KR20210096084A

KR20210096084A - 타가토스의 효소적 생산

Info

Publication number: KR20210096084A
Application number: KR1020217014631A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 조셉 위첼렉키
Original assignee: 보너모스, 인코포레이티드
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2021-08-04
Also published as: BR112021007438A2; EP3867393A1; CA3117105A1; US20210388404A1; WO2020081959A1; MA53928A; JP2022512728A; AU2019362044A1; EP3867393A4; CN113366112A; MX2021004035A; JP2024075570A

Abstract

본원에는 F6PE에 의해 촉매되는 F6P의 T6P로의 전환 단계; 및 T6PP에 의해 촉매되는 T6P의 타가토스로의 전환 단계를 포함하는 개선된 타가토스 제조 방법이 개시되고, 이러한 제조 방법은 타가토스를 생산하는 방법에 있어서 이전에 사용된 F6PE 및 T6PP에 비해 더 높은 활성을 갖는 효소를 사용한다.

Description

타가토스의 효소적 생산

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2018년 10월 19일에 출원된 미국 출원 제62/747,877호 및 2019년 1월 10일에 출원된 미국 출원 제62/790,788호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원 각각은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 D-타가토스 생산과 관련된 생명공학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 당류(예를 들어, 다당류, 올리고당류, 이당류, 수크로스, D-글루코스 및 D-프럭토스)를 D-타가토스로 효소적으로 전환시킬 수 있는 개선된 D-타가토스 제조 방법을 제공한다.

D-타가토스(이하, 타가토스)는 단맛이 수크로스의 92%이지만 칼로리가 단지 38%인 저칼로리 천연 감미료이다. 타가토스의 높은 판매 가격으로 인해 감미료로서의 이의 사용은 제한되었다. 타가토스는 수많은 건강상의 이점을 자랑한다: 그것은 저칼로리이고; 그것은 3의 매우 낮은 혈당 지수를 가지며; 그것은 글루코스의 혈당 지수를 20% 감소시키며; 그것은 평균 혈당 수준을 저하시킬 수 있고; 그것은 고밀도 지단백질(HDL) 콜레스테롤을 촉진함으로써 심혈관 질환, 뇌졸중 및 기타 혈관 질환을 예방하고; 그것은 검증된 프리바이오틱 및 항산화제이다. Lu et al., Tagatose, a New Antidiabetic and Obesity Control Drug, Diabetes Obes. Metab. 10(2): 109-34 (2008). 이와 같이, 타가토스는 소모성 제품 및 약제, 생명공학, 학술, 식품, 음료, 식이 보충제 및 식료품 산업과 같은 다양한 산업에서 다양한 용도를 갖는다.

타가토스는 주로 D-글루코스 및 D-갈락토스를 형성하기 위한 락타제에 의한 락토스의 가수분해를 통해 생산되고 있다(WO 2011/150556, CN 103025894, US 5,002,612, US 6,057,135 및 US 8,802,843 참조). 이어서 D-갈락토스는 알칼리 조건 하에 수산화칼슘에 의해 화학적으로 또는 pH 중성 조건 하에 L-아라비노스 이소머라제에 의해 효소적으로 D-타가토스로 이성체화된다. 최종 생성물은 여과 및 이온 교환 크로마토그래피의 조합에 의해 단리된다. 상기 방법은 D-글루코스와 D-갈락토스의 값비싼 분리 및 낮은 생성물 수율로 인해 어려움을 겪는다. 미생물 세포 발효를 통한 몇 가지 방법이 개발 중에 있지만, 값비싼 공급원료(예를 들어, 갈락티톨 및 D-사이코스)에 대한 의존성, 낮은 생성물 수율 및 값비싼 분리로 인해, 어느 것도 실용적인 대안인 것으로 입증되지 않았다. 다른 타가토스 제조 방법도 보고되었다. 예를 들어, 문헌[Lee et al., Scientific Reports | 7: 1934 | DOI:10.1038/s41598-017-02211-3, pp. 1-8]; 미국 특허공개 제2018/0023073호; 국제 특허출원공개 제WO 2014/196811호, 제WO 2018/004310호, 제WO 2018/021894호, 제WO 2018/182344호, 제WO 2018/182345호, 제WO 2018/182354호, 제WO 2018/182355호 및 제WO 2016/064146호 참조.

국제 특허출원공개 제WO 2017/059278호는 최근에 에피머라제, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제에 의해 촉매되는 프럭토스 6-포스페이트(F6P)의 타가토스 6-포스페이트(T6P)로의 전환 단계; 및 포스파타제, 타가토스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 촉매되는 T6P의 타가토스로의 전환 단계를 포함하는 방법에서의 타가토스의 효소적 합성을 설명하였다. 그러나, 효소적 타가토스 생산의 개선에도 불구하고, 예를 들어 더 적은 양의 효소로 더 높은 수율을 제공할 수 있는 더욱 개선된 타가토스 생산 방법을 제공하기 위한 요구와 필요성이 여전히 있다. 타가토스 생산 비용을 감소시키는 데 강한 산업적 및 상업적 관심이 있으며, 이러한 감소는 감소된 양의 효소 사용 및 이전에 사용된 효소보다 더욱 효과적인 효소들의 조합의 사용을 필요로 한다.

본 발명은 당류(예를 들어, 다당류, 올리고당류, 이당류, 수크로스, D-글루코스 및 D-프럭토스)를 타가토스로 효소적으로 전환시킬 수 있는 개선된 타가토스 제조 방법을 제공한다. 일 측면에서, 당류로부터 타가토스를 생산하기 위한 본 발명의 개선된 방법은 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 사용하여 프럭토스-6-포스페이트(F6P)를 타가토스 6-포스페이트(T6P)로 전환시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 F6PE는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 측면에서, 당류로부터 타가토스를 생산하기 위한 본 발명에 따른 개선된 방법은 타가토스-6-포스페이트 포스파타제(T6PP)를 사용하여 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 T6PP는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 개선된 방법은 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 사용하여 프럭토스-6-포스페이트(F6P)를 타가토스 6-포스페이트(T6P)로 전환시키고 상기 F6PE가 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타제(T6PP)를 사용하여 T6P를 타가토스로 전환시키고 상기 T6PP가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부 개선된 방법에서, 타가토스 제조 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트(G6P)를 F6P로 전환시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 단계는 포스포글루코스 이소머라제(PGI)에 의해 촉매된다. 본 발명에 따른 일부 방법은 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 G6P로의 전환 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 일부 방법은 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 당류의 G1P로의 전환 단계를 추가로 포함한다.

상기 방법들 중 임의의 것에서 사용되는 당류는 전분 또는 이의 유도체, 셀룰로스 또는 이의 유도체 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 전분 또는 이의 유도체는 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토스, 말토트리오스 또는 글루코스일 수 있다. 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 타가토스 제조 방법은 효소적 가수분해에 의해 또는 전분의 산 가수분해에 의해 전분을 전분 유도체로 전환시키는 것을 포함한다. 다른 방법에서, 전분 유도체는 이소아밀라제, 풀루라나제, 알파-아밀라제 또는 이들 효소 중 둘 이상의 조합에 의해 촉매되는 전분의 효소적 가수분해에 의해 제조된다. 본 발명의 일부 방법은 또한 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 타가토스 제조 방법은 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프럭토스의 F6P로의 전환 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 방법은 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 수크로스의 프럭토스로의 전환 단계를 추가로 포함한다. 일부 타가토스 제조 방법에서 사용될 G6P는 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스의 G6P로의 전환에 의해 생성될 수 있다. 글루코스는 다시 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 수크로스의 글루코스로의 전환에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 방법은 약 37℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도, 약 5.0 내지 약 9.0 범위의 pH 및/또는 약 1시간 내지 약 48시간을 포함하는 반응 조건 하에 또는 연속적 반응으로서 수행된다. 일부 실시형태에서, 타가토스 제조 방법의 단계들은 하나의 생물반응기에서 이러한 반응 조건 하에 수행된다. 다른 실시형태에서, 단계들은 직렬로 배열된 복수의 생물반응기에서 이러한 반응 조건 하에 수행된다.

본 발명의 일부 방법에서, 타가토스를 제조하기 위한 단계는 약 0.1 mM 내지 약 150 mM의 포스페이트 농도에서 ATP-무함유, NAD(H)-무함유로 수행되고/되거나, 포스페이트는 재활용되고/되거나, T6P를 타가토스로 전환시키는 단계는 에너지면에서 유리한 화학 반응을 포함한다.

도 1은 전분 또는 이의 유래 생성물을 타가토스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; T6PP, 타가토스 6-포스페이트 포스파타제; IA, 이소아밀라아제; PA, 풀루라나제; MP, 말토스 포스포릴라제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제.
도 2는 셀룰로스 또는 이의 유래 생성물을 타가토스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한다. CDP, 셀로덱스트린 포스포릴라제; CBP, 셀로비오스 포스포릴라제; PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; T6PP, 타가토스 6-포스페이트 포스파타제.
도 3은 프럭토스를 타가토스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. PPFK, 폴리포스페이트 프럭토키나제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; T6PP, 타가토스 6-포스페이트 포스파타제.
도 4는 글루코스를 타가토스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. PPGK, 폴리포스페이트 글루코키나제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; T6PP, 타가토스 6-포스페이트 포스파타제.
도 5는 수크로스 또는 이의 유래 생성물을 타가토스로 전환시키는 효소적 경로를 도시한다. SP, 수크로스 포스포릴라제; PPFK, 폴리포스페이트 프럭토키나제; PGM, 포스포글루코뮤타제; PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; T6PP, 타가토스 6-포스페이트 포스파타제.
도 6은 글루코스 1-포스페이트를 타가토스로 전환시키기 위한 형성 깁스 에너지(formation Gibbs energy)에 기초한 중간체들 간의 반응 깁스 에너지를 도시한다.
도 7은 HPLC 크로마토그램에서 실시예 3에 설명된 바와 같은 F6P의 타가토스로의 전환을 도시한다. (실선) 0시간 크로마토그램; (점선) F6PE(Uniprot ID B5YBD7) 및 T6PP(Uniprot ID O29805) 사용시 2시간; 및 (점선) F6PE(Uniprot ID A0A0P6XN50) 및 T6PP(Uniprot ID D6YBK5)를 사용하는 개선된 방법 사용시 2시간; 도시된 피크는 (1) 없음(Void), (2) F6P 및 T6P, (3) 유리 포스페이트, (4) 타가토스 및 (5) 프럭토스이다.

본 발명은 일반적으로 당류를 타가토스로 전환시키기 위한 개선된 효소적 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 무세포(cell-free) 효소 칵테일을 사용하여 전분, 셀룰로스, 수크로스, 글루코스 및 프럭토스 및 이들의 유래 생성물과 같은 당류를 타가토스로 전환시키기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 세포-기반 제조 방법과 달리, 본 발명은 타가토스의 무세포 제조를 포함하고, 종종 세포의 안과 밖으로의 기질/생성물 수송을 느리게 하는 세포막의 제거로 인해 상대적으로 높은 반응 속도를 갖는다. 본 발명의 방법은 또한 영양소가 풍부한 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 생성한다.

일 측면에서, 본 발명은 타가토스를 생산하는 방법에서 이전에 사용된 F6PE 및/또는 T6PP에 비해 개선된 활성을 갖는 효소를 사용하는, F6PE에 의해 촉매되는 F6P의 T6P로의 전환 단계; 및 T6PP에 의해 촉매되는 T6P의 타가토스로의 전환 단계를 포함하는 개선된 타가토스 제조 방법에 관한 것이다. 예를 들어, F6PE 및 T6PP: 아나에롤리네아 서모필라(Anaerolinea thermophila) UNI-1 유래의 F6PE(Uniprot ID E8N0N6); 칼디셀룰로시룹터 크로노츠키엔시스(Caldicellulosiruptor kronotskyensis) 유래의 F6PE(Uniprot ID E4SEH3);칼딜리네아 아에로필라(Caldilinea aerophila) 유래의 F6PE(Uniprot ID I0I507); 칼디트릭스 아비씨(Caldithrix abyssi) 유래의 F6PE(Uniprot ID H1XRG1); 및 딕티오글로무스 서모필룸(Dictyoglomus thermophilum) 유래의 F6PE(Uniprot ID B5YBD7); 아르카에오글로부스 풀지두스(Archaeoglobus fulgidus) 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805); 아르카에오글로부스 프로푼두스(Archaeoglobus profundus) 유래의 T6PP(Uniprot ID D2RHV2_ARCPA); 및 아르카에오글로부스 베네피쿠스(Archaeoglobus veneficus) 유래의 T6PP(Uniprot ID F2KMK2_ARCVS)를 개시하는 국제 특허출원공개 WO2017/059278 참조. 더 높은 활성을 갖는 효소를 사용하는 것은 더 적은 양의 효소를 사용할 수 있게 하므로 전체 방법의 비용이 절감된다.

본 발명의 개선된 방법에서, F6PE는 이전에 개시된 딕티오글로무스 서모필룸 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID B5YBD7)와 비교하여 더 높은 활성을 갖는다. 국제 특허출원공개 WO2017/059278 참조. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 F6PE는 딕티오글로무스 서모필룸 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID B5YBD7)에 비해 적어도 10%, 적어도 30%, 적어도 80%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 180% 또는 적어도 200% 개선된 효소 활성을 갖는다. 예를 들어, 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 서마나에로트릭스 닥센시스(Thermanaerothrix daxensis) 유래의 호열성 F6PE(Uniprot A0A0P6XN50)는 딕티오글로무스 서모필룸 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID: B5YBD7)에 비해 약 150% 개선된 효소 활성을 갖고, 캔디다투스 서모폰시아 클라데 3(Candidatus Thermofonsia Clade 3) 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID　A0A2M8QBR9)는 딕티오글로무스 서모필룸 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID: B5YBD7)에 비해 약 120% 개선된 효소 활성을 갖고, 서모아나에로박테리움 서모사카롤리티큠(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 유래의 호열성 F6PE(Uniprot A0A223HVJ3)는 딕티오글로무스 서모필룸 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID B5YBD7)에 비해 약 178% 개선된 효소 활성을 갖는다. 하기 실시예는 효소를 이의 기질과 함께 항온배양한 다음, 반응물 및 생성물의 양을 HPLC를 통해 측정하는 것을 포함하는, F6PE의 활성을 결정하기 위한 프로토콜을 당업자에게 제공한다. 임의의 두 효소의 상대적 활성의 측정은 완충액, pH, 온도 등과 같은 동일한 반응 조건 하에 수행된다.

본 발명의 방법에 사용되는 F6PE는 F6P 및 T6P에 대해 특이적이다; F6PE에 의해 촉매되는 에피머화는 가역적 반응이다. 특이적은 반응에 존재하는 다른 인산화된 단당류보다 F6P/T6P에 대해 더 높은 활성을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, F6PE는 예를 들어 G6P에서보다 F6P/T6P에서 더 높은 에피머화 활성을 갖는다.

본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 F6PE의 예로는 하기의 단백질이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 서열번호 1에 열거된 아미노산 서열을 갖는 서마나에로트릭스 닥센시스 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID A0A0P6XN50); 서열번호 2에 열거된 아미노산 서열을 갖는 서모아나에로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID A0A223HVJ3); 서열번호 7에 열거된 아미노산 서열을 갖는 캔디다투스 서모폰시아 클라데 3 유래의 호열성 F6PE(Uniprot ID A0A2M8QBR9); 및 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 F6PE. 본 발명에 따른 당류로부터 타가토스를 생산하는 개선된 방법은 F6PE를 사용하여 프럭토스-6-포스페이트(F6P)를 타가토스 6-포스페이트(T6P)로 전환시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 F6PE는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 방법에 사용되는 F6PE는 F6P를 T6P로 전환시킬 수 있는 에피머라제이다. F6PE는 마그네슘, 망간, 코발트 또는 아연, 바람직하게는 마그네슘과 같은 2가 금속 보조인자를 사용한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 F6PE는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고 바람직하게는 알돌라제형 TIM 배럴을 함유한다. 문헌[Wichelecki et al.,(2015) J. Biol. Chem., v290, pp. 28963-76] 참조.

본 발명의 개선된 방법에서, T6PP는 이전에 개시된 아르카에오글로부스 풀지두스 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)와 비교하여 더 높은 활성을 갖는다. 국제 특허출원공개 WO2017/059278 참조. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 T6PP는 아르카에오글로부스 풀지두스 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)의 활성에 비해 적어도 10%, 적어도 30%, 적어도 80%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 300%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 900%, 적어도 1200%, 적어도 1500%, 적어도 1800% 또는 적어도 2100% 개선된 효소 활성을 갖는다. 예를 들어, 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 메타노사르시나 서모필라 CHTI-55 유래의 T6PP(Uniprot ID A0A0E3NCH4)는 아르카에오글로부스 풀지두스 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)에 비해 약 614% 개선된 효소 활성을 갖고, 서모비스포라 비스포라 균주(Thermobispora bispora) ATCC 19993 유래의 T6PP(Uniprot D6YBK5)는 아르카에오글로부스 풀지두스 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)에 비해 약 1328% 개선된 효소 활성을 갖고, 스피로카에타 서모필라(Spirochaeta thermophila) ATCC 49972 유래의 T6PP(Uniprot ID E0RT70)는 아르카에오글로부스 풀지두스 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)에 비해 약 2075% 개선된 효소 활성을 갖고, 스파에로박터 서모필루스 DSM 20745 유래의 T6PP(Uniprot ID D1C7G9)는 아르카에오글로부스 풀지두스 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)에 비해 약 814% 개선된 효소 활성을 갖는다. 하기 실시예는 효소를 이의 기질과 함께 항온배양한 다음, HPLC를 통해 반응물 및 생성물의 양을 측정하는 것을 포함하는 T6PP의 활성을 결정하기 위한 프로토콜을 당업자에게 제공한다. 임의의 두 효소의 상대적 활성 측정은 완충액, pH, 온도 등과 같은 동일한 반응 조건 하에 수행된다.

본 발명의 방법에 사용되는 T6PP는 T6P에 대해 특이적이다. T6PP의 경우, 특이적은 방법에서 다른 인산화된 단당류보다 T6P에서 더 높은 탈인산화 활성을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, T6PP는 예를 들어 G1P, G6P 및 F6P에서보다 T6P에서 더 높은 탈인산화 활성을 갖는다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 T6PP의 예로는 하기의 단백질이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 서열번호 3에 열거된 아미노산 서열을 갖는 메타노사르시나 서모필라 CHTI-55 유래의 T6PP(Uniprot ID A0A0E3NCH4); 서열번호 4에 열거된 아미노산 서열을 갖는 서모비스포라 비스포라 균주 ATCC 19993 유래의 T6PP(Uniprot ID D6YBK5); 서열번호 5에 열거된 아미노산 서열을 갖는 스피로카에타 서모필라 균주 ATCC 49972 유래의 T6PP(Uniprot ID E0RT70); 서열번호 6에 열거된 아미노산 서열을 갖는 스파에로박터 서모필루스 균주 DSM 20745 유래의 T6PP(Uniprot ID D1C7G9); 및 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 T6PP. 당류로부터 타가토스를 생산하기 위한 본 발명에 따른 방법은 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 사용하여 프럭토스-6-포스페이트(F6P)를 타가토스 6-포스페이트(T6P)로 전환시키고 타가토스-6-포스파타제(T6PP)를 사용하여 생성된 T6P를 타가토스로 전환시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 T6PP는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 방법에서, T6PP는 T6P를 타가토스로 전환시키는 포스파타제이다. T6PP는 아연, 망간, 코발트 또는 마그네슘, 바람직하게는 마그네슘과 같은 2가 금속 보조인자를 사용한다. 본 발명의 방법에서, T6PP는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖고; 바람직하게는 촉매 작용을 위한 로스마노이드 폴드 도메인(Rossmanoid fold domain) 및 추가적으로 기질 특이성을 위한 C1 캡핑 도메인; 마그네슘 배위를 위한, 상기 로스마노이드 폴드의 1번째 β-가닥 내의 DxD 시그니처(signature)(여기서, 2번째 Asp는 일반적인 산/염기 촉매이다); 반응 중간체의 안정성에 도움을 주는 로스마노이드 폴드의 2번째 β-가닥의 말단에 있는 Thr 또는 Ser; 반응 중간체의 안정성에 도움을 주는 로스마이드 폴드의 3번째 β-가닥의 C-말단 α-나선의 N-말단에 있는 Lys; 및 마그네슘과 같은 2가 금속 양이온을 배위하기 위한 로스마노이드 폴드의 4번째 β-가닥의 말단에 있는 E(D/N) 시그니처. 예를 들어, 문헌[Burroughs et al., Evolutionary Genomics of the HAD Superfamily: Understanding the Structural Adaptations and Catalytic Diversity in a Superfamily of Phosphoesterases and Allied Enzymes. J. Mol. Biol. 2006; 361; 1003-1034] 참조.

본 발명에 따른 바람직한 효소적 방법은 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 사용하여 프럭토스-6-포스페이트(F6P)를 타가토스 6-포스페이트(T6P)로 전환시키고 상기 F6PE가 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타제(T6PP)를 사용하여 T6P를 타가토스로 전환시키고 상기 T6PP가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계를 포함한다. 보다 바람직하게는, F6PE는 서열번호 2에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, T6PP는 서열번호 5에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 가장 바람직하게는, F6PE는 서열번호 2에 열거된 아미노산 서열을 갖고, T6PP는 서열번호 5에 열거된 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명에 따른 당류로부터 타가토스를 제조하는 방법은 또한 글루코스 6-포스페이트(G6P)를 F6P로 효소적으로 전환시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 단계는 포스포글루코스 이소머라제(PGI)에 의해 촉매된다. 사용될 수 있는 예시적인 PGI는 국제 특허출원공개 WO2017/059278에 개시된 것들: 클로스트리듐 서모셀룸(Clostridium thermocellum) 유래의 PGI(Uniprot ID A3DBX9) 및 서머스 서모필루스(Thermus thermophilus) 유래의 PGI(Uniprot ID Q5SLL6)를 포함한다.

본 발명에 따른 타가토스의 제조 방법은 글루코스 1-포스페이트(G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 단계는 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매된다. PGM의 예는 국제 특허출원공개 WO2017/059278에 개시된 서모코쿠스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis) 유래의 PGM(Uniprot ID Q68BJ6)이다.

추가로, 본 발명에 따른 방법은 당류를 G1P로 전환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 단계는 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되고, 당류는 전분 또는 이의 유도체(도 1), 셀룰로스 또는 이의 유도체(도 2), 프럭토스(도 3), 글루코스(도 4) 및 수크로스(도 5)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 방법에서 당류를 G1P로 전환시키는 단계에서 사용되는 효소 또는 효소들은 알파-글루칸 포스포릴라제(αGP), 말토스 포스포릴라제, 수크로스 포스포릴라제, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 셀로비오스 포스포릴라제 및/또는 셀룰로스 포스포릴라제 및 이들의 혼합물일 수 있다. F6P에 이르기 위한 효소 또는 효소 조합의 선택은 본 방법에 사용되는 당류에 따라 좌우된다.

셀룰로스는 가장 풍부한 생물 자원이며 식물 세포벽의 주요 성분이다. 비-식품 리그노셀룰로스 바이오매스는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌뿐만 아니라 기타 미량 성분을 포함한다. 아비셀(Avicel)(미정질 셀룰로스), 재생된 무정형 셀룰로스, 세균 셀룰로스, 필터 페이퍼 등을 비롯한 순수한 셀룰로스는 일련의 처리를 통해 제조될 수 있다. 부분적으로 가수분해된 셀룰로스 기질은 중합도가 7보다 큰 수불용성 셀로덱스트린, 3 내지 6의 중합도를 갖는 수용성 셀로덱스트린, 셀로비오스, 글루코스 및 프럭토스를 포함한다.

본 발명에 따른 특정 방법에서, 셀룰로스 및 이의 유래 생성물은 일련의 단계들을 통해 타가토스로 전환될 수 있다. 도 2 참조. 예를 들어, 본 발명에 따른 방법은 하기의 단계: 각각, 셀로덱스트린 포스포릴라제(CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제(CBP)에 의해 촉매되는 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터의 G1P 생성 단계; PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; PGI에 의해 촉매되는 G6P의 F6P로의 전환 단계; 상기 설명한 바와 같은 F6P의 타가토스로의 전환 단계를 포함하는 경로를 제공하고, 포스페이트 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환시키는 단계에 의해 재활용될 수 있다.

고체 셀룰로스를 수용성 셀로덱스트린 및 셀로비오스로 가수분해하기 위해 몇 가지 효소가 사용될 수 있다. 이러한 효소는 엔도글루카나제 및 셀로비오하이드롤라제를 포함하지만, 베타-글루코시다제(셀로비아제)를 포함하지 않는다. 셀룰로스 가수분해 및 G1P 생성 전에, 셀룰로스 및 바이오매스는 이들의 반응성을 증가시키고 셀룰로스 사슬의 중합도를 감소시키기 위해 전처리될 수 있다. 셀룰로스 및 바이오매스 전처리 방법은 묽은 산 전처리, 셀룰로스 용매-기반 리그노셀룰로스 분별, 암모니아 섬유 팽창, 수성 암모니아 침지, 이온성 액체 처리, 및 염산, 황산, 인산 및 이들의 조합을 비롯한 농축된 산을 사용하는 부분적 가수분해를 포함한다.

당류가 셀로비오스를 포함하고 효소가 셀로비오스 포스포릴라제를 함유하는 경우, G1P는 셀로비오스 포스포릴라제에 의해 셀로비오스로부터 생성된다. 당류가 셀로덱스트린을 함유하고 효소가 셀로덱스트린 포스포릴라제를 포함하는 경우, G1P는 셀로덱스트린 포스포릴라제에 의해 셀로덱스트린으로부터 생성된다. 당류가 셀룰로스를 포함하고 효소가 셀룰로스 포스포릴라제를 함유하는 경우, G1P는 셀룰로스 포스포스릴라제에 의해 셀룰로스로부터 생성된다.

당류가 말토스를 포함하고 효소가 말토스 포스포릴라제를 함유하는 경우, G1P는 말토스 포스포릴라제에 의해 말토스로부터 생성된다. 당류가 수크로스를 포함하고 효소가 수크로스 포스포릴라제를 함유하는 경우, G1P는 수크로스 포스포릴라제에 의해 수크로스로부터 생성된다.

당류가 전분 또는 전분 유도체인 경우, 유도체는 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토스, 말토트리오스 및 글루코스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 특정 방법에서, 당류를 G1P로 전환시키는 데 사용되는 효소는 αGP를 함유한다. 이러한 단계에서, 당류가 전분을 포함하는 경우, G1P는 αGP에 의해 전분으로부터 생성된다; 당류가 가용성 전분, 아밀로덱스트린 또는 말토덱스트린을 함유하는 경우, G1P는 αGP에 의해 가용성 전분, 아밀로덱스트린 또는 말토덱스트린으로부터 생성된다. αGP의 예는 국제 특허출원공개 WO2017/059278에 개시된 서모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 αGP(Uniprot ID G4FEH8)이다.

본 발명에 따른 일부 방법은 전분을 전분 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 전분 유도체는 전분의 효소적 가수분해에 의해 또는 전분의 산 가수분해에 의해 제조된다. 본 발명의 특정 방법에서, 말토스 포스포릴라제(MP)는 분해 산물 말토스를 G1P 및 글루코스로 가인산분해성으로 절단함으로써 타가토스 수율을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)는 분해 산물 글루코스, 말토스 및 말토트리오스를 αGP에 의해 가인산분해성으로 절단되어 G1P를 산출할 수 있는 더욱 긴 말토올리고당류로 재활용함으로써 타가토스 수율을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 4GT의 예는 국제 특허출원공개 WO2017/059278에 개시된 서모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래의 4GT(Uniprot ID O32462)이다. 본 발명의 일부 방법에서, 폴리포스페이트 및 폴리포스페이트 글루코키나제(PPGK)가 본 방법에 첨가될 수 있으며, 따라서 분해 산물 글루코스를 G6P로 인산화함으로써 타가토스의 수율을 증가시킬 수 있다.

전분은 자연에서 가장 널리 사용되는 에너지 저장 화합물이며 대부분 식물 종자에 저장되어 있다. 천연 전분은 선형 아밀로스 및 분지형 아밀로펙틴을 함유한다. 전분 유도체의 예로는 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로 스트린, 말토덱스트린, 말토스, 프럭토스 및 글루코스가 포함된다. 셀룰로스 유도체의 예로는 전처리된 바이오매스, 재생된 무정형 셀룰로스, 셀로덱스트린, 셀로비오스, 프럭토스 및 글루코스가 포함된다. 수크로스 유도체로는 프럭토스 및 글루코스가 포함된다.

방법이 전분 유도체를 사용하는 경우, 전분 유도체는 이소아밀라제, 풀루라나제, α-아밀라제 또는 이들의 조합에 의해 촉매되는 전분의 효소적 가수분해에 의해 제조될 수 있다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 방해하는 분지를 많이 함유한다. 이소아밀라아제는 전분을 탈분지화하여 선형 아밀로 덱스트린을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리된 전분은 최종 생성물에서 더 높은 F6P 농도를 초래할 수 있다. 이소아밀라아제 및 풀루라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라아제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단하고, 따라서 알파-아밀라아제는 타가토스로의 더 빠른 전환을 위해 전분을 단편으로 분해하는 데 사용된다.

타가토스는 또한 프럭토스로부터 생산될 수 있다. 도 3 참조. 본 발명에 따른 방법은 또한 프럭토스 F6P로 전환시키는 단계로서, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 단계 및 임의로, 수크로스를 프럭토스로 전환시키는 단계로서, 적어도 하나에 의해 촉매되는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 폴리포스페이트 프럭토키나제(PPFK)에 의해 촉매되는 프럭토스 및 폴리포스페이트로부터의 F6P 생성을 포함한다. F6P의 타가토스로의 전환은 상기 설명되어 있다. 프럭토스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생성될 수 있다. 이어서, T6P가 타가토스로 전환될 때 생성된 포스페이트 이온은 수크로스를 G1P로 전환시키는 단계에서 재활용될 수 있다.

타가토스는 또한 글루코스로부터 생산될 수 있다. 도 4 참조. 본 발명에 따른 방법은 또한 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스의 G6P로의 전환 단계 및 임의로, 수크로스를 프럭토스로 전환시키는 단계로서, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 폴리포스페이트 글루코키나제(PPGK)에 의해 촉매되는 글루코스 및 폴리포스페이트로부터의 G6P 생성을 포함한다. 글루코스는 예를 들어 수크로스의 효소적 전환에 의해 생산될 수 있다. 도 5 참조.

본 발명의 일부 방법에서, T6P가 타가토스로 전환될 때 생성된 포스페이트 이온은 특히, 방법이 단일 반응 용기에서 수행되는 경우에 전분 유도체를 G1P(예를 들어, 도 1 참조)로 전환시키거나, 셀룰로스 유도체를 G1P(예를 들어, 도 2 참조)로 전환시키거나 수크로스를 G1P(도 5 참조)로 전환시키는 단계에서 재활용된다. 또한, PPFK 및 폴리포스페이트는 SP에 의한 수크로스의 가인산분해성 절단에 의해 생성된 프럭토스로부터 F6P를 생산함으로써 타가토스 수율을 증가시키는 데 사용될 수 있다.

당류로부터 타가토스를 제조하는 방법은 예를 들어 하기의 단계를 포함한다: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 당류를 글루코스 1-포스페이트(G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제(PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제(PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계 및 (v) 타가토스 6-포스페이트 포스파타제(T6PP)를 통해 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계. 본 발명의 개선된 방법에서, F6PE는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 T6PP는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 이러한 방법들에서, 예를 들어 단계 (i)의 효소는 αGP이다. 전형적으로, 본 방법에 사용되는 효소 유닛(unit)의 비는 1:1:1:1:1(αGP:PGM:PGI:F6PE:T6PP)이다. 효소 유닛은 1 umol의 기질을 1분 내에 생성물로 전환시키는 데 필요한 효소의 양이다. 따라서, 더 높은 활성을 갖는 효소는 동일한 반응을 촉매하는 더 낮은 활성을 갖는 효소와 비교하여, 1 효소 유닛당 효소의 mg 측면에서 더 적은 양의 효소를 가질 것이다. 생성물 수율을 최적화하기 위해, 이러한 비를 임의의 수의 조합으로 조정할 수 있다. 예를 들어, 특정 효소는 다른 효소의 양에 비해 약 2x, 3x, 4x, 5x 등의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 타가토스 제조 방법은 하기의 추가 단계를 포함할 수 있다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의한 다당류 및 올리고당류로부터의 글루코스 생성 단계, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스의 G6P로의 전환 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의한 다당류 및 올리고당류로부터의 프럭토스 생성 단계 및 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프럭토스의 G6P로의 전환 단계. 다당류 및 올리고당류의 예는 위에 열거되어 있다.

본 발명에 따른 타가토스 제조 방법은 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 단계들은 직렬로 배열된 복수의 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수도 있다. 바람직한 방법에서, 타가토스의 효소적 생산은 단일 반응 용기에서 수행된다.

본 발명에 사용되는 효소는 가용성, 고정된, 조립된 또는 응집된 단백질의 형태를 취할 수 있다. 이들 효소는 당업계에 공지된 바와 같이 기능성을 개선하기 위해 일반적으로 사용되는 불용성 유기 또는 무기 지지체에 흡착될 수 있다. 여기에는 아가로스, 메타크릴레이트, 폴리스티렌 또는 덱스트란과 같은 중합체 지지체뿐만 아니라, 유리, 금속 또는 탄소계 재료와 같은 무기 지지체가 포함된다. 이들 재료는 종종 고정된 효소의 부착 및 활성을 촉진하는 큰 표면-대-용적 비 및 특수화된 표면을 갖도록 생산된다. 효소는 공유, 이온성 또는 소수성 상호작용을 통해 이들 고체 지지체에 부착될 수 있다. 효소는 또한 고체 지지체에 대한 친화도를 갖는 다른 단백질 또는 펩티드 서열, 가장 흔히 폴리-히스티딘 서열에 대한 공유 융합과 같은 유전적으로 조작된 상호작용을 통해 부착될 수 있다. 효소는 표면 또는 표면 코팅에 직접 부착되거나, 표면 또는 표면 코팅에 이미 존재하는 다른 단백질에 부착될 수 있다. 효소는 모두 하나의 담체, 개별 담체, 또는 둘의 조합(예를 들어, 담체당 2종의 효소라면, 이들 담체를 혼합한다)에 고정될 수 있다. 이러한 변동은 균일하게 또는 정의된 층에서 혼합되어 연속 반응기에서 회전율을 최적화할 수 있다. 예를 들어, 반응기의 시작부는 높은 초기 G1P 증가를 보장하기 위해 aGP 층을 가질 수 있다. 효소는 모두 하나의 담체, 개별 담체 또는 군에 고정될 수 있다. 이들 효소는 균일하게 또는 정의된 층 또는 구역에서 혼합되어 회전율을 최적화할 수 있다.

당업계에 공지된 임의의 적합한 생물학적 완충액, 예컨대 HEPES, PBS, BIS-TRIS, MOPS, DIPSO, 트리즈마(Trizma) 등이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 모든 실시형태를 위한 반응 완충액은 5.0 내지 9.0 범위의 pH 범위를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 반응 완충액 pH는 약 6.0 내지 약 7.3 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 완충액 pH는 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2 또는 7.3일 수 있다.

본 발명의 일부 개선된 방법에서, 반응 완충액은 2가 금속 양이온을 함유한다. 예로는 Mn²⁺, Co²⁺, Mg²⁺ 및 Zn²⁺ 등, 바람직하게는 Mg²⁺이 포함된다. 2가 금속 양이온의 농도는 약 0 mM 내지 약 150 mM, 약 0mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 50 mM 또는 보다 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 50 mM 범위일 수 있다. 예를 들어, 2가 금속 양이온 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM 또는 약 55 mM일 수 있다.

방법 단계가 수행되는 반응 온도는 37℃ 내지 85℃ 범위일 수 있다. 보다 바람직하게는, 단계는 약 37℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 온도는 예를 들어 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃ 또는 약 60℃일 수 있다. 바람직하게는, 반응 온도는 약 50℃이다. 본 발명의 일부 방법에서, 반응 온도는 일정하며 방법 동안 변하지 않는다.

개시된 방법의 반응 시간은 필요에 따라 조정될 수 있으며 약 1시간 내지 약 48시간의 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 시간은 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 26시간, 약 28시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36시간, 약 38시간, 약 40시간, 약 42시간, 약 44시간, 약 46시간 또는 약 48시간일 수 있다. 보다 바람직하게는, 반응 시간은 약 24시간이다.

반응은 충전층 반응기(packed bed reactor) 또는 유사한 장치를 사용하여 회분식 또는 연속 공정으로 실행될 수 있다. 연속 공정에서, 용액 말토덱스트린은 용액이 하류 공정을 위해 컬럼을 떠날 때 타가토스로의 전환이 완료될 수 있는 속도에서 고정된 효소 층을 통해 펌핑된다. 예를 들어, 말토덱스트린이 컬럼을 떠날 때 최대 타가토스 수율이 달성되도록 200 g/L의 말토덱스트린이 고정된 효소(예를 들어, 50℃에서 유지됨)로 충전된 컬럼을 통해 펌핑될 수 있다. 이러한 방법론은 회분식 방법에 비해 더 큰 용적 생산성을 제공한다. 이는 본 발명자들의 생성물이 컬럼 및 반응 조건과 접촉하는 시간을 제한하여 생성물 분해(예를 들어, 잠재적인 하이드록시메틸푸르푸랄 형성) 가능성을 감소시킨다. 회분 방식이든 연속 방식이든 본 발명의 방법의 다양한 단계는 다른 단계와 동일한 반응 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 단일 생물반응기 또는 반응 용기를 사용하는 본 발명의 특정 방법에서, pH 및 온도와 같은 반응 조건 및 반응 완충액은 방법의 모든 단계 동안 일정하게 유지된다.

이어서 T6P의 T6PP 탈인산화에 의해 생성된 포스페이트 이온은 특히, 모든 방법 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때 당류를 G1P로 전환시키는 방법 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 방법에서 포스페이트를 재활용하는 능력은 비-화학양론적 양의 포스페이트가 사용될 수 있도록 하여 반응 포스페이트 농도를 낮게 유지시킨다. 이는 전체 경로와 방법의 전체 속도에 영향을 주지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고 타가토스 제조 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.

예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0 mM 내지 약 300 mM, 약 0 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 50 mM 또는 보다 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 50 mM의 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM 또는 약 55 mM일 수 있다.

따라서, 낮은 포스페이트 농도는 낮은 총 포스페이트로 인해 생산 비용을 감소시키고 이에 따라 포스페이트 제거 비용을 저하시킨다. 이는 또한 고 농도의 유리 포스페이트에 의한 T6PP 억제를 방지하고 포스페이트 오염 가능성을 감소시킨다.

더욱이, 본원에 개시된 방법은 포스페이트 공급원으로서 ATP 첨가 없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 본 방법은 또한 NAD(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(H)-무함유로 수행될 수 있다. 다른 이점은 또한 개시된 타가토스 제조 방법의 적어도 하나의 단계가 에너지면에서 유리한 화학 반응을 수반한다는 사실을 포함한다. 도 6. 더 높은 활성을 갖는 효소의 사용은 전체 에너지론에 영향을 주지 않지만, 개선된 방법에서 더 적은 양의 효소를 사용하는 능력은 유리하다. 그 이점은 생성물의 총 생산 비용 중 전체 효소 비용이 절감된다는 것이다.

본 발명에 따른 방법은 전체 반응 동안의 매우 유리한 평형 상수로 인해 높은 수율을 달성할 수 있다. 이론적으로, 출발 재료가 중간체로 완전히 전환되면, 최대 99% 수율이 달성될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계는 공급원료에 관계 없이 비가역적인 포스파타제 반응이다. 따라서, 타가토스는 매우 높은 수율로 생산된다.

본 발명의 방법은 저가의 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 관련된 비용을 감소시킴으로써 생산 비용을 절감시킨다. 전분, 셀룰로스, 수크로스 및 이들의 유도체는 예를 들어 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 타가토스가 락토스로부터 생산될 때, 글루코스와 갈락토스 및 타가토스는 크로마토그래피를 통해 분리되고 이는 더 높은 생산 비용을 초래한다.

본 발명에 따른 방법은 타가토스의 용이한 회수를 가능하게 하고 분리 비용을 최소화한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 타가토스의 회수는 크로마토그래피 분리를 통한 것이 아니다. 연속 반응으로 타가토스가 생산된 후, 생성물은 대신에 미세여과, 이온 교환(양이온 후에 음이온, 혼합층이 아님), 농축, 결정화, 결정 분리 및 건조를 거친다. 타가토스의 높은 수율로 인해, 결정화 단계는 모두 타가토스를 정제하는 데 필요한 것이다. 결정화 전에 타가토스를 추가 정제하기 위해, 나노여과를 사용하여, 결정화 과정에서 효소가 존재할 위험을 제거하고 타가토스와 공결정화할 수 있거나 모액의 재활용성을 제한할 수 있는 미전환된 덱스트린(말토덱스트린, 말토테트라오스, 말토트리오스, 말토스 등)을 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 개선된 타가토스 제조 방법은 하기의 단계: (i) 하나 이상의 효소를 사용하여 당류를 글루코스 1-포스페이트(G1P)로 전환시키는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제(PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제(PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계 및 (v) 타가토스 6-포스페이트 포스파타제(T6PP)를 통해 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 F6PE는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 상기 T6PP는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 방법은 바람직하게는 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 개선된 타가토스 제조 방법은 하기의 단계: (i) αGP를 사용하여 당류를 글루코스 1-포스페이트(G1P)로 전환시키고 상기 당류가 전분, 전분의 하나 이상의 유도체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; (ii) 포스포글루코뮤타제(PGM, EC 5.4.2.2)를 사용하여 G1P를 G6P로 전환시키는 단계; (iii) 포스포글루코이소머라제(PGI, EC 5.3.1.9)를 사용하여 G6P를 F6P로 전환시키는 단계; (iv) 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 통해 F6P를 T6P로 전환시키는 단계 및 (v) 타가토스 6-포스페이트 포스파타제(T6PP)를 통해 T6P를 타가토스로 전환시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 F6PE는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 상기 T6PP는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 방법은 바람직하게는 단일 반응 용기에서 수행되고 상기 논의된 각종 방법 조건 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

실시예

재료 및 방법

글루코스 1-포스페이트, 염화마그네슘, 인산나트륨(일염기성 및 이염기성)을 포함하는 모든 화학물질은 달리 언급되지 않는 한, 시약 등급 이상이며 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트루이스) 또는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(미국 펜실베니아주 피츠버그)로부터 구매하였다. 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3)(시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스)를 재조합 단백질 발현을 위한 숙주 세포로서 사용하였다. 50 mg L-1 카나마이신을 포함하는 ZYM-5052 배지를 이. 콜라이 세포 성장 및 재조합 단백질 발현에 사용하였다.

재조합 효소의 생산 및 정제

단백질 발현 플라스미드(pET28a)를 보유하는 이. 콜라이 BL21 (DE3) 균주를 L^-1 카나마이신 50mg을 함유하는 ZYM-5052 배지 100 mL를 갖는 1-L 에를렌마이어 플라스크에서 항온배양하였다. 세포를 16 내지 24시간 동안 220 rpm에서 회전 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. 세포를 12℃에서 원심분리하여 수거하고 50 mM NaCl 및 5 mM MgCl₂(열 침전)를 함유하는 20 mM HEPES(pH 7.5) 또는 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸(Ni 정제)을 함유하는 20 mM HEPES(pH 7.5)로 1회 세척하였다. 세포 펠릿을 동일한 완충액에 재현탁하고 초음파 처리에 의해 용해시켰다. 원심분리 후, 상청액 중의 표적 단백질을 정제하였다. His-태그 부착된 단백질을 프로피니티(Profinity) IMAC Ni-충전된 수지(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)에 의해 정제하였다. 50 내지 80℃에서 5 내지 30분 동안의 열 침전을 사용하여 열안정성 효소를 정제하였다. 재조합 단백질의 순도는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 조사하였다.

실시예 1: 더 높은 활성을 갖는 F6PE

50℃에서 1시간 동안 5 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 38.5 mM G1P, 0.05 g/L PGM, 0.05 g/L PGI, 0.05 g/L F6PE 및 메타노사르시나 서모필라 CHTI-55 유래의 0.075 g/L T6PP(Uniprot ID A0A0E3NCH4)를 함유하는 50 mM HEPES 완충액(pH 7.2)에서 상이한 F6PE의 상대적 활성을 측정하였다. 비바스핀 2(Vivaspin 2) 농축기(10,000 MWCO)로 효소를 여과하여 반응을 중단시켰다. 생성물 타가토스를 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하여 평가하였다. 샘플을 65℃에서 15분 동안 0.6 mL/분으로 5mM H₂SO₄ 중에서 흐르게 하였다. 표 1은 본 발명의 개선된 방법에 사용된 F6PE가 이전에 공개된 딕티오글로무스 서모필룸 유래의 F6PE(Uniprot ID B5YBD7)에 비해 더 높은 활성을 가짐을 보여준다. 국제 특허출원공개 WO2017/059278 참조.

F6PE의 상대적 활성

F6PE(Uniprot ID)	상대적 활성(%)
B5YBD7 (비교용)	100
A0A0P6XN50 (서열번호 1)	250
A0A223HVJ3(서열번호 2)	278
A0A2M8QBR9(서열번호 7)	220

실시예 2: 더 높은 활성을 갖는 T6PP

T6PP의 상대적 활성을 50℃에서 1시간 동안 5 mM MgCl₂, 0.5mM MnCl₂, 38.5 mM G1P, 0.05 g/L PGM, 0.05 g/L PGI, 서마나에로트릭스 닥센시스 유래의 0.25 g/L F6PE(Uniprot ID A0A0P6XN50) 및 0.05 g/L T6PP를 함유하는 50 mM HEPES 완충액(pH 7.2)에서 측정하였다. 비바스핀 2 농축기(10,000 MWCO)로 효소를 여과하여 반응을 중단시켰다. 생성물 타가토스를 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하여 평가하였다. 샘플을 65℃에서 15분 동안 0.6 mL/분으로 5 mM H₂SO₄ 중에서 흐르게 하였다. 표 2는 본 발명의 개선된 방법에 사용된 T6PP가 이전에 개시된 아르카에오글로부스 풀지두스 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)에 비해 더 높은 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 국제 특허출원공개 WO 2017/059278 참조.

T6PP의 상대적 활성

T6PP Uniprot ID	상대적 활성(%)
O29805 (비교용)	100
A0A0E3NCH4 (서열번호 3)	714
D6YBK5(서열번호 4)	1428
E0RT70(서열번호 5)	2175
D1C7G9(서열번호 6)	914

실시예 3: F6P로부터 개선된 타가토스 생산

이전에 개시된 효소인 F6PE(Uniprot ID B5YBD7) 및 T6PP(Uniprot ID O29805)를 사용한 F6P의 타가토스로의 전환을 본 발명의 개선된 방법에서 유용한 효소인 F6PE(Uniprot ID A0A0P6XN50) 및 T6PP(Uniprot ID D6YBK5)를 사용한 F6P의 타가토스로의 전환과 비교하였다. 38.5 mM F6P, 50 mM HEPES pH 7.2, 5 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 0.1 g/L F6PE 및 0.033 g/L T6PP를 함유하는 0.20 mL 반응 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 항온배양하였다.

비바스핀 2 농축기(10,000 MWCO)로 효소를 여과하여 반응을 중단시키고 Agilent Hi-Plex H-column 및 굴절률 검출기를 사용하여 HPLC(Agilent 1100 시리즈)를 통해 분석하였다. 샘플을 65℃에서 15.5분 동안 0.6 mL/분으로 5 mM H₂SO₄ 중에서 흐르게 하였다. 결과는 개선된 방법의 효소에 의한 타가토스 생산이 이전에 개시된 효소에 비해 4.4배 개선되었음을 보여준다(도 7). 개선된 방법의 효소와의 반응에 약간의 프럭토스(도 7 참조, 숄더, 5, 피크 4에서)가 존재한다. 이것은 처음에 본 실시예의 반응 동안 T6P에 비해 F6P가 다량인 점에서 보면 T6PP로 인한 아티팩트(artifact)일 수 있으며 전체 경로에서 문제가 되지 않는다.

서열목록

알파-글루칸 포스포릴라제

서모토가 마리티마(Uniprot ID G4FEH8) - 서열번호 8

포스포글루코뮤타제

서모코쿠스 코다카라엔시스 (Uniprot ID Q68BJ6) - 서열번호 9

프럭토스 6-포스페이트 4-에피머라제

(비교용) 딕티오글로무스 서모필룸 (Uniprot ID B5YBD7) - 서열번호 10

서마나에로트릭스 닥센시스 (Uniprot ID A0A0P6XN50) - 서열번호 1

서모아나에로박테리움 서모사카롤리티큠 (Uniprot ID A0A223HVJ3) - 서열번호 2

캔디다투스 서모폰시아 클라데 3 박테리움 (Uniprot ID A0A2M8QBR9) - 서열번호 7

타가토스 6-포스페이트 포스파타제

(비교용) 아르카에오글로부스 푸지디스(Archaeoglobus fugidis) (Uniprot ID O29805) - 서열번호 11

메타노사르시나 서모필라 CHTI-55 (Uniprot ID A0A0E3NCH4) - 서열번호 3

서모비스포라 비스포라 균주 ATCC 19993 (Uniprot ID D6YBK5) - 서열번호 4

스피로카에타 서모필라 ATCC 49972 (Uniprot ID E0RT70) - 서열번호 5

스파에로박터 서모필루스 DSM 20745 (Uniprot ID D1C7G9) - 서열번호 6

4-글루칸 트랜스퍼라제

서모코쿠스 리토랄리스 (Uniprot ID O32462) - 서열번호 12

SEQUENCE LISTING <110> Bonumose, LLC <120> Enzymatic Production of Tagatose <130> 146.0009-WO00 <150> US 62/747877 <151> 2018-10-19 <150> US 62/790,788 <151> 2019-01-10 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 426 <212> PRT <213> Thermanaerothrix daxensis <400> 1 Met Val Thr Tyr Leu Asp Phe Val Val Leu Ser His Arg Phe Arg Arg 1 5 10 15 Pro Leu Gly Ile Thr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Tyr Val Ile Glu 20 25 30 Ala Ala Leu Arg Asn Gly Met Met Thr His Thr Pro Val Leu Ile Glu 35 40 45 Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr 50 55 60 Pro Ala Asp Phe Val Arg Tyr Val Glu Asn Ile Ala Ala Arg Val Gly 65 70 75 80 Ser Pro Arg Glu Asn Leu Leu Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu 85 90 95 Val Trp Ala His Glu Pro Ala Glu Ser Ala Met Glu Lys Ala Arg Ala 100 105 110 Leu Val Lys Ala Tyr Val Glu Ala Gly Phe Arg Lys Ile His Leu Asp 115 120 125 Cys Ser Met Pro Cys Ala Asp Asp Arg Asp Phe Ser Pro Lys Val Ile 130 135 140 Ala Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Gln Val Ala Glu Ser Thr Cys Asp 145 150 155 160 Val Met Gly Leu Pro Leu Pro Asn Tyr Val Ile Gly Thr Glu Val Pro 165 170 175 Pro Ala Gly Gly Ala Lys Ala Glu Ala Glu Thr Leu Arg Val Thr Arg 180 185 190 Pro Glu Asp Ala Ala Glu Thr Ile Ala Leu Thr Arg Ala Ala Phe Phe 195 200 205 Lys Arg Gly Leu Glu Ser Ala Trp Glu Arg Val Val Ala Leu Val Val 210 215 220 Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asp His Gln Ile His Val Tyr Arg Arg 225 230 235 240 Glu Glu Ala Gln Ala Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ser Gln Pro Gly Leu 245 250 255 Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Arg Asp Ala Leu Arg 260 265 270 Ala Leu Val Glu Asp His Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu 275 280 285 Thr Phe Ala Phe Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Ser Ile Glu Asp 290 295 300 Trp Val Cys Asp Ser Pro Ser Arg Ile Leu Glu Val Leu Glu Thr Thr 305 310 315 320 Met Leu Ala Asn Pro Val Tyr Trp Gln Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Glu 325 330 335 Arg Ala Arg Arg Ile Ala Arg Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ile Arg 340 345 350 Tyr Tyr Trp Ser Ala Pro Ala Val Glu Gln Ala Phe Glu Arg Leu Arg 355 360 365 Ala Asn Leu Asn Arg Val Ser Ile Pro Leu Val Leu Leu Ser Gln Tyr 370 375 380 Leu Pro Asp Gln Tyr Arg Lys Val Arg Asp Gly Arg Leu Pro Asn Gln 385 390 395 400 Phe Asp Ala Leu Ile Leu Asp Lys Ile Gln Ala Val Leu Glu Asp Tyr 405 410 415 Asn Val Ala Cys Gly Val Arg Ile Gly Glu 420 425 <210> 2 <211> 434 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum <400> 2 Met Ala Lys Glu His Pro Leu Lys Glu Leu Val Asn Lys Gln Lys Ser 1 5 10 15 Gly Ile Ser Glu Gly Ile Val Ser Ile Cys Ser Ser Asn Glu Phe Val 20 25 30 Ile Glu Ala Ser Met Glu Arg Ala Leu Thr Asn Gly Asp Tyr Val Leu 35 40 45 Ile Glu Ser Thr Ala Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Ile Gly 50 55 60 Met Thr Pro Ile Glu Phe Lys Lys Phe Val Phe Ser Ile Ala Lys Lys 65 70 75 80 Val Asp Phe Pro Leu Asp Lys Leu Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly 85 90 95 Pro Leu Ile Trp Lys Asn Glu Ser Ser Asn Leu Ala Leu Ala Lys Ala 100 105 110 Ser Glu Leu Ile Lys Glu Tyr Val Leu Ala Gly Tyr Thr Lys Ile His 115 120 125 Ile Asp Thr Ser Met Arg Leu Lys Asp Asp Thr Asp Phe Asn Thr Glu 130 135 140 Ile Ile Ala Gln Arg Ser Ala Val Leu Leu Lys Ala Ala Glu Asn Ala 145 150 155 160 Tyr Met Glu Leu Asn Lys Asn Asn Lys Asn Val Leu His Pro Val Tyr 165 170 175 Val Ile Gly Ser Glu Val Pro Ile Pro Gly Gly Ser Gln Gly Ser Asp 180 185 190 Glu Ser Leu Gln Ile Thr Asp Ala Lys Asp Phe Glu Asn Thr Val Glu 195 200 205 Ile Phe Lys Asp Val Phe Ser Lys Tyr Gly Leu Ile Asn Glu Trp Glu 210 215 220 Asn Ile Val Ala Phe Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asn Asp 225 230 235 240 Phe Val His Glu Tyr Lys Arg Asp Glu Ala Lys Glu Leu Thr Asp Ala 245 250 255 Leu Lys Asn Tyr Lys Thr Phe Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Thr Arg Glu Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Asp Gly Ile Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ile 290 295 300 Ala Leu Asn Asn Ile Glu Asn Glu Leu Leu Asn Asn Val Asp Ser Ile 305 310 315 320 Lys Leu Ser Asn Phe Thr Asn Val Leu Val Ser Glu Met Ile Asn Asn 325 330 335 Pro Glu His Trp Lys Asn His Tyr Phe Gly Asp Asp Ala Arg Lys Lys 340 345 350 Phe Leu Cys Lys Tyr Ser Tyr Ser Asp Arg Cys Arg Tyr Tyr Leu Pro 355 360 365 Thr Arg Asn Val Lys Asn Ser Leu Asn Leu Leu Ile Arg Asn Leu Glu 370 375 380 Asn Val Lys Ile Pro Met Thr Leu Ile Ser Gln Phe Met Pro Leu Gln 385 390 395 400 Tyr Asp Asn Ile Arg Arg Gly Leu Ile Lys Asn Glu Pro Ile Ser Leu 405 410 415 Ile Lys Asn Ala Ile Met Asn Arg Leu Asn Asp Tyr Tyr Tyr Ala Ile 420 425 430 Lys Pro <210> 3 <211> 220 <212> PRT <213> Methanosarcina thermophila CHTI-55 <400> 3 Met Leu Lys Ala Leu Ile Phe Asp Met Asp Gly Val Leu Val Asp Ser 1 5 10 15 Met Pro Phe His Ala Ala Ala Trp Lys Lys Ala Phe Phe Glu Met Gly 20 25 30 Met Glu Ile Gln Asp Ser Asp Ile Phe Ala Ile Glu Gly Ser Asn Pro 35 40 45 Arg Asn Gly Leu Pro Leu Leu Ile Arg Lys Ala Arg Lys Glu Pro Glu 50 55 60 Ala Phe Asp Phe Glu Ala Ile Thr Ser Ile Tyr Arg Gln Glu Phe Lys 65 70 75 80 Arg Val Phe Glu Pro Lys Ala Phe Glu Gly Met Lys Glu Cys Leu Glu 85 90 95 Val Leu Lys Lys Arg Phe Leu Leu Ser Val Val Ser Gly Ser Asp His 100 105 110 Val Ile Val His Ser Ile Ile Asn Arg Leu Phe Pro Gly Ile Phe Asp 115 120 125 Ile Val Val Thr Gly Asp Asp Ile Ile Asn Ser Lys Pro His Pro Asp 130 135 140 Pro Phe Leu Lys Ala Val Glu Leu Leu Asn Val Arg Arg Glu Glu Cys 145 150 155 160 Val Val Ile Glu Asn Ala Ile Leu Gly Val Glu Ala Ala Lys Asn Ala 165 170 175 Arg Ile Tyr Cys Ile Gly Val Pro Thr Tyr Val Glu Pro Ser His Leu 180 185 190 Asp Lys Ala Asp Leu Val Val Glu Asp His Arg Gln Leu Met Gln His 195 200 205 Leu Leu Ser Leu Glu Pro Ala Asn Gly Phe Arg Gln 210 215 220 <210> 4 <211> 213 <212> PRT <213> Thermobispora bispora strain ATCC 19993 <400> 4 Met Asp Val Val Leu Phe Asp Met Asp Gly Leu Leu Val Asp Thr Glu 1 5 10 15 Arg Leu Trp Phe Ala Val Glu Thr Glu Val Val Glu Arg Leu Gly Gly 20 25 30 Ser Trp Gly Pro Glu His Gln Arg Gln Leu Val Gly Gly Ser Leu Lys 35 40 45 Arg Ala Val Ala Tyr Met Leu Glu His Thr Gly Ala Asp Val Asp Pro 50 55 60 Asp Val Val Ala Gly Trp Leu Ile Glu Gly Met Glu Arg Arg Leu Thr 65 70 75 80 Glu Ser Val Asp Pro Met Pro Gly Ala Met Glu Leu Leu Thr Ala Leu 85 90 95 Arg Asp Glu Gly Ile Pro Thr Gly Leu Val Thr Ser Ser Arg Arg Pro 100 105 110 Leu Ala Asp Ala Val Leu Lys His Ile Gly Arg Glu His Phe Asp Val 115 120 125 Val Val Thr Ala Asp Asp Val Ser His Ala Lys Pro His Pro Glu Pro 130 135 140 Tyr Leu Thr Ala Leu Ala Met Leu Ser Ala Asp Pro Ala Arg Ser Val 145 150 155 160 Ala Leu Glu Asp Ser Pro Asn Gly Val Ala Ser Ala Val Ala Ala Gly 165 170 175 Cys Arg Val Val Ala Val Pro Ser Leu Leu Pro Ile Pro Glu Gln Pro 180 185 190 Gly Val Thr Val Leu Pro Ala Leu Thr His Ala Asp Val Gly Leu Leu 195 200 205 Arg Ser Leu Val Gly 210 <210> 5 <211> 237 <212> PRT <213> Spirochaeta thermophila ATCC 49972 <400> 5 Met Arg Lys Arg Arg Glu Cys Ala Pro Pro Gly Ile Arg Ala Ala Ile 1 5 10 15 Phe Asp Met Asp Gly Thr Leu Val Asn Ser Glu Asp Val Tyr Trp Asp 20 25 30 Ala Asp Cys Ala Phe Leu Asp Arg Tyr Gly Ile Pro His Asp Asp Ala 35 40 45 Leu Arg Glu Tyr Met Ile Gly Arg Gly Thr Lys Gly Phe Ile Glu Trp 50 55 60 Met Arg Thr Gln Lys Glu Ile Pro Arg Ser Asp Glu Glu Leu Ala Arg 65 70 75 80 Glu Lys Met Glu Val Phe Leu Ala His Ala Arg Gly Arg Val Gln Val 85 90 95 Phe Pro Glu Met Arg Arg Leu Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Gly Met 100 105 110 Pro Cys Ala Leu Ala Ser Gly Ser Pro Arg Gly Ile Ile Glu Val Leu 115 120 125 Leu Glu Glu Thr Gly Leu Ala Gly Phe Phe Arg Val Val Val Ser Ala 130 135 140 Asp Glu Val Ala Arg Pro Lys Pro Ala Pro Asp Val Phe Leu Glu Ala 145 150 155 160 Ala Gly Arg Leu Gly Val Glu Pro Gly Gly Cys Val Val Phe Glu Asp 165 170 175 Ser Glu Pro Gly Val Arg Ala Gly Leu Asp Ala Gly Met Val Cys Val 180 185 190 Ala Ile Pro Thr Leu Val Lys Asp Arg Tyr Pro Glu Val Phe Tyr Gln 195 200 205 Ala Asp Val Leu Phe Glu Gly Gly Met Gly Glu Phe Ser Ala Glu Arg 210 215 220 Val Trp Glu Trp Leu Gly Cys Gly Val Gly Val Gly Arg 225 230 235 <210> 6 <211> 219 <212> PRT <213> Sphaerobacter thermophilus 20745 <400> 6 Met Ser Gln Gly Val Arg Gly Val Val Phe Asp Leu Asp Gly Leu Leu 1 5 10 15 Val Glu Ser Glu Glu Tyr Trp Glu Gln Ala Arg Arg Glu Phe Val Ser 20 25 30 Arg Tyr Gly Gly Thr Trp Gly Asp Asp Ala Gln Gln Ala Val Met Gly 35 40 45 Ala Asn Thr Arg Gln Trp Ser Arg Tyr Ile Arg Glu Ala Phe Asp Ile 50 55 60 Pro Leu Thr Glu Glu Glu Ile Ala Ala Ala Val Ile Ala Arg Met Gln 65 70 75 80 Glu Leu Tyr His Asp His Leu Pro Leu Leu Pro Gly Ala Ile Pro Ala 85 90 95 Val Arg Ala Leu Ala Asp Arg Tyr Pro Leu Ala Val Ala Ser Ser Ser 100 105 110 Pro Pro Val Leu Ile Arg Phe Val Leu Ala Glu Met Gly Val Ala Glu 115 120 125 Cys Phe Gln Ser Val Thr Ser Ser Asp Glu Val Ala His Gly Lys Pro 130 135 140 Ala Pro Asp Val Tyr His Leu Ala Cys Glu Arg Leu Gly Val Ala Pro 145 150 155 160 Glu Gln Ala Val Ala Phe Glu Asp Ser Thr Ala Gly Ile Ala Ala Ala 165 170 175 Leu Ala Ala Gly Leu Arg Val Ile Ala Val Pro Asn Arg Ser Tyr Pro 180 185 190 Pro Asp Pro Asp Val Leu Arg Arg Ala Asp Leu Thr Leu Pro Ser Leu 195 200 205 Glu Glu Phe Asp Pro Ala Val Leu Glu Gln Trp 210 215 <210> 7 <211> 424 <212> PRT <213> Candidatus Thermofonsia Clade 3 bacterium <400> 7 Met Thr Tyr Leu Asp Tyr Leu Thr Ala Ser His His Ser Gly Lys Pro 1 5 10 15 Ile Gly Leu Ser Ser Ile Cys Ser Ala His Pro Trp Val Leu Arg Thr 20 25 30 Ala Leu Gln Gly Glu Arg Pro Val Leu Ile Glu Ser Thr Cys Asn Gln 35 40 45 Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Ser Gly Met Lys Pro Ala Asp Phe Val 50 55 60 Arg Phe Val His Ser Leu Ala Ala Glu Asn Gly Phe Pro Thr Glu Lys 65 70 75 80 Ile Leu Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Ser Pro Trp Gln Asn Glu 85 90 95 Pro Ala Glu Gln Ala Met Ala Lys Ala Ile Glu Met Val Arg Ala Tyr 100 105 110 Val Gln Ala Gly Tyr Thr Lys Ile His Leu Asp Cys Ser Met Pro Leu 115 120 125 Gly Gly Glu Arg Gln Leu Pro Val Glu Val Ile Ala Gln Arg Thr Val 130 135 140 Gln Leu Ala Glu Ala Ala Glu Gln Ala Ala His Glu Ser Arg Leu Thr 145 150 155 160 Ser His Thr Leu Arg Tyr Val Ile Gly Ser Glu Val Pro Pro Pro Gly 165 170 175 Gly Ala Ile Gly Pro His Glu Gly Leu Arg Val Thr Pro Val Glu Glu 180 185 190 Ala Arg Gln Thr Leu Glu Val Met Gln Ala Ala Phe His Gln Ala Gly 195 200 205 Leu Glu Ala Ala Trp Glu Arg Val Arg Ala Leu Val Val Gln Pro Gly 210 215 220 Val Glu Phe Gly Asp Asp Phe Val His Asp Tyr Asp Pro Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ala Gly Leu Ala Arg Phe Ile Glu Thr Val Pro Asn Leu Val Tyr Glu 245 250 255 Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Pro Glu Ser Leu Ala Ala Leu Val 260 265 270 Arg Asp His Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala 275 280 285 Leu Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Met Ile Glu Asn Glu Leu Phe 290 295 300 Pro Ala Glu Glu Arg Ser His Leu Val Glu Arg Leu Glu Ala Ala Met 305 310 315 320 Leu Arg Gln Pro Gly His Trp Gln Arg His Tyr His Gly Glu Glu Arg 325 330 335 Gln Gln Ala Leu Ala Arg Lys Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ile Arg Tyr 340 345 350 Tyr Trp Gly Asp Pro Asp Val Gln Ala Ala Phe Arg Gln Leu Leu Ala 355 360 365 Asn Leu Glu Arg Val Ala Pro Leu Pro Leu Thr Leu Leu Ser Gln Tyr 370 375 380 Leu Pro Glu Met Phe Gly Glu Ile Arg Arg Gly Leu Leu Leu Asn His 385 390 395 400 Pro Ala Ala Phe Leu Glu Arg Lys Ile Gln Ala Val Leu Asp Thr Tyr 405 410 415 Arg Ala Ala Cys Gly Glu Glu Asp 420 <210> 8 <211> 822 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 8 Met Leu Glu Lys Leu Pro Glu Asn Leu Lys Glu Leu Glu Ser Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Leu Trp Trp Ser Trp Ser Arg Pro Ala Gln Arg Leu Trp Arg 20 25 30 Met Ile Asp Ser Glu Lys Trp Glu Glu His Arg Asn Pro Val Lys Ile 35 40 45 Leu Arg Glu Val Ser Lys Glu Arg Leu Glu Glu Leu Ser Lys Asp Glu 50 55 60 Asp Phe Ile Ala Leu Tyr Glu Leu Thr Leu Glu Arg Phe Thr Asp Tyr 65 70 75 80 Met Glu Arg Glu Asp Thr Trp Phe Asn Val Asn Tyr Pro Glu Trp Asp 85 90 95 Glu Lys Ile Val Tyr Met Cys Met Glu Tyr Gly Leu Thr Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys 115 120 125 Ser Ala Ser Asp Leu Gly Leu Pro Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Tyr 130 135 140 Lys His Gly Tyr Phe Thr Gln Gln Ile Asp Ser Asp Gly Arg Gln Ile 145 150 155 160 Glu Ile Phe Pro Glu Tyr Asp Ile Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Leu 165 170 175 Arg Asp Glu Asp Gly Asn Gln Val Ile Val Glu Val Pro Ile Asp Asn 180 185 190 Asp Thr Val Lys Ala Arg Val Phe Glu Val Gln Val Gly Arg Val Lys 195 200 205 Leu Tyr Leu Leu Asp Thr Asp Phe Glu Glu Asn Glu Asp Arg Phe Arg 210 215 220 Lys Ile Cys Asp Tyr Leu Tyr Asn Pro Glu Pro Asp Val Arg Val Ser 225 230 235 240 Gln Glu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Gly Met Lys Leu Leu Lys Thr Leu 245 250 255 Lys Ile Lys Pro Gly Val Ile His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe 260 265 270 Ser Ser Leu Glu Arg Ile Lys Ser Tyr Met Glu Glu Gly Tyr Ser Phe 275 280 285 Thr Glu Ala Leu Glu Ile Val Arg Gln Thr Thr Val Phe Thr Thr His 290 295 300 Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp Arg Phe Pro Phe Asp Phe Val Glu 305 310 315 320 Lys Lys Leu Thr Lys Phe Phe Glu Gly Phe Glu Ser Lys Glu Leu Leu 325 330 335 Met Asn Leu Gly Lys Asp Glu Asp Gly Asn Phe Asn Met Thr Tyr Leu 340 345 350 Ala Leu Arg Thr Ser Ser Phe Ile Asn Gly Val Ser Lys Leu His Ala 355 360 365 Asp Val Ser Arg Arg Met Phe Lys Asn Val Trp Lys Gly Val Pro Val 370 375 380 Glu Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile Thr Asn Gly Val His Met Gly Thr 385 390 395 400 Trp Ile Asn Arg Glu Met Arg Lys Leu Phe Asp Arg Tyr Leu Gly Arg 405 410 415 Val Trp Arg Glu His Thr Asp Leu Glu Gly Ile Trp Tyr Gly Val Asp 420 425 430 Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp Glu Ala His Leu Asn Ala Lys Lys 435 440 445 Arg Phe Ile Asp Tyr Ile Arg Glu Ser Ile Lys Arg Arg Asn Glu Arg 450 455 460 Leu Gly Ile Asn Glu Pro Leu Pro Glu Ile Ser Glu Asn Val Leu Ile 465 470 475 480 Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr Tyr Lys Arg Ala Val Leu Leu 485 490 495 Phe Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Arg Ile Val Asn Asn Ser Glu Arg 500 505 510 Pro Val Tyr Ile Val Tyr Ala Gly Lys Ala His Pro Arg Asp Glu Gly 515 520 525 Gly Lys Glu Phe Leu Arg Arg Ile Tyr Glu Val Ser Gln Met Pro Asp 530 535 540 Phe Lys Asn Lys Ile Ile Val Leu Glu Asn Tyr Asp Ile Gly Met Ala 545 550 555 560 Arg Leu Met Val Ser Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg 565 570 575 Pro Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ala Ala Asn Gly 580 585 590 Val Leu Asn Ala Ser Val Tyr Asp Gly Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn 595 600 605 Gly Arg Asn Gly Trp Val Ile Gly Asp Glu Ser Val Leu Pro Glu Thr 610 615 620 Glu Ala Asp Asp Pro Lys Asp Ala Glu Ala Leu Tyr Glu Leu Leu Glu 625 630 635 640 Asn Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr Glu Asn Arg Glu Lys Trp Ile Phe 645 650 655 Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser Val Ala Pro Lys Phe Ser Thr Thr 660 665 670 Arg Met Leu Lys Glu Tyr Thr Glu Lys Phe Tyr Ile Lys Gly Leu Val 675 680 685 Asn Arg Glu Trp Leu Glu Arg Arg Glu Asn Val Glu Lys Ile Gly Ala 690 695 700 Trp Lys Glu Arg Ile Leu Lys Asn Trp Glu Asn Val Ser Ile Glu Arg 705 710 715 720 Ile Val Leu Glu Asp Ser Lys Ser Val Glu Val Thr Val Lys Leu Gly 725 730 735 Asp Leu Thr Pro Asn Asp Val Ile Val Glu Leu Val Ala Gly Arg Gly 740 745 750 Glu Gly Met Glu Asp Leu Glu Val Trp Lys Val Ile His Ile Arg Arg 755 760 765 Tyr Arg Lys Glu Asn Asp Leu Phe Val Tyr Thr Tyr Thr Asn Gly Val 770 775 780 Leu Gly His Leu Gly Ser Pro Gly Trp Phe Tyr Ala Val Arg Val Ile 785 790 795 800 Pro Tyr His Pro Arg Leu Pro Ile Lys Phe Leu Pro Glu Val Pro Val 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180 185 190 Leu Leu Arg Glu Leu Gly Cys Lys Val Val Ser Val Asn Ala His Pro 195 200 205 Asp Gly His Phe Pro Ala Arg Asn Pro Glu Pro Asn Glu Glu Asn Leu 210 215 220 Lys Gly Phe Met Glu Ile Val Lys Ala Leu Gly Ala Asp Phe Gly Val 225 230 235 240 Ala Gln Asp Gly Asp Ala Asp Arg Ala Val Phe Ile Asp Glu Asn Gly 245 250 255 Arg Phe Ile Gln Gly Asp Lys Thr Phe Ala Leu Val Ala Asp Ala Val 260 265 270 Leu Arg Glu Asn Gly Gly Gly Leu Leu Val Thr Thr Ile Ala Thr Ser 275 280 285 Asn Leu Leu Asp Asp Ile Ala Lys Arg Asn Gly Ala Lys Val Met Arg 290 295 300 Thr Lys Val Gly Asp Leu Ile Val Ala Arg Ala Leu Leu Glu Asn Asn 305 310 315 320 Gly Thr Ile Gly Gly Glu Glu Asn Gly Gly Val Ile Phe Pro Asp Phe 325 330 335 Val Leu Gly Arg Asp Gly Ala Met Thr Thr Ala Lys Ile Val Glu Ile 340 345 350 Phe Ala Lys Ser Gly Lys Lys Phe Ser Glu Leu Ile Asp Glu Leu Pro 355 360 365 Lys Tyr Tyr Gln Phe Lys Thr Lys Arg His Val Glu Gly Asp Arg Lys 370 375 380 Ala Ile Val Ala Lys Val Ala Glu Leu Ala Glu Lys Lys Gly Tyr Lys 385 390 395 400 Ile Asp Thr Thr Asp Gly Thr Lys Ile Ile Phe Asp Asp Gly Trp Val 405 410 415 Leu Val Arg Ala Ser Gly Thr Glu Pro Ile Ile Arg Ile Phe Ser Glu 420 425 430 Ala Lys Ser Glu Glu Lys Ala Arg Glu Tyr Leu Glu Leu Gly Ile Lys 435 440 445 Leu Leu Glu Glu Ala Leu Lys Gly 450 455 <210> 10 <211> 408 <212> PRT <213> Dictyoglomus thermophilum <400> 10 Met Trp Leu Ser Lys Asp Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Val Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Cys Ser Ser Asn Pro Tyr Val Ile Glu Ala Ser Val Glu Phe Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Asn Asp Tyr Ile Leu Ile Glu Ala Thr Pro His Gln Ile Asn 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Tyr Ser Gly Met Thr Pro Glu Asp Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Val Met Gly Ile Ile Lys Glu Lys Gly Ile Glu Glu Asp Arg Val Ile 65 70 75 80 Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu Pro Trp Gln Asp Glu Pro Ser 85 90 95 Ser Ser Ala Met Lys Lys Ala Lys Asp Leu Ile Arg Ala Phe Val Glu 100 105 110 Ser Gly Tyr Lys Lys Ile His Leu Asp Cys Ser Met Ser Leu Ser Asp 115 120 125 Asp Pro Val Val Leu Ser Pro Glu Lys Ile Ala Glu Arg Glu Arg Glu 130 135 140 Leu Leu Glu Val Ala Glu Glu Thr Ala Arg Lys Tyr Asn Phe Gln Pro 145 150 155 160 Val Tyr Val Val Gly Thr Asp Val Pro Val Ala Gly Gly Gly Glu Glu 165 170 175 Glu Gly Ile Thr Ser Val Glu Asp Phe Arg Val Ala Ile Ser Ser Leu 180 185 190 Lys Lys Tyr Phe Glu Asp Val Pro Arg Ile Trp Asp Arg Ile Ile Gly 195 200 205 Phe Val Ile Met Leu Gly Ile Gly Phe Asn Tyr Glu Lys Val Phe Glu 210 215 220 Tyr Asp Arg Ile Lys Val Arg Lys Ile Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu 225 230 235 240 Asn Leu Phe Val Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Lys Arg Ala 245 250 255 Leu Arg Asp Met Val Glu Asp Gly Val Arg Ile Leu Lys Val Gly Pro 260 265 270 Ala Leu Thr Ala Ser Phe Arg Arg Gly Val Phe Leu Leu Ser Ser Ile 275 280 285 Glu Asp Glu Leu Ile Ser Glu Asp Lys Arg Ser Asn Ile Lys Lys Val 290 295 300 Val Leu Glu Thr Met Leu Lys Asp Asp Lys Tyr Trp Arg Lys Tyr Tyr 305 310 315 320 Lys Asp Ser Glu Arg Leu Glu Leu Asp Ile Trp Tyr Asn Leu Leu Asp 325 330 335 Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp Glu Tyr Lys Glu Ile Lys Ile Ala Leu Asn 340 345 350 Arg Leu Phe Glu Asn Phe Ser Glu Gly Val Asp Ile Arg Tyr Ile Tyr 355 360 365 Gln Tyr Phe Tyr Asp Ser Tyr Phe Lys Val Arg Glu Gly Lys Ile Arg 370 375 380 Asn Asp Pro Arg Glu Leu Ile Lys Asn Glu Ile Lys Lys Val Leu Glu 385 390 395 400 Asp Tyr His Tyr Ala Val Asn Leu 405 <210> 11 <211> 223 <212> PRT <213> Archaeoglobus fugidis <400> 11 Met Phe Lys Pro Lys Ala Ile Ala Val Asp Ile Asp Gly Thr Leu Thr 1 5 10 15 Asp Arg Lys Arg Ala Leu Asn Cys Arg Ala Val Glu Ala Leu Arg Lys 20 25 30 Val Lys Ile Pro Val Ile Leu Ala Thr Gly Asn Ile Ser Cys Phe Ala 35 40 45 Arg Ala Ala Ala Lys Leu Ile Gly Val Ser Asp Val Val Ile Cys Glu 50 55 60 Asn Gly Gly Val Val Arg Phe Glu Tyr Asp Gly Glu Asp Ile Val Leu 65 70 75 80 Gly Asp Lys Glu Lys Cys Val Glu Ala Val Arg Val Leu Glu Lys His 85 90 95 Tyr Glu Val Glu Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Arg Lys Ser Glu Val Cys 100 105 110 Met Arg Arg Ser Phe Asp Ile Asn Glu Ala Arg Lys Leu Ile Glu Gly 115 120 125 Met Gly Val Lys Leu Val Asp Ser Gly Phe Ala Tyr His Ile Met Asp 130 135 140 Ala Asp Val Ser Lys Gly Lys Ala Leu Lys Phe Val Ala Glu Arg Leu 145 150 155 160 Gly Ile Ser Ser Ala Glu Phe Ala Val Ile Gly Asp Ser Glu Asn Asp 165 170 175 Ile Asp Met Phe Arg Val Ala Gly Phe Gly Ile Ala Val Ala Asn Ala 180 185 190 Asp Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Ala Asp Leu Val Thr Pro Ser Pro Asp 195 200 205 Gly Glu Gly Val Val Glu Ala Leu Gln Phe Leu Gly Leu Leu Arg 210 215 220 <210> 12 <211> 659 <212> PRT <213> Thermococcus litoralis <400> 12 Met Glu Arg Ile Asn Phe Ile Phe Gly Ile His Asn His Gln Pro Leu 1 5 10 15 Gly Asn Phe Gly Trp Val Phe Glu Glu Ala Tyr Asn Arg Ser Tyr Arg 20 25 30 Pro Phe Met Glu Ile Leu Glu Glu Phe Pro Glu Met Lys Val Asn Val 35 40 45 His Phe Ser Gly Pro Leu Leu Glu Trp Ile Glu Glu Asn Lys Pro Asp 50 55 60 Tyr Leu Asp Leu Leu Arg Ser Leu Ile Lys Arg Gly Gln Leu Glu Ile 65 70 75 80 Val Val Ala Gly Phe Tyr Glu Pro Val Leu Ala Ala Ile Pro Lys Glu 85 90 95 Asp Arg Leu Val Gln Ile Glu Met Leu Lys Asp Tyr Ala Arg Lys Leu 100 105 110 Gly Tyr Asp Ala Lys Gly Val Trp Leu Thr Glu Arg Val Trp Gln Pro 115 120 125 Glu Leu Val Lys Ser Leu Arg Glu Ala Gly Ile Glu Tyr Val Val Val 130 135 140 Asp Asp Tyr His Phe Met Ser Ala Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Phe 145 150 155 160 Trp Pro Tyr Tyr Thr Glu Asp Gly Gly Glu Val Ile Thr Val Phe Pro 165 170 175 Ile Asp Glu Lys Leu Arg Tyr Leu Ile Pro Phe Arg Pro Val Lys Lys 180 185 190 Thr Ile Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Thr Ser Asp Asp Pro Ser Lys Val 195 200 205 Ala Val Phe His Asp Asp Gly Glu Lys Phe Gly Val Trp Pro Gly Thr 210 215 220 Tyr Glu Trp Val Tyr Glu Lys Gly Trp Leu Arg Glu Phe Phe Asp Ala 225 230 235 240 Ile Thr Ser Asn Glu Lys Ile Asn Leu Met Thr Tyr Ser Glu Tyr Leu 245 250 255 Ser Lys Phe Thr Pro Arg Gly Leu Val Tyr Leu Pro Ile Ala Ser Tyr 260 265 270 Phe Glu Met Ser Glu Trp Ser Leu Pro Ala Lys Gln Ala Lys Leu Phe 275 280 285 Val Glu Phe Val Glu Gln Leu Lys Glu Glu Gly Lys Phe Glu Lys Tyr 290 295 300 Arg Val Phe Val Arg Gly Gly Ile Trp Lys Asn Phe Phe Phe Lys Tyr 305 310 315 320 Pro Glu Ser Asn Phe Met His Lys Arg Met Leu Met Val Ser Lys Ala 325 330 335 Val Arg Asp Asn Pro Glu Ala Arg Lys Tyr Ile Leu Lys Ala Gln Cys 340 345 350 Asn Asp Ala Tyr Trp His Gly Val Phe Gly Gly Ile Tyr Leu Pro His 355 360 365 Leu Arg Arg Thr Val Trp Glu Asn Ile Ile Lys Ala Gln Arg Tyr Leu 370 375 380 Lys Pro Glu Asn Lys Ile Leu Asp Val Asp Phe Asp Gly Arg Ala Glu 385 390 395 400 Ile Met Val Glu Asn Asp Gly Phe Ile Ala Thr Ile Lys Pro His Tyr 405 410 415 Gly Gly Ser Ile Phe Glu Leu Ser Ser Lys Arg Lys Ala Val Asn Tyr 420 425 430 Asn Asp Val Leu Pro Arg Arg Trp Glu His Tyr His Glu Val Pro Glu 435 440 445 Ala Thr Lys Pro Glu Lys Glu Ser Glu Glu Gly Ile Ala Ser Ile His 450 455 460 Glu Leu Gly Lys Gln Ile Pro Glu Glu Ile Arg Arg Glu Leu Ala Tyr 465 470 475 480 Asp Trp Gln Leu Arg Ala Ile Leu Gln Asp His Phe Ile Lys Pro Glu 485 490 495 Glu Thr Leu Asp Asn Tyr Arg Leu Val Lys Tyr His Glu Leu Gly Asp 500 505 510 Phe Val Asn Gln Pro Tyr Glu Tyr Glu Met Ile Glu Asn Gly Val Lys 515 520 525 Leu Trp Arg Glu Gly Gly Val Tyr Ala Glu Glu Lys Ile Pro Ala Arg 530 535 540 Val Glu Lys Lys Ile Glu Leu Thr Glu Asp Gly Phe Ile Ala Lys Tyr 545 550 555 560 Arg Val Leu Leu Glu Lys Pro Tyr Lys Ala Leu Phe Gly Val Glu Ile 565 570 575 Asn Leu Ala Val His Ser Val Met Glu Lys Pro Glu Glu Phe Glu Ala 580 585 590 Lys Glu Phe Glu Val Asn Asp Pro Tyr Gly Ile Gly Lys Val Arg Ile 595 600 605 Glu Leu Asp Lys Ala Ala Lys Val Trp Lys Phe Pro Ile Lys Thr Leu 610 615 620 Ser Gln Ser Glu Ala Gly Trp Asp Phe Ile Gln Gln Gly Val Ser Tyr 625 630 635 640 Thr Met Leu Phe Pro Ile Glu Lys Glu Leu Glu Phe Thr Val Arg Phe 645 650 655 Arg Glu Leu

Claims

당류로부터의 타가토스를 생산하기 위한 개선된 방법으로서,
개선이 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 사용하여 프럭토스-6-포스페이트(F6P)를 타가토스 6-포스페이트(T6P)로 전환시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 F6PE가 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
당류로부터의 타가토스를 생산하기 위한 개선된 방법으로서,
개선이 타가토스-6-포스페이트 포스파타제(T6PP)를 사용하여 T6P를 타가토스로 전환시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 T6PP가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제2항에 있어서,
프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 사용하여 프럭토스-6-포스페이트(F6P)를 타가토스 6-포스페이트(T6P)로 전환시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 F6PE가 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
글루코스 6-포스페이트(G6P)를 F6P로 전환시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 단계가 포스포글루코스 이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는, 방법.
제4항에 있어서,
글루코스 1-포스페이트(G1P)를 G6P로 전환시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 단계는 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는, 방법.
제5항에 있어서,
당류를 G1P로 전환시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 단계가 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되며, 상기 당류가 전분 또는 이의 유도체, 셀룰로스 또는 이의 유도체 및 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제6항에 있어서,
적어도 하나의 효소가 알파-글루칸 포스포릴라제(αGP), 말토스 포스포릴라제, 수크로스 포스포릴라제, 셀로덱스트린 포스포릴라제, 셀로비오스 포스포릴라제 및 셀룰로스 포스포릴라제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제6항에 있어서,
당류가 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토스, 말토트리오스 및 글루코스로 이루어진 군으로부터 선택된 전분 또는 이의 유도체인, 방법.
제8항에 있어서,
전분을 전분 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 전분 유도체가 전분의 효소적 가수분해에 의해 또는 전분의 산 가수분해에 의해 제조되는, 방법.
제9항에 있어서,
4-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)가 상기 방법에 첨가되는, 방법.
제9항에 있어서,
전분 유도체가 이소아밀라제, 풀루라나제, 알파-아밀라제 또는 이들의 조합에 의해 촉매되는 전분의 효소적 가수분해에 의해 제조되는, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 프럭토스의 F6P로의 전환 단계; 및
임의로, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 수크로스의 프럭토스로의 전환 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제4항에 있어서,
적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 글루코스의 G6P로의 전환 단계; 및
임의로, 적어도 하나의 효소에 의해 촉매되는 수크로스의 글루코스로의 전환 단계
를 추가로 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 방법이
(i) 하나 이상의 효소를 사용하여 당류를 글루코스 1-포스페이트(G1P)로 전환시키고, 상기 당류가 전분, 전분의 하나 이상의 유도체 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계;
(ii) 포스포글루코뮤타제(PGM)를 사용하여 G1P를 글루코스 6-포스페이트(G6P)로 전환시키는 단계;
(iii) 포스포글루코이소머라제(PGI)를 사용하여 G6P를 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로 전환시키는 단계;
(iv) 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)를 사용하여 F6P를 타가토스 6-포스페이트(T6P)로 전환시키는 단계; 및
(v) 타가토스 6-포스페이트 포스파타제(T6PP)를 사용하여 T6P를 타가토스로 전환시키고, 상기 T6PP가 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계
를 포함하고, 방법 단계 (i) 내지 (v)가 단일 반응 용기에서 수행되는 타가토스의 효소적 생산 방법인, 방법.
제14항에 있어서,
F6PE가 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 7에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 방법 단계가 적어도 하나의 하기 방법 조건 하에서 수행되는 방법:
약 37℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도,
약 5.0 내지 약 9.0 범위의 pH, 또는
약 1시간 내지 약 48시간.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 방법 단계가 적어도 하나의 하기 방법 조건 하에서 수행되고:
포스페이트 공급원으로서 아데노신 트리포스페이트(ATP) 없이,
니코틴아미드 아데노신 디뉴클레오티드 없이,
약 0.1 mM 내지 약 150 mM의 포스페이트 농도,
약 0.1 mM 내지 50 mM의 Mg²⁺ 농도;
여기서 포스페이트는 재활용되고;
방법의 적어도 하나의 단계는 에너지면에서 유리한 화학 반응을 포함하는, 방법.
제17항에 있어서,
포스페이트가 재활용되고, T6P의 T6PP 탈인산화에 의해 생성된 포스페이트 이온이 당류를 G1P로 전환시키는 방법 단계에서 사용되는, 방법.
제17항에 있어서,
T6P를 타가토스로 전환시키는 단계가 에너지면에서 유리한 비가역적 포스파타제 반응인, 방법.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
생성된 타가토스를 분리 회수하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 상기 분리 회수가 크로마토그래피 분리를 통한 것이 아닌, 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서,
전분의 유도체가 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토트리오스, 말토스 및 글루코스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법으로부터 생산된 타가토스.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법으로부터 생산된 타가토스를 함유하는 소모성 제품(consumable product).
제1항에 있어서,
F6PE가 딕티오글로무스 서모필룸(Dictyoglomus thermophilum) 유래의 F6PE(Uniprot ID B5YBD7)의 활성에 비해 더 높은 활성을 갖는, 방법.
제2항에 있어서,
T6PP가 아르카에오글로부스 풀지두스(Archaeoglobus fulgidus) 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)의 활성에 비해 더 높은 활성을 갖는, 방법.
제24항에 있어서,
F6PE가 딕티오글로무스 서모필룸 유래의 F6PE(Uniprot ID B5YBD7)의 활성에 비해 적어도 10% 더 높은 활성을 갖는, 방법.
제25항에 있어서,
T6PP가 아르카에오글로부스 풀지두스 유래의 T6PP(Uniprot ID O29805)의 활성에 비해 적어도 10% 더 높은 활성을 갖는, 방법.