0A0E3NCH4)的T6PP相对于源自闪烁古生球菌(Uniprot ID O29805)的T6PP具有提高约614％的酶活性；源自双孢嗜热双孢菌ATCC 19993(Thermobispora bispora strain ATCC19993)(Uniprot D6YBK5)的T6PP相对于源自闪烁古生球菌(Uniprot ID O29805)的T6PP具有提高约1328％的酶活性；源自嗜热螺旋体ATCC 49972(Spirochaeta thermophila ATCC49972)(Uniprot ID E0RT70)的T6PP相对于源自闪烁古生球菌(Uniprot ID O29805)具有提高约2075％的酶活性；源自嗜热球杆菌DSM 20745(Sphaerobacter thermophiles DSM20745)(Uniprot ID D1C7G9)的T6PP相对于源自闪烁古生球菌(Uniprot ID O29805)的T6PP具有提高约814％的酶活性。以下实施例为本领域技术人员提供了确定T6PPs活性的方案，包括将酶与其底物一起孵育，然后通过HPLC测定反应物和产物的量。任何两种酶的相对活性的测定均在相同的反应条件(如缓冲液、pH、温度等)下进行。

在本发明的方法中使用的T6PPs对T6P特定特异的。对于T6PP，特异性意味着该过程中对T6P的脱磷酸活性高于其他磷酸化单糖。如T6PP对T6P的脱磷酸活性高于对例如G1P、G6P和F6P。

用于本发明方法中的T6PPs的实例包括但不限于以下蛋白质：源自嗜热甲烷八叠球菌CHTI-55(Uniprot ID A0A0E3NCH4)的T6PP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；源自双孢嗜热双孢菌ATCC 19993(Uniprot D6YBK5)的T6PP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；源自嗜热螺旋体ATCC 49972(Uniprot ID E0RT70)的T6PP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；源自嗜热球杆菌DSM 20745(Uniprot ID D1C7G9)的T6PP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；和与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的T6PPs。本发明由糖类生产塔格糖的方法包括使用果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将果糖-6-磷酸(F6P)转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)，和使用塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将塔格糖-6-磷酸(T6P)转化为塔格糖，其中T6PP包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的方法中，T6PPs是将T6P转化为塔格糖的磷酸酶。T6PPs利用二价金属辅助因子，如锌、锰、钴或镁，优选镁。在本发明的方法中，T6PPs与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性。并且优选包含用于催化的Rossmanoid折叠结构域，加上用于底物特异性的C1封端结构域；在Rossmanoid折叠第一个β-链中的DxD标记用于配位镁，其中第二个Asp是一般的酸/碱催化剂；在Rossmanoid折叠的第二个β-链末端的Thr或Ser，有助于反应中间体的稳定性；在Rossmanoid折叠的第三β-链的α-螺旋C-末端的N-末端上的Lys，有助于反应中间体的稳定性；在Rossmanoid折叠的第4个β-链末端E(D/N)标记，用于配位二价金属阳离子，如镁(例如，参见Burroughs et al.,Evolutionary Genomics of the HADSuperfamily:Understanding the Structural Adaptations and Catalytic Diversityin a Superfamily of Phosphoesterases and Allied Enzymes.J.Mol.Biol.2006；361；1003-1034)。

本发明优选的酶促方法包括使用果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将果糖-6-磷酸(F6P)转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)的步骤，其中F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；以及使用塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖的步骤，其中T6PP包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性氨基酸序列。更优选地，F6PE包含与SEQ IDNO:2具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，且T6PP包含与SEQ ID NO:5具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。最优选地，F6PE具有如SEQ ID NO:2所列的氨基酸序列，且T6PP具有如SEQ ID NO:5所列的氨基酸序列。

本发明由糖类制备塔格糖的方法还包括将葡萄糖-6-磷酸(G6P)酶促转化为F6P的步骤，其中该步骤由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化。可使用的典型的PGIs包括在国际专利申请公布WO2017/059278中公开的那些：源自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(Uniprot ID A3DBX9)的PGI和源自嗜热细菌(Thermus thermophilus)(Uniprot IDQ5SLL6)的PGI。

本发明制备塔格糖的方法还包括将葡萄糖-1-磷酸(G1P)转化为G6P的步骤，其中该步骤由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化。PGM的一个实施例是国际专利申请公布WO2017/059278中公开的源自超嗜热球菌(Thermococcus kodakaraensis)(Uniprot ID Q68BJ6)的PGM。

此外，本发明的方法可进一步包括将糖类转化为G1P的步骤，其中该步骤被至少一种酶催化，并且所述糖类选自由淀粉或其衍生物(图1)、纤维素或其衍生物(图2)、果糖(图3)、葡萄糖(图4)和蔗糖(图5)组成的组。根据在本发明的方法，将糖类转化为G1P的步骤中使用的一种或多种酶可以是α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)、麦芽糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和/或纤维素磷酸化酶，及其混合物。获得F6P的酶或酶组合的选择取决于过程中使用的糖类。

纤维素是最丰富的生物资源，也是植物细胞壁的主要成分。非食用木质纤维素生物质包含纤维素、半纤维素和木质素以及其他次要成分。纯纤维素，包括Avicel(微晶纤维素)、再生的无定形纤维素、细菌纤维素、滤纸等，可通过一系列处理来制备。部分水解的纤维素底物包括聚合度大于7的水不溶性纤维糊精、聚合度为3-6的水溶性纤维糊精、纤维二糖、葡萄糖和果糖。

在本发明的某些方法中，可以通过一系列步骤将纤维素及其衍生产物转化为塔格糖(见图2)。例如，本发明的方法提供了涉及以下步骤的途径：分别使用纤维糊精磷酸化酶(CDP)和纤维二糖磷酸化酶(CBP)催化将纤维糊精、纤维二糖和游离磷酸盐生成G1P；使用PGM催化将G1P生成G6P；使用PGI催化将G6P生成F6P；如上所述将F6P转化为塔格糖，并且磷酸根离子可通过将纤维糊精和纤维二糖转化为G1P的步骤来循环利用。

几种酶可用于将固体纤维素水解为水溶性纤维糊精和纤维二糖。这样的酶包括内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶，但不包括β-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶)。在纤维素水解和生成G1P之前，可以对纤维素和生物质进行预处理，以提高它们的反应性并降低纤维素链的聚合度。纤维素和生物质的预处理方法包括稀酸预处理、基于纤维素溶剂的木质纤维素分馏、氨纤维膨胀、氨水浸泡、离子液体处理以及通过使用浓酸(包括盐酸、硫酸、磷酸及其组合)进行部分水解。

当糖类包含纤维二糖，并且所述酶包含纤维二糖磷酸化酶时，G1P由纤维二糖经纤维二糖磷酸化酶催化生成。当糖类包含纤维糊精并且酶包括纤维糊精磷酸化酶时，G1P由纤维糊精经纤维糊精磷酸化酶催化生成。当糖类包含纤维素，而酶包含纤维素磷酸化酶时，G1P由纤维素经纤维素磷酸化酶催化生成。

当糖类包括麦芽糖并且酶包含麦芽糖磷酸化酶时，G1P由麦芽糖经麦芽糖磷酸化酶生成。当糖类包括蔗糖并且酶包含蔗糖磷酸化酶，则G1P由蔗糖经蔗糖磷酸化酶生成。

当糖类是淀粉或淀粉衍生物时，该衍生物可选自由直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖、麦芽三糖、葡萄糖以及它们的混合物组成的组。在本发明的某些方法中，用于将糖类转化为G1P的酶包含αGP。在该步骤中，当糖类包含淀粉时，通过αGP由淀粉生成G1P；当糖类包含可溶性淀粉、淀粉糊精或麦芽糊精时，通过αGP由可溶性淀粉、淀粉糊精或麦芽糊精生产G1P。αGP的一个实例是源自海栖热袍菌(Thermotogamaritima)(Uniprot ID G4FEH8)的αGP，其在国际专利申请公布WO2017/059278中公开。

本发明的一些方法可进一步包括将淀粉转化为淀粉衍生物的步骤，其中淀粉衍生物是通过淀粉的酶水解或淀粉的酸水解制备的。在本发明的某些方法中，麦芽糖磷酸化酶(MP)可通过将降解产物麦芽糖磷酸化裂解为G1P和葡萄糖来增加塔格糖产量。或者，4-葡聚糖转移酶(4GT)通过将降解产物葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖循环为更长的麦芽低聚糖来提高塔格糖的产量；所述更长的麦芽低聚糖可以被αGP磷酸裂解以产生G1P。4GT的一个实例是4GT源自嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(Uniprot ID O32462)，其在国际专利申请公布WO2017/059278中公开。在本发明的一些方法中，可在该方法中添加多磷酸盐和多磷酸盐葡萄糖激酶(PPGK)，从而通过将降解产物葡萄糖磷酸化生成G6P来增加塔格糖的产量。

淀粉是自然界中使用最广泛的能量存储化合物，主要存储在植物种子中。天然淀粉包含直链淀粉和支链淀粉。淀粉衍生物的实例包括直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖、果糖和葡萄糖。纤维素衍生物的实例包括预处理的生物质、再生的无定形纤维素、纤维糊精、纤维二糖、果糖和葡萄糖。蔗糖衍生物包括果糖和葡萄糖。

在本方法使用淀粉衍生物的情况下，淀粉衍生物可由淀粉经异淀粉酶、支链淀粉酶、α-淀粉酶或其组合催化的酶促水解来制备。玉米淀粉包含许多阻碍αGP作用的分支。异淀粉酶可用于将淀粉去分支，产生直链淀粉糊精。异淀粉酶预处理的淀粉可使最终产物中的F6P浓度更高。异淀粉酶和支链淀粉酶切割α-1,6-糖苷键，从而可以通过α-葡聚糖磷酸化酶更彻底地降解淀粉。α-淀粉酶可切割α-1,4-糖苷键，因此α-淀粉酶可将淀粉降解为片段，从而更快地转化为塔格糖。

塔格糖也可由果糖生产(见图3)。根据本发明的方法还可包括将果糖转化为F6P的步骤，其中该步骤被至少一种酶催化，和，任选地，将蔗糖转化成果糖的步骤，其中该步骤被至少一种酶催化。例如，该方法涉及由果糖和多聚磷酸盐经多聚磷酸果糖激酶(PPFK)催化生成F6P。F6P向塔格糖的转化如上所述。例如，果糖可通过蔗糖的酶促转化来生产。T6P转化为塔格糖时产生的磷酸根离子可以在蔗糖转化为G1P的步骤中循环利用。

塔格糖也可以由葡萄糖生产(见图4)。根据本发明的方法还可包括由至少一种酶催化的将葡萄糖转化为G6P的步骤，和，任选地，由至少一种酶催化的将蔗糖转化为果糖的步骤。例如，该方法涉及使用葡萄糖和多聚磷酸盐经多聚磷酸盐葡萄糖激酶(PPGK)催化来生产G6P。例如，葡萄糖可通过蔗糖的酶促转化来生产(见图5)。

在本发明的一些方法中，T6P转化为塔格糖时产生磷酸根离子，磷酸根离子在将淀粉衍生物转化为G1P(参见，如图1)、纤维素衍生物转化为G1P(参见，如图2)或蔗糖转化为G1P(参见图5)的步骤中再循环，特别是当该过程在单个反应容器中进行时。此外，PPFK和多聚磷酸盐可通过利用SP对蔗糖的磷酸化裂解产生的果糖生产F6P来提高塔格糖产量。

例如，由糖类制备塔格糖的方法包括以下步骤：(i)使用一种或多种酶将糖类转化为葡萄糖-1-磷酸(G1P)；(ii)使用磷酸葡萄糖变位酶(PGM，EC 5.4.2.2)将G1P转化为G6P；(iii)使用磷酸葡萄糖异构酶(PGI，EC 5.3.1.9)将G6P转化为F6P；(iv)通过果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将F6P转化为T6P，以及(v)通过塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖。在本发明的改进方法中，F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，和/或T6PP包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。在这种方法中，例如，步骤(i)中的酶是αGP。通常，在本方法中使用的酶单位的比例为1：1：1：1：1(αGP：PGM：PGI：F6PE：T6PP)。酶单位是指在1分钟内将1umol底物转化为产物所需的酶量。因此，每一个酶单位的酶以mg计，与催化相同反应的具有较低活性的酶相比，具有较高活性的酶将用较少的酶量。为了优化产品产量，可以以任意数量的组合来调整这些比率。例如，特定酶相对于其他酶的量可以以约2x，3x，4x，5x等份的量存在。

根据本发明制备塔格糖的方法可以包括以下附加步骤：通过酶水解或酸水解由多糖和寡糖产生葡萄糖，通过至少一种酶催化将葡萄糖转化为G6P，通过酶水解或酸水解由多糖和寡糖产生果糖，并通过至少一种酶催化将果糖转化为G6P。以上列举了多糖和寡糖的实例。

根据本发明制备塔格糖的方法可在单个生物反应器或反应容器中进行。或者，该步骤也可以在串联布置的多个生物反应器或反应容器中进行。在优选的方法中，在单个反应容器中进行塔格糖的酶促生产。

本发明中使用的酶可以采取可溶性、固定化、组装或聚集的蛋白质的形式。如本领域所知，这些酶可以被吸附在通常用于改善功能性的不溶性有机或无机载体上，包括聚合物载体如琼脂糖、甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或右旋糖酐，以及无机载体如玻璃、金属或碳基材料。这些材料通常具有较大的表面积体积比和特殊表面，以促进固定化酶的附着和活性。这些酶可以通过共价键、离子键或疏水相互作用固定在这些固体载体上，也可以通过基因工程相互作用固定，如共价融合到另一种对固体载体(通常是多组氨酸序列)具有亲和力的蛋白质或肽序列上。这些酶可以直接固定在表面或表面涂层上，也可以固定在已经存在于表面或表面涂层上的其他蛋白质上。这些酶可以全部固定在一种载体上，也可以固定在个别的载体上，或固定在所述两种的组合上(例如，每种载体两种酶，然后混合那些载体)。这些变化可以均匀混合或以限定的层混合，以优化连续反应器中的周转。例如，反应器的开始可具有一层aGP以确保高的G1P初始增加量。酶可以全部固定在一种载体上、个别载体上或成组固定。这些酶可以均匀混合或以限定的层或区域混合以优化周转。

本领域已知的任何合适的生物缓冲液都可用于本发明的方法中，如HEPES、PBS、BIS-TRIS、MOPS、DIPSO、Trizma等。所有实施方案的反应缓冲液pH范围可以为5.0-9.0。更优选地，反应缓冲液的pH范围可以在约6.0至约7.3。如，反应缓冲液的pH可以是6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3。

在本发明的一些改进方法中，反应缓冲液包含二价金属阳离子。实例包括Mn²⁺，Co² ⁺，Mg²⁺和Zn²⁺等，优选Mg²⁺。二价金属阳离子的浓度范围可以在约0mM至约150mM、约0mM至约100mM、约1mM至约50mM，优选约5mM至约50mM，或更优选约10mM至约50mM。例如，二价金属阳离子浓度可以为约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM或约55mM。

该工艺步骤的反应温度可以在37-85℃的范围内进行。更优选地，这些步骤可以在约37℃至约85℃的温度范围内进行。该温度可以是：例如约40℃、约45℃、约50℃、约55℃或约60℃。优选地，反应温度为约50℃。在本发明的一些方法中，反应温度是恒定的，并且在该过程中不改变。

所公开的方法的反应时间可以根据需要在约1小时至约48小时的范围内进行调节。例如，反应时间可以是约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时、约42小时、约44小时、约46小时或约48小时。更优选地，反应时间为约24小时。

反应可以使用填充床反应器或类似装置以批次或连续方式进行。在连续过程中，将麦芽糖糊精溶液泵入固定化酶床中，其速率应使溶液离开色谱柱进行下游处理时完全转化为塔格糖。例如，可以将200g/L的麦芽糖糊精泵入装有固定化酶的柱子(保持在例如50℃的温度)，这样当麦芽糖糊精离开柱子时，可获得最大的塔格糖产量。与批次处理方法相比，此方法可提供更高的体积生产率。这限制了我们的产物与色谱柱接触的时间和反应条件，从而降低了产物降解的机会(例如潜在的羟甲基糠醛形成)。无论是批次还是连续模式，本发明方法的各个步骤都可以使用与其他步骤相同的反应条件进行。例如，本发明在使用单个生物反应器或反应容器的特定方法中，对于该方法的所有步骤，反应条件如pH和温度以及反应缓冲液保持恒定。

T6P被T6PP脱磷酸化而产生的磷酸根离子可在随后将糖类转化为G1P的处理步骤中循环利用，尤其是当所有处理步骤都在单个生物反应器或反应容器中进行时。在所公开的方法中循环利用磷酸盐的能力使得能够使用非化学计量的磷酸盐，从而保持较低的反应磷酸盐浓度。这虽然影响了本方法的总体途径和总速率，但并未限制单个酶的活性，并能满足塔格糖制备方法的总效率。

例如，反应磷酸盐的浓度范围可以是约0mM至约300mM、约0mM至约150mM、约1mM至约50mM，优选约5mM至约50mM，或更优选约10mM至约50mM。例如，反应磷酸盐浓度可以为约0.1mM、约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM或约55mM。

因此，低磷酸盐浓度由于低的总磷酸盐而降低了生产成本，并因此降低了磷酸盐去除的成本。这还可以防止高浓度的游离磷酸盐对T6PP的抑制，并降低磷酸盐污染的可能性。

此外，本文公开的方法可以在不添加ATP作为磷酸盐源，即不含ATP的情况下进行。该方法也可以不必添加NAD(H)，即在不含NAD(H)的条件下进行。其他优点还包括以下事实：所公开的制备塔格糖的方法中至少一个步骤涉及能量上有利的化学反应(如图6)。虽然使用具有较高活性的酶不会影响总体能量，但是在改进的方法中使用较少量的酶是有利的。优点是在产物的总生产成本中降低了酶的总成本。

由于对于整个反应非常有利的平衡常数，根据本发明的方法可以实现高产率。从理论上讲，如果原料完全转化为中间体，则产率可高达99％。同样，不管原料如何，根据本发明将T6P转化为塔格糖的步骤都是不可逆的磷酸酶反应。因此，塔格糖的产量非常高。

本发明的方法使用低成本的起始原料，并通过降低与原料和产物分离有关的成本来降低生产成本。淀粉、纤维素、蔗糖及其衍生物是比例如乳糖便宜的原料。当由乳糖生产塔格糖时，葡萄糖和半乳糖和塔格糖通过色谱法分离会导致更高的生产成本。

根据本发明的方法使塔格糖容易回收，并且使分离成本最小化。优选地，在本发明的方法中，塔格糖的回收不是通过色谱分离。在连续反应中产生塔格糖之后，产物经过微滤、离子交换(先阳离子后阴离子，而不是混合床)、浓缩、结晶、晶体分离和干燥。由于塔格糖的高产率，结晶步骤是纯化塔格糖的全部所需。为了在结晶之前进一步纯化塔格糖，可采用纳滤消除结晶过程中存在酶的风险，并去除可能与塔格糖共结晶或限制母液(麦芽糊精、麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖等)循环利用的任何未转化的糊精。

根据本发明制备塔格糖的改进方法包括以下步骤：(i)使用一种或多种酶将糖类转化为葡萄糖-1-磷酸(G1P)；(ii)使用磷酸葡萄糖变位酶(PGM，EC 5.4.2.2)将G1P转化为G6P；(iii)使用磷酸葡萄糖异构酶(PGI，EC 5.3.1.9)将G6P转化为F6P；(iv)通过果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将F6P转化为T6P，和(v)通过塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖，其中F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，和/或其中T6PP包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。该方法优选在单个生物反应器或反应容器中进行。

优选地，根据本发明制备塔格糖的改进方法包括以下步骤：(i)使用αGP将糖类转化为葡萄糖-1-磷酸(G1P)，其中所述糖类选自由淀粉、一种或更多种淀粉衍生物，或其组合组成的组；(ii)使用磷酸葡萄糖变位酶(PGM，EC 5.4.2.2)将G1P转化为G6P；(iii)使用磷酸葡萄糖异构酶(PGI，EC 5.3.1.9)将G6P转化为F6P；(iv)通过果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将F6P转化为T6P，和(v)通过塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖，其中F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，和/或其中T6PP包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。该方法优选在单个反应器容器中进行，并且可以并入以上讨论的各种处理条件中的一种或多种。

实施例

材料和方法

所有化学药品，除非另有说明，包括葡萄糖-1-磷酸、氯化镁、磷酸钠(一元和二元)，均为试剂级或更高级，购自Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)或FisherScientific(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)(Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯)被用作重组蛋白表达的宿主细胞。包含50mg L^-1卡那霉素的ZYM-5052培养基用于大肠杆菌细胞生长和重组蛋白表达。

重组酶的生产和纯化

将含有蛋白质表达质粒(pET28a)的大肠杆菌BL21(DE3)菌株在1-L锥形瓶中与100mL含有50mg L^-1卡那霉素的ZYM-5052培养基一起温育。使细胞在37℃下以220rpm转速旋转振荡生长16-24小时。通过在12℃下离心收集细胞，并用含有50mM NaCl和5mM MgCl₂的20mM HEPES(pH 7.5)洗一次(热沉淀)或含有300mM NaCl和5mM咪唑的20mM HEPES(pH 7.5)洗一次(镍提纯)。将细胞沉淀重悬于相同的缓冲液中，并通过超声裂解。离心后，纯化上清液中的靶蛋白。用Profinity IMAC含Ni带电树脂(Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)纯化His标记的蛋白。在50-80℃下热沉淀处理5-30分钟，以纯化耐热酶。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检查重组蛋白的纯度。

实施例1：具有更高活性的F6PE

不同F6PE的相对活性的测定是在50℃下在含有5mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、38.5mMG1P、0.05g/L PGM、0.05g/L PGI、0.05g/L F6PE和0.075g/L T6PP(源自嗜热甲烷八叠球菌CHTI-55(Uniprot ID A0A0E3NCH4))的50mM HEPES缓冲液(pH 7.2)中测定1小时进行的。通过用Vivaspin 2浓缩器(10,000MWCO)过滤酶来终止反应。使用安捷伦Hi-Plex H柱和折射率检测器评估了塔格糖产品。样品在5mM H₂SO₄中以0.6mL/min的速度在65℃下运行15分钟。表1显示，相对于先前公开的源自嗜热网球菌(Uniprot ID B5YBD7)的F6PE，用于本发明的改进方法中的F6PEs具有更高的活性(参见国际专利申请公布WO2017/059278)。

表1：F6PEs的相对活性

实施例2：具有更高活性的T6PPs

不同T6PP的相对活性的测定是在50℃下在含有5mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、38.5mMG1P、0.05g/L PGM、0.05g/L PGI、0.25g/L F6PE(源自达氏嗜热菌(Uniprot A0A0P6XN50))和0.05g/L T6PP的50mM HEPES缓冲液(pH 7.2)中测定1小时进行的。通过用Vivaspin 2浓缩器(10,000MWCO)过滤酶来终止反应。使用安捷伦Hi-Plex H柱和折射率检测器评估了塔格糖产品。样品在5mM H₂SO₄中以0.6mL/min的速度在65℃下运行15分钟。表2表明，相对于先前公开的源自闪烁古生球菌(Uniprot ID O29805)的T6PP，在本发明的改进方法中使用的T6PPs具有更高的活性(参见国际专利申请公布WO2017/059278)。

表2：T6PP的相对活性

实施例3：由F6P生产塔格糖的改进方法

将使用先前公开的酶F6PE(Uniprot ID B5YBD7)和T6PP(Uniprot ID O29805)由F6P转化塔格糖的方法与将使用本发明改进方法的酶F6PE(Uniprot ID A0A0P6XN50)和T6PP(Uniprot ID D6YBK5)由F6P转化为塔格糖的方法进行了比较。将含有38.5mM F6P、50mM HEPES(pH 7.2)、5mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、0.1g/L F6PE和0.033g/L T6PP的0.20mL反应混合物在50℃下孵育2小时。

通过用Vivaspin 2浓缩器(10,000MWCO)过滤酶来终止反应，并使用安捷伦Hi-Plex H柱和折射率检测器通过HPLC(安捷伦1100系列)进行分析。样品在5mM H₂SO₄中以0.6mL/min的速度在65℃下运行15.5分钟。结果表明，与先前公开的酶(图7)相比，采用改进方法的酶使塔格糖产量提高了4.4倍(图7)。改进方法中，与酶的反应中存在少量果糖(参见图7，在峰4上的肩峰5)。这可能是伪影，因为与T6P相比，T6PP最初在反应中看到大量的F6P，然而在整个途径中并不是问题。

序列表

α-葡聚糖磷酸化酶(Alpha-glucan phosphorylase)

海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Uniprot ID G4FEH8)-SEQ ID NO:8

MLEKLPENLKELESLAYNLWWSWSRPAQRLWRMIDSEKWEEHRNPVKILREVSKERLEEL

SKDEDFIALYELTLERFTDYMEREDTWFNVNYPEWDEKIVYMCMEYGLTKALPIYSGGLGI

LAGDHLKSASDLGLPLIAVGLLYKHGYFTQQIDSDGRQIEIFPEYDIEELPMKPLRDEDGNQ

VIVEVPIDNDTVKARVFEVQVGRVKLYLLDTDFEENEDRFRKICDYLYNPEPDVRVSQEILL

GIGGMKLLKTLKIKPGVIHLNEGHPAFSSLERIKSYMEEGYSFTEALEIVRQTTVFTTHTPVP

AGHDRFPFDFVEKKLTKFFEGFESKELLMNLGKDEDGNFNMTYLALRTSSFINGVSKLHAD

VSRRMFKNVWKGVPVEEIPIEGITNGVHMGTWINREMRKLFDRYLGRVWREHTDLEGIWY

GVDRIPDEELWEAHLNAKKRFIDYIRESIKRRNERLGINEPLPEISENVLIIGFARRFATYKRA

VLLFSDLERLKRIVNNSERPVYIVYAGKAHPRDEGGKEFLRRIYEVSQMPDFKNKIIVLENY

DIGMARLMVSGVDVWLNNPRRPMEASGTSGMKAAANGVLNASVYDGWWVEGYNGRN

GWVIGDESVLPETEADDPKDAEALYELLENEIIPTYYENREKWIFMMKESIKSVAPKFSTTR

MLKEYTEKFYIKGLVNREWLERRENVEKIGAWKERILKNWENVSIERIVLEDSKSVEVTVK

LGDLTPNDVIVELVAGRGEGMEDLEVWKVIHIRRYRKENDLFVYTYTNGVLGHLGSPGWF

YAVRVIPYHPRLPIKFLPEVPVVWKKVL

磷酸葡萄糖变位酶(Phosphoglucomutase)

超嗜热球菌(Thermococcus kodakaraensis)(Uniprot ID Q68BJ6)-SEQ ID NO:9MGKLFGTFGVRGIANEEITPEFALKIGMAFGTLLKREGRERPLVVVGRDTRVSGEMLKDALISGLLSTGCDVIDVGIAPTPAIQWATNHFNADGGAVITASHNPPEYNGIKLLEPNGMGLKKEREAIVEELFFSEDFHRAKWNEIGELRKEDIIKPYIEAIKNRVDVEAIKKRRPFVVVDTSNGAGSLTLPYLLRELGCKVVSVNAHPDGHFPARNPEPNEENLKGFMEIVKALGADFGVAQDGDADRAVFIDENGRFIQGDKTFALVADAVLRENGGGLLVTTIATSNLLDDIAKRNGAKVMRTKVGDLIVARALLENNGTIGGEENGGVIFPDFVLGRDGAMTTAKIVEIFAKSGKKFSELIDELPKYYQFKTKRHVEGDRKAIVAKVAELAEKKGYKIDTTDGTKIIFDDGWVLVRASGTEPIIRIFSEAKSEEKAREYLELGIKLLEEALKG

果糖-6-磷酸4-差向异构酶(Fructose 6-phosphate 4-epimerases)

(对照)嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)(Uniprot ID B5YBD7)-SEQ IDNO:10MWLSKDYLRKKGVYSICSSNPYVIEASVEFAKEKNDYILIEATPHQINQFGGYSGMTPEDFKNFVMGIIKEKGIEEDRVILGGDHLGPLPWQDEPSSSAMKKAKDLIRAFVESGYKKIHLDCSMSLSDDPVVLSPEKIAERERELLEVAEETARKYNFQPVYVVGTDVPVAGGGEEEGITSVEDFRVAISSLKKYFEDVPRIWDRIIGFVIMLGIGFNYEKVFEYDRIKVRKILEEVKKENLFVEGHSTDYQTKRALRDMVEDGVRILKVGPALTASFRRGVFLLSSIEDELISEDKRSNIKKVVLETMLKDDKYWRKYYKDSERLELDIWYNLLDRIRYYWEYKEIKIALNRLFENFSEGVDIRYIYQYFYDSYFKVREGKIRNDPRELIKNEIKKVLEDYHYAVNL

达氏嗜热菌(Thermanaerothrix daxensis)(Uniprot ID A0A0P6XN50)-SEQ IDNO:1MVTYLDFVVLSHRFRRPLGITSVCSAHPYVIEAALRNGMMTHTPVLIEATCNQVNQYGGYTGMTPADFVRYVENIAARVGSPRENLLLGGDHLGPLVWAHEPAESAMEKARALVKAYVEAGFRKIHLDCSMPCADDRDFSPKVIAERAAELAQVAESTCDVMGLPLPNYVIGTEVPPAGGAKAEAETLRVTRPEDAAETIALTRAAFFKRGLESAWERVVALVVQPGVEFGDHQIHVYRREEAQALSRFIESQPGLVYEAHSTDYQPRDALRALVEDHFAILKVGPALTFAFREAVFALASIEDWVCDSPSRILEVLETTMLANPVYWQKYYLGDERARRIARGYSFSDRIRYYWSAPAVEQAFERLRANLNRVSIPLVLLSQYLPDQYRKVRDGRLPNQFDALILDKIQAVLEDYNVACGVRIGE热解糖厌氧芽孢杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)(Uniprot ID A0A223HVJ3)-SEQ IDNO:2

MAKEHPLKELVNKQKSGISEGIVSICSSNEFVIEASMERALTNGDYVLIESTANQVNQYGGY

IGMTPIEFKKFVFSIAKKVDFPLDKLILGGDHLGPLIWKNESSNLALAKASELIKEYVLAGYT

KIHIDTSMRLKDDTDFNTEIIAQRSAVLLKAAENAYMELNKNNKNVLHPVYVIGSEVPIPGG

SQGSDESLQITDAKDFENTVEIFKDVFSKYGLINEWENIVAFVVQPGVEFGNDFVHEYKRDE

AKELTDALKNYKTFVFEGHSTDYQTRESLKQMVEDGIAILKVGPALTFALREALIALNNIEN

ELLNNVDSIKLSNFTNVLVSEMINNPEHWKNHYFGDDARKKFLCKYSYSDRCRYYLPTRN

VKNSLNLLIRNLENVKIPMTLISQFMPLQYDNIRRGLIKNEPISLIKNAIMNRLNDYYYAIKPCandidatus Thermofonsia Clade 3bacterium(Uniprot ID A0A2M8QBR9)-SEQ ID NO:7MTYLDYLTASHHSGKPIGLSSICSAHPWVLRTALQGERPVLIESTCNQVNQFGGYSGMKPADFVRFVHSLAAENGFPTEKILLGGDHLGPSPWQNEPAEQAMAKAIEMVRAYVQAGYTKIHLDCSMPLGGERQLPVEVIAQRTVQLAEAAEQAAHESRLTSHTLRYVIGSEVPPPGGAIGPHEGLRVTPVEEARQTLEVMQAAFHQAGLEAAWERVRALVVQPGVEFGDDFVHDYDPAAAAGLARFIETVPNLVYEAHSTDYQTPESLAALVRDHFAILKVGPALTFALREAVFALAMIENELFPAEERSHLVERLEAAMLRQPGHWQRHYHGEERQQALARKYSFSDRIRYYWGDPDVQAAFRQLLANLERVAPLPLTLLSQYLPEMFGEIRRGLLLNHPAAFLERKIQAVLDTYRAACGEED塔格糖-6-磷酸磷酸酶(Tagatose 6-phosphate phosphatases)

(对照)闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)(Uniprot ID O29805)-SEQ IDNO:11MFKPKAIAVDIDGTLTDRKRALNCRAVEALRKVKIPVILATGNISCFARAAAKLIGVSDVVICENGGVVRFEYDGEDIVLGDKEKCVEAVRVLEKHYEVELLDFEYRKSEVCMRRSFDINEARKLIEGMGVKLVDSGFAYHIMDADVSKGKALKFVAERLGISSAEFAVIGDSENDIDMFRVAGFGIAVANADERLKEYADLVTPSPDGEGVVEALQFLGLLR

嗜热甲烷八叠球菌CHTI-55(Methanosarcina thermophila CHTI-55)(UniprotID A0A0E3NCH4)-SEQ ID NO:3

MLKALIFDMDGVLVDSMPFHAAAWKKAFFEMGMEIQDSDIFAIEGSNPRNGLPLLIRKARK

EPEAFDFEAITSIYRQEFKRVFEPKAFEGMKECLEVLKKRFLLSVVSGSDHVIVHSIINRLFPG

IFDIVVTGDDIINSKPHPDPFLKAVELLNVRREECVVIENAILGVEAAKNARIYCIGVPTYVEP

SHLDKADLVVEDHRQLMQHLLSLEPANGFRQ

双孢嗜热双孢菌ATCC 19993(Thermobispora bispora strain ATCC 19993)(Uniprot ID D6YBK5)-SEQ ID NO:4

MDVVLFDMDGLLVDTERLWFAVETEVVERLGGSWGPEHQRQLVGGSLKRAVAYMLEHTG

ADVDPDVVAGWLIEGMERRLTESVDPMPGAMELLTALRDEGIPTGLVTSSRRPLADAVLKH

IGREHFDVVVTADDVSHAKPHPEPYLTALAMLSADPARSVALEDSPNGVASAVAAGCRVVA

VPSLLPIPEQPGVTVLPALTHADVGLLRSLVG

嗜热螺旋体ATCC 49972(Spirochaeta thermophila ATCC 49972)(Uniprot IDE0RT70)-SEQ ID NO:5

MRKRRECAPPGIRAAIFDMDGTLVNSEDVYWDADCAFLDRYGIPHDDALREYMIGRGTKG

FIEWMRTQKEIPRSDEELAREKMEVFLAHARGRVQVFPEMRRLLGLLEEAGMPCALASGSP

RGIIEVLLEETGLAGFFRVVVSADEVARPKPAPDVFLEAAGRLGVEPGGCVVFEDSEPGVRA

GLDAGMVCVAIPTLVKDRYPEVFYQADVLFEGGMGEFSAERVWEWLGCGVGVGR嗜热球杆菌DSM20745(Sphaerobacter thermophiles DSM 20745)(Uniprot ID D1C7G9)-SEQ ID NO:6

MSQGVRGVVFDLDGLLVESEEYWEQARREFVSRYGGTWGDDAQQAVMGANTRQWSRYI

REAFDIPLTEEEIAAAVIARMQELYHDHLPLLPGAIPAVRALADRYPLAVASSSPPVLIRFVLA

EMGVAECFQSVTSSDEVAHGKPAPDVYHLACERLGVAPEQAVAFEDSTAGIAAALAAGLRV

IAVPNRSYPPDPDVLRRADLTLPSLEEFDPAVLEQW4-葡聚糖转移酶(4-glucantransferase)

嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(Uniprot ID O32462)-SEQ ID NO:12

MERINFIFGIHNHQPLGNFGWVFEEAYNRSYRPFMEILEEFPEMKVNVHFSGPLLEWIEENK

PDYLDLLRSLIKRGQLEIVVAGFYEPVLAAIPKEDRLVQIEMLKDYARKLGYDAKGVWLTE

RVWQPELVKSLREAGIEYVVVDDYHFMSAGLSKEELFWPYYTEDGGEVITVFPIDEKLRYL

IPFRPVKKTIEYLESLTSDDPSKVAVFHDDGEKFGVWPGTYEWVYEKGWLREFFDAITSNEK

INLMTYSEYLSKFTPRGLVYLPIASYFEMSEWSLPAKQAKLFVEFVEQLKEEGKFEKYRVFV

RGGIWKNFFFKYPESNFMHKRMLMVSKAVRDNPEARKYILKAQCNDAYWHGVFGGIYLP

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NYNDVLPRRWEHYHEVPEATKPEKESEEGIASIHELGKQIPEEIRRELAYDWQLRAILQDHFI

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VWKFPIKTLSQSEAGWDFIQQGVSYTMLFPIEKELEFTVRFREL

序列表

<110> 博努莫斯有限责任公司

<120> 塔格糖的酶法生产

<130> 146.0009-WO00

<150> US 62/747877

<151> 2018-10-19

<150> US 62/790,788

<151> 2019-01-10

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 426

<212> PRT

<213> 达氏嗜热菌（Thermanaerothrix daxensis）

<400> 1

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1 5 10 15

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<210> 2

<211> 434

<212> PRT

<213> 热解糖厌氧芽孢杆菌（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）

<400> 2

Met Ala Lys Glu His Pro Leu Lys Glu Leu Val Asn Lys Gln Lys Ser

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Gly Ile Ser Glu Gly Ile Val Ser Ile Cys Ser Ser Asn Glu Phe Val

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65 70 75 80

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Pro Leu Ile Trp Lys Asn Glu Ser Ser Asn Leu Ala Leu Ala Lys Ala

100 105 110

Ser Glu Leu Ile Lys Glu Tyr Val Leu Ala Gly Tyr Thr Lys Ile His

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Asn Ile Val Ala Phe Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asn Asp

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245 250 255

Leu Lys Asn Tyr Lys Thr Phe Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr

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275 280 285

Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ile

290 295 300

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305 310 315 320

Lys Leu Ser Asn Phe Thr Asn Val Leu Val Ser Glu Met Ile Asn Asn

325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Asn Val Lys Ile Pro Met Thr Leu Ile Ser Gln Phe Met Pro Leu Gln

385 390 395 400

Tyr Asp Asn Ile Arg Arg Gly Leu Ile Lys Asn Glu Pro Ile Ser Leu

405 410 415

Ile Lys Asn Ala Ile Met Asn Arg Leu Asn Asp Tyr Tyr Tyr Ala Ile

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Lys Pro

<210> 3

<211> 220

<212> PRT

<213> 嗜热甲烷八叠球菌CHTI-55（Methanosarcina thermophila CHTI-55）

<400> 3

Met Leu Lys Ala Leu Ile Phe Asp Met Asp Gly Val Leu Val Asp Ser

1 5 10 15

Met Pro Phe His Ala Ala Ala Trp Lys Lys Ala Phe Phe Glu Met Gly

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Met Glu Ile Gln Asp Ser Asp Ile Phe Ala Ile Glu Gly Ser Asn Pro

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Arg Asn Gly Leu Pro Leu Leu Ile Arg Lys Ala Arg Lys Glu Pro Glu

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Val Leu Lys Lys Arg Phe Leu Leu Ser Val Val Ser Gly Ser Asp His

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Val Ile Val His Ser Ile Ile Asn Arg Leu Phe Pro Gly Ile Phe Asp

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Ile Val Val Thr Gly Asp Asp Ile Ile Asn Ser Lys Pro His Pro Asp

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Pro Phe Leu Lys Ala Val Glu Leu Leu Asn Val Arg Arg Glu Glu Cys

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Val Val Ile Glu Asn Ala Ile Leu Gly Val Glu Ala Ala Lys Asn Ala

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Arg Ile Tyr Cys Ile Gly Val Pro Thr Tyr Val Glu Pro Ser His Leu

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Asp Lys Ala Asp Leu Val Val Glu Asp His Arg Gln Leu Met Gln His

195 200 205

Leu Leu Ser Leu Glu Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gln

210 215 220

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 双孢嗜热双孢菌ATCC 19993（Thermobispora bispora strain ATCC 19993）

<400> 4

Met Asp Val Val Leu Phe Asp Met Asp Gly Leu Leu Val Asp Thr Glu

1 5 10 15

Arg Leu Trp Phe Ala Val Glu Thr Glu Val Val Glu Arg Leu Gly Gly

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Ser Trp Gly Pro Glu His Gln Arg Gln Leu Val Gly Gly Ser Leu Lys

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Arg Ala Val Ala Tyr Met Leu Glu His Thr Gly Ala Asp Val Asp Pro

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115 120 125

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Tyr Leu Thr Ala Leu Ala Met Leu Ser Ala Asp Pro Ala Arg Ser Val

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Ala Leu Glu Asp Ser Pro Asn Gly Val Ala Ser Ala Val Ala Ala Gly

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Gly Val Thr Val Leu Pro Ala Leu Thr His Ala Asp Val Gly Leu Leu

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Arg Ser Leu Val Gly

210

<210> 5

<211> 237

<212> PRT

<213> 嗜热螺旋体ATCC 49972（Spirochaeta thermophila ATCC 49972）

<400> 5

Met Arg Lys Arg Arg Glu Cys Ala Pro Pro Gly Ile Arg Ala Ala Ile

1 5 10 15

Phe Asp Met Asp Gly Thr Leu Val Asn Ser Glu Asp Val Tyr Trp Asp

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Ala Asp Cys Ala Phe Leu Asp Arg Tyr Gly Ile Pro His Asp Asp Ala

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Leu Arg Glu Tyr Met Ile Gly Arg Gly Thr Lys Gly Phe Ile Glu Trp

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Met Arg Thr Gln Lys Glu Ile Pro Arg Ser Asp Glu Glu Leu Ala Arg

65 70 75 80

Glu Lys Met Glu Val Phe Leu Ala His Ala Arg Gly Arg Val Gln Val

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Phe Pro Glu Met Arg Arg Leu Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Gly Met

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Pro Cys Ala Leu Ala Ser Gly Ser Pro Arg Gly Ile Ile Glu Val Leu

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Leu Glu Glu Thr Gly Leu Ala Gly Phe Phe Arg Val Val Val Ser Ala

130 135 140

Asp Glu Val Ala Arg Pro Lys Pro Ala Pro Asp Val Phe Leu Glu Ala

145 150 155 160

Ala Gly Arg Leu Gly Val Glu Pro Gly Gly Cys Val Val Phe Glu Asp

165 170 175

Ser Glu Pro Gly Val Arg Ala Gly Leu Asp Ala Gly Met Val Cys Val

180 185 190

Ala Ile Pro Thr Leu Val Lys Asp Arg Tyr Pro Glu Val Phe Tyr Gln

195 200 205

Ala Asp Val Leu Phe Glu Gly Gly Met Gly Glu Phe Ser Ala Glu Arg

210 215 220

Val Trp Glu Trp Leu Gly Cys Gly Val Gly Val Gly Arg

225 230 235

<210> 6

<211> 219

<212> PRT

<213> 嗜热球杆菌20745（Sphaerobacter thermophiles 20745）

<400> 6

Met Ser Gln Gly Val Arg Gly Val Val Phe Asp Leu Asp Gly Leu Leu

1 5 10 15

Val Glu Ser Glu Glu Tyr Trp Glu Gln Ala Arg Arg Glu Phe Val Ser

20 25 30

Arg Tyr Gly Gly Thr Trp Gly Asp Asp Ala Gln Gln Ala Val Met Gly

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Pro Leu Thr Glu Glu Glu Ile Ala Ala Ala Val Ile Ala Arg Met Gln

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Glu Leu Tyr His Asp His Leu Pro Leu Leu Pro Gly Ala Ile Pro Ala

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Val Arg Ala Leu Ala Asp Arg Tyr Pro Leu Ala Val Ala Ser Ser Ser

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Pro Pro Val Leu Ile Arg Phe Val Leu Ala Glu Met Gly Val Ala Glu

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Cys Phe Gln Ser Val Thr Ser Ser Asp Glu Val Ala His Gly Lys Pro

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Glu Gln Ala Val Ala Phe Glu Asp Ser Thr Ala Gly Ile Ala Ala Ala

165 170 175

Leu Ala Ala Gly Leu Arg Val Ile Ala Val Pro Asn Arg Ser Tyr Pro

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Pro Asp Pro Asp Val Leu Arg Arg Ala Asp Leu Thr Leu Pro Ser Leu

195 200 205

Glu Glu Phe Asp Pro Ala Val Leu Glu Gln Trp

210 215

<210> 7

<211> 424

<212> PRT

<213> 嗜热假丝酵母念珠菌3( Candidatus Thermofonsia Clade 3 bacterium)

<400> 7

Met Thr Tyr Leu Asp Tyr Leu Thr Ala Ser His His Ser Gly Lys Pro

1 5 10 15

Ile Gly Leu Ser Ser Ile Cys Ser Ala His Pro Trp Val Leu Arg Thr

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420

<210> 8

<211> 822

<212> PRT

<213> 海栖热袍菌（Thermotoga maritima）

<400> 8

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Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys

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275 280 285

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290 295 300

Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp Arg Phe Pro Phe Asp Phe Val Glu

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Lys Lys Leu Thr Lys Phe Phe Glu Gly Phe Glu Ser Lys Glu Leu Leu

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<210> 9

<211> 456

<212> PRT

<213> 超嗜热球菌（Thermococcus kodakaraensis）

<400> 9

Met Gly Lys Leu Phe Gly Thr Phe Gly Val Arg Gly Ile Ala Asn Glu

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Leu Leu Arg Glu Leu Gly Cys Lys Val Val Ser Val Asn Ala His Pro

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Asp Gly His Phe Pro Ala Arg Asn Pro Glu Pro Asn Glu Glu Asn Leu

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Leu Arg Glu Asn Gly Gly Gly Leu Leu Val Thr Thr Ile Ala Thr Ser

275 280 285

Asn Leu Leu Asp Asp Ile Ala Lys Arg Asn Gly Ala Lys Val Met Arg

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355 360 365

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370 375 380

Ala Ile Val Ala Lys Val Ala Glu Leu Ala Glu Lys Lys Gly Tyr Lys

385 390 395 400

Ile Asp Thr Thr Asp Gly Thr Lys Ile Ile Phe Asp Asp Gly Trp Val

405 410 415

Leu Val Arg Ala Ser Gly Thr Glu Pro Ile Ile Arg Ile Phe Ser Glu

420 425 430

Ala Lys Ser Glu Glu Lys Ala Arg Glu Tyr Leu Glu Leu Gly Ile Lys

435 440 445

Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Gly

450 455

<210> 10

<211> 408

<212> PRT

<213> 嗜热网球菌（Dictyoglomus thermophilum）

<400> 10

Met Trp Leu Ser Lys Asp Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Val Tyr Ser Ile

1 5 10 15

Cys Ser Ser Asn Pro Tyr Val Ile Glu Ala Ser Val Glu Phe Ala Lys

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Glu Lys Asn Asp Tyr Ile Leu Ile Glu Ala Thr Pro His Gln Ile Asn

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Val Met Gly Ile Ile Lys Glu Lys Gly Ile Glu Glu Asp Arg Val Ile

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Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu Pro Trp Gln Asp Glu Pro Ser

85 90 95

Ser Ser Ala Met Lys Lys Ala Lys Asp Leu Ile Arg Ala Phe Val Glu

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Ser Gly Tyr Lys Lys Ile His Leu Asp Cys Ser Met Ser Leu Ser Asp

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130 135 140

Leu Leu Glu Val Ala Glu Glu Thr Ala Arg Lys Tyr Asn Phe Gln Pro

145 150 155 160

Val Tyr Val Val Gly Thr Asp Val Pro Val Ala Gly Gly Gly Glu Glu

165 170 175

Glu Gly Ile Thr Ser Val Glu Asp Phe Arg Val Ala Ile Ser Ser Leu

180 185 190

Lys Lys Tyr Phe Glu Asp Val Pro Arg Ile Trp Asp Arg Ile Ile Gly

195 200 205

Phe Val Ile Met Leu Gly Ile Gly Phe Asn Tyr Glu Lys Val Phe Glu

210 215 220

Tyr Asp Arg Ile Lys Val Arg Lys Ile Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu

225 230 235 240

Asn Leu Phe Val Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Lys Arg Ala

245 250 255

Leu Arg Asp Met Val Glu Asp Gly Val Arg Ile Leu Lys Val Gly Pro

260 265 270

Ala Leu Thr Ala Ser Phe Arg Arg Gly Val Phe Leu Leu Ser Ser Ile

275 280 285

Glu Asp Glu Leu Ile Ser Glu Asp Lys Arg Ser Asn Ile Lys Lys Val

290 295 300

Val Leu Glu Thr Met Leu Lys Asp Asp Lys Tyr Trp Arg Lys Tyr Tyr

305 310 315 320

Lys Asp Ser Glu Arg Leu Glu Leu Asp Ile Trp Tyr Asn Leu Leu Asp

325 330 335

Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp Glu Tyr Lys Glu Ile Lys Ile Ala Leu Asn

340 345 350

Arg Leu Phe Glu Asn Phe Ser Glu Gly Val Asp Ile Arg Tyr Ile Tyr

355 360 365

Gln Tyr Phe Tyr Asp Ser Tyr Phe Lys Val Arg Glu Gly Lys Ile Arg

370 375 380

Asn Asp Pro Arg Glu Leu Ile Lys Asn Glu Ile Lys Lys Val Leu Glu

385 390 395 400

Asp Tyr His Tyr Ala Val Asn Leu

405

<210> 11

<211> 223

<212> PRT

<213> 闪烁古生球菌（Archaeoglobus fulgidus）

<400> 11

Met Phe Lys Pro Lys Ala Ile Ala Val Asp Ile Asp Gly Thr Leu Thr

1 5 10 15

Asp Arg Lys Arg Ala Leu Asn Cys Arg Ala Val Glu Ala Leu Arg Lys

20 25 30

Val Lys Ile Pro Val Ile Leu Ala Thr Gly Asn Ile Ser Cys Phe Ala

35 40 45

Arg Ala Ala Ala Lys Leu Ile Gly Val Ser Asp Val Val Ile Cys Glu

50 55 60

Asn Gly Gly Val Val Arg Phe Glu Tyr Asp Gly Glu Asp Ile Val Leu

65 70 75 80

Gly Asp Lys Glu Lys Cys Val Glu Ala Val Arg Val Leu Glu Lys His

85 90 95

Tyr Glu Val Glu Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Arg Lys Ser Glu Val Cys

100 105 110

Met Arg Arg Ser Phe Asp Ile Asn Glu Ala Arg Lys Leu Ile Glu Gly

115 120 125

Met Gly Val Lys Leu Val Asp Ser Gly Phe Ala Tyr His Ile Met Asp

130 135 140

Ala Asp Val Ser Lys Gly Lys Ala Leu Lys Phe Val Ala Glu Arg Leu

145 150 155 160

Gly Ile Ser Ser Ala Glu Phe Ala Val Ile Gly Asp Ser Glu Asn Asp

165 170 175

Ile Asp Met Phe Arg Val Ala Gly Phe Gly Ile Ala Val Ala Asn Ala

180 185 190

Asp Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Ala Asp Leu Val Thr Pro Ser Pro Asp

195 200 205

Gly Glu Gly Val Val Glu Ala Leu Gln Phe Leu Gly Leu Leu Arg

210 215 220

<210> 12

<211> 659

<212> PRT

<213> 嗜热高温球菌（Thermococcus litoralis）

<400> 12

Met Glu Arg Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln Pro Leu

1 5 10 15

Gly Asn Phe Gly Trp Val Phe Glu Glu Ala Tyr Asn Arg Ser Tyr Arg

20 25 30

Pro Phe Met Glu Ile Leu Glu Glu Phe Pro Glu Met Lys Val Asn Val

35 40 45

His Phe Ser Gly Pro Leu Leu Glu Trp Ile Glu Glu Asn Lys Pro Asp

50 55 60

Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Ser Leu Ile Lys Arg Gly Gln Leu Glu Ile

65 70 75 80

Val Val Ala Gly Phe Tyr Glu Pro Val Leu Ala Ala Ile Pro Lys Glu

85 90 95

Asp Arg Leu Val Gln Ile Glu Met Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Lys Leu

100 105 110

Gly Tyr Asp Ala Lys Gly Val Trp Leu Thr Glu Arg Val Trp Gln Pro

115 120 125

Glu Leu Val Lys Ser Leu Arg Glu Ala Gly Ile Glu Tyr Val Val Val

130 135 140

Asp Asp Tyr His Phe Met Ser Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Phe

145 150 155 160

Trp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asp Gly Gly Glu Val Ile Thr Val Phe Pro

165 170 175

Ile Asp Glu Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Pro Phe Arg Pro Val Lys Lys

180 185 190

Thr Ile Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro Ser Lys Val

195 200 205

Ala Val Phe His Asp Asp Gly Glu Lys Phe Gly Val Trp Pro Gly Thr

210 215 220

Tyr Glu Trp Val Tyr Glu Lys Gly Trp Leu Arg Glu Phe Phe Asp Ala

225 230 235 240

Ile Thr Ser Asn Glu Lys Ile Asn Leu Met Thr Tyr Ser Glu Tyr Leu

245 250 255

Ser Lys Phe Thr Pro Arg Gly Leu Val Tyr Leu Pro Ile Ala Ser Tyr

260 265 270

Phe Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Pro Ala Lys Gln Ala Lys Leu Phe

275 280 285

Val Glu Phe Val Glu Gln Leu Lys Glu Glu Gly Lys Phe Glu Lys Tyr

290 295 300

Arg Val Phe Val Arg Gly Gly Ile Trp Lys Asn Phe Phe Phe Lys Tyr

305 310 315 320

Pro Glu Ser Asn Phe Met His Lys Arg Met Leu Met Val Ser Lys Ala

325 330 335

Val Arg Asp Asn Pro Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Leu Lys Ala Gln Cys

340 345 350

Asn Asp Ala Tyr Trp His Gly Val Phe Gly Gly Ile Tyr Leu Pro His

355 360 365

Leu Arg Arg Thr Val Trp Glu Asn Ile Ile Lys Ala Gln Arg Tyr Leu

370 375 380

Lys Pro Glu Asn Lys Ile Leu Asp Val Asp Phe Asp Gly Arg Ala Glu

385 390 395 400

Ile Met Val Glu Asn Asp Gly Phe Ile Ala Thr Ile Lys Pro His Tyr

405 410 415

Gly Gly Ser Ile Phe Glu Leu Ser Ser Lys Arg Lys Ala Val Asn Tyr

420 425 430

Asn Asp Val Leu Pro Arg Arg Trp Glu His Tyr His Glu Val Pro Glu

435 440 445

Ala Thr Lys Pro Glu Lys Glu Ser Glu Glu Gly Ile Ala Ser Ile His

450 455 460

Glu Leu Gly Lys Gln Ile Pro Glu Glu Ile Arg Arg Glu Leu Ala Tyr

465 470 475 480

Asp Trp Gln Leu Arg Ala Ile Leu Gln Asp His Phe Ile Lys Pro Glu

485 490 495

Glu Thr Leu Asp Asn Tyr Arg Leu Val Lys Tyr His Glu Leu Gly Asp

500 505 510

Phe Val Asn Gln Pro Tyr Glu Tyr Glu Met Ile Glu Asn Gly Val Lys

515 520 525

Leu Trp Arg Glu Gly Gly Val Tyr Ala Glu Glu Lys Ile Pro Ala Arg

530 535 540

Val Glu Lys Lys Ile Glu Leu Thr Glu Asp Gly Phe Ile Ala Lys Tyr

545 550 555 560

Arg Val Leu Leu Glu Lys Pro Tyr Lys Ala Leu Phe Gly Val Glu Ile

565 570 575

Asn Leu Ala Val His Ser Val Met Glu Lys Pro Glu Glu Phe Glu Ala

580 585 590

Lys Glu Phe Glu Val Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Gly Lys Val Arg Ile

595 600 605

Glu Leu Asp Lys Ala Ala Lys Val Trp Lys Phe Pro Ile Lys Thr Leu

610 615 620

Ser Gln Ser Glu Ala Gly Trp Asp Phe Ile Gln Gln Gly Val Ser Tyr

625 630 635 640

Thr Met Leu Phe Pro Ile Glu Lys Glu Leu Glu Phe Thr Val Arg Phe

645 650 655

Arg Glu Leu

Claims

1.一种由糖类生产塔格糖的改进方法，所述改进包括使用果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将果糖-6-磷酸(F6P)转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)，其中所述F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

2.一种由糖类生产塔格糖的改进方法，所述改进包括使用塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖，其中所述T6PP包含与ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括使用果糖-6-磷酸差向异构酶(F6PE)将果糖-6-磷酸(F6P)转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)的步骤，其中所述F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括将葡萄糖-6-磷酸(G6P)转化为F6P的步骤，其中该步骤由磷酸葡萄糖异构酶(PGI)催化。

5.根据权利要求4所述的方法，进一步包括将葡萄糖-1-磷酸(G1P)转化为G6P的步骤，其中该步骤由磷酸葡萄糖变位酶(PGM)催化。

6.根据权利要求5所述的方法，进一步包括将糖类转化为G1P的步骤，其中该步骤由至少一种酶催化，其中所述糖类选自由淀粉或其衍生物、纤维素或其衍生物和蔗糖组成的组。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一种酶选自由α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)、麦芽糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶和纤维素磷酸化酶组成的组。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述糖类是淀粉或其衍生物，选自由直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽糖、麦芽三糖和葡萄糖组成的组。

9.根据权利要求8所述的方法，进一步包括将淀粉转化为淀粉衍生物的步骤，其中所述淀粉衍生物是通过淀粉的酶促水解或淀粉的酸水解制备的。

10.根据权利要求9所述的方法，其中将4-葡聚糖转移酶(4GT)加入到该方法中。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述淀粉衍生物是通过将由异淀粉酶、支链淀粉酶、α-淀粉酶或其组合催化的酶水解淀粉而制备的。

12.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括：

由至少一种酶催化的将果糖转化为F6P的步骤；和

任选地，由至少一种酶催化的将蔗糖转化为果糖的步骤。

13.根据权利要求4所述的方法，进一步包括：

由至少一种酶催化的将葡萄糖转化为G6P的步骤，和

任选地，由至少一种酶催化的将蔗糖转化为葡萄糖的步骤。

14.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法是用于生产塔格糖的酶促方法，包括以下步骤：

(i)使用一种或多种酶将糖类转化为葡萄糖-1-磷酸(G1P)，其中所述糖类选自由淀粉、淀粉的一种或多种衍生物或其组合组成的组；

(ii)使用磷酸葡萄糖变位酶(PGM)将G1P转化为葡萄糖-6-磷酸(G6P)；

(iii)使用磷酸葡萄糖异构酶(PGI)将G6P转化为果糖6-磷酸(F6P)；

(iv)使用果糖-6磷酸差向异构酶(F6PE)将F6P转化为塔格糖-6-磷酸(T6P)，以及

(v)使用塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)将T6P转化为塔格糖，其中T6PP包含与SEQ IDNOs 3或4具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列；

所述工艺步骤(i)-(v)是在单个反应容器中进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述F6PE包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所述工艺步骤是在以下至少一种工艺条件下进行的：

在约37℃至约85℃的温度范围内，

在约5.0至约9.0的pH范围内，或

进行约1小时至48小时。

17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述工艺步骤在以下至少一种工艺条件下进行：

不含三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸盐的来源，

不含烟酰胺腺苷二核苷酸，

磷酸盐浓度由约0.1mM至约150mM，

Mg²⁺浓度在约0.1mM至50mM，

其中磷酸盐可循环利用，和

其中所述方法的至少一个步骤涉及能量有利的化学反应。

18.根据权利要求17所述的方法，其中磷酸盐可循环利用，并且其中T6P通过T6PP脱磷酸化而产生的磷酸根离子被用于将糖类转化为G1P的工艺步骤。

19.根据权利要求17所述的方法，其中将T6P转化为塔格糖的步骤是能量有利且不可逆的磷酸酶反应。

20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，进一步包括分离回收所产生的塔格糖的步骤，其中所述分离回收不是通过色谱分离。

21.根据权利要求14或15所述的方法，其中淀粉衍生物选自由直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖组成的组。

22.由权利要求1-21中任一项所述的方法生产的塔格糖。

23.一种消费品，其包含由权利要求1-21中任一项所述的方法生产的塔格糖。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，与源自嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)(Uniprot ID B5YBD7)的F6PE相比，所述F6PE具有更高的活性。

25.根据权利要求2所述的方法，其中，与源自闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)(Uniprot ID O29805)的T6PP相比，所述T6PP具有更高的活性。

26.根据权利要求24所述的方法，其中，与源自嗜热网球菌(Dictyoglomusthermophilum)(Uniprot ID B5YBD7)的F6PE相比，所述F6PE具有提高至少10％的活性。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，与源自闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)(Uniprot ID O29805)的T6PP相比，所述T6PP具有提高至少10％的活性。