KR20210096104A - 헥소스의 효소적 생산 - Google Patents

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Abstract

본원에는, 개선된 효소적 공정에 의해 당류로부터 헥소스를 생산하는 방법이 개시된다. 개선된 공정은 이전에 보고된 것보다 더 높은 활성을 갖는 효소를 사용하여 전분 또는 전분 유도체, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체 또는 수크로스를 글루코스 6-포스페이트(G6P) 중간체로 전환시킨다.

Description

헥소스의 효소적 생산
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 29일에 출원된 미국 출원 제62/752,061호 및 2019년 6월 5일에 출원된 미국 출원 제62/857,543호에 대한 우선권을 주장하고, 상기 출원 각각은 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 헥소스 단당류의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이전에 보고된 것보다 더 높은 활성을 갖는 효소를 사용하여 중간체 글루코스 6-포스페이트(G6P)를 제조하는 개선된 방법을 제공한다.
헥소스는 6개의 탄소 원자를 갖는 단당류이다. 헥소스는 작용기에 의해, 위치 1에 알데히드를 갖는 알도헥소스 및 위치 2에 케톤을 갖는 케토헥소스로 분류될 수 있다. 알도헥소스(또는 알도스)는 알로스, 알트로스, 글루코스, 굴로스, 갈락토스, 이도스, 탈로스 및 만노스를 포함한다. 케토헥소스(또는 케토스)는 사이코스(알룰로스), 프럭토스, 타가토스 및 소르보스를 포함한다. 이노시톨은 알데히드 또는 케토스 기가 없는 헥소스이며 카보사이클릭 당으로 특징지어진다.
그 전체가 본원에 참조로 포함된 국제 특허출원공개 제WO2018/169957호는 효소적 전환에 의해 당류로부터 헥소스를 제조하는 방법을 설명한다. 그 전체가 본원에 참조로 포함된 국제 특허출원공개 제WO2017/059278호 및 제WO2018/004310호는 효소적 전환에 의해 당류로부터 타가토스를 제조하는 방법을 설명한다. 그 전체가 본원에 참조로 포함된 국제 특허출원공개 제WO2018/112139호는 효소적 전환에 의해 당류로부터 알룰로스를 제조하는 방법을 설명한다. 그 전체가 본원에 참조로 포함된 대한민국 출원공개 제KR20040098757A호는 효소적 전환에 의해 당류로부터 프럭토스 6-포스페이트를 제조하는 방법을 설명한다. 그 전체가 본원에 참조로 포함된 중국 출원공개 제CN106148425B호는 효소적 전환에 의해 당류로부터 이노시톨을 제조하는 방법을 설명한다. 이들 방법 각각에서, 글루코스 6-포스페이트(G6P)는 효소적 경로의 중간체이다.
높은 수율의 효소적 헥소스 생산의 발전에도 불구하고, 예를 들어 더 적은 양의 효소로 더 높은 수율을 제공할 수 있는 추가로 개선된 헥소스 생산 방법을 제공할 필요성이 여전히 존재한다. 헥소스 생산 비용을 감소시키는 데 강한 산업적 및 상업적 관심이 있으며, 이러한 감소는 감소된 양의 효소의 사용, 더 높은 활성을 갖는 효소 및 당류를 G6P 중간체로 전환시키는 데 더 효과적인 효소들의 조합의 사용을 필요로 한다.
본원에 설명된 발명은 일반적으로 효소적 전환에 의해 다양한 당류 출발 재료로부터 헥소스를 제조하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 당류는 전분 또는 전분 유도체, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체 또는 수크로스로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 개선된 방법에서, 지시된 바와 같이 방법 단계에 사용되는 효소는 헥소스의 제조를 위해 이전에 개시된 효소에 비해 개선된 활성을 갖는다.
전분 또는 전분 유도체로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 개선은 a) 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계로서, 여기서 PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; b) 알파-글루칸 포스포릴라제(αGP)에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계로서, 여기서 αGP가 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및 4-알파-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이(transglycosylating) 단계로서, 여기서 4GT가 서열번호 15 내지 서열버호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계 중 적어도 하나를 포함한다.
셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 개선은 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 G1P의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계를 포함하며, 여기서 PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
수크로스로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 개선은 a) 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계로서, 여기서 PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및 b) 수크로스 포스포릴라제를 사용하여 수크로스를 글루코스 1-포스페이트(G1P)로 전환시키고 상기 수크로스 포스포릴라제가 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 일부 개선된 방법에서, 헥소스는 알로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 알트로스, 탈로스, 소르보스, 굴로스 이도스, 알룰로스, 이노시톨 및 타가토스로부터 선택된다. 본 발명의 일부 개선된 방법은 헥소스 포스페이트 포스파타제를 사용하여 헥소스-포스페이트를 탈인산화하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 단일 반응 용기에서 수행된다. 본 발명의 다른 개선된 방법에서, 방법 단계는 하나 초과의 반응 용기에서 수행된다. 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 약 0.1 mM 내지 약 150 mM의 포스페이트 농도에서 ATP-무함유, NAD(P)(H)-무함유로 수행되고/되거나, 포스페이트는 재활용되고/되거나, 헥소스 포스페이트의 탈인산화 단계는 에너지면에서 유리한 화학 반응을 포함한다. 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 하기의 방법 조건 중 적어도 하나에서 수행된다: 약 37℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도에서, 약 5.0 내지 약 8.0 범위의 pH에서, 또는 약 0.5시간 내지 약 48시간 동안. 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 연속 반응으로서 수행된다.
도 1은 수크로스를 G6P로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: SP, 수크로스 포스페이트; 및 PGM, 포스포글루코뮤타제. 본 발명의 개선된 방법은 하기의 개선 중 하나 이상을 함유한다: SP는 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, PGM은 적어도 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
도 2는 전분 유도체 말토덱스트린을 G6P로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀루라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; 4GT, 4-글루칸 트랜스퍼라제; 및 PGM, 포스포글루코뮤타제. 본 발명의 개선된 방법은 하기의 개선 중 하나 이상을 포함한다: PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; αGP는 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 4GT는 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
도 3은 셀룰로스를 G6P로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: CDP, 셀로덱스트린 포스포릴라제; 및 PGM, 포스포글루코뮤타제. 본 발명의 개선된 방법에서, PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
도 4는 G6P를 알로스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; P6PE, 사이코스 6-포스페이트 3-에피머라제; A6PI, 알로스 6-포스페이트 이소머라제; A6PP, 알로스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 5는 G6P를 만노스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; PMI, 포스포만노스 이소머라제; 및 M6PP, 만노스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 6은 G6P를 갈락토스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 이소머라제; Gal6PI, 갈락토스 6-포스페이트 이소머라제; Gal6PP, 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 7은 G6P를 프럭토스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PP, 프럭토스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 8은 G6P를 알트로스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; P6PE, 사이코스 6-포스페이트 에피머라제; Alt6PI, 알트로스 6-포스페이트 이소머라제; Alt6PP, 알트로스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 9는 G6P를 탈로스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; Tal6PI, 탈로스 6-포스페이트 이소머라제; Tal6PP, 탈로스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 10은 G6P를 소르보스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; S6PE, 소르보스 6-포스페이트 에피머라제; S6PP, 소르보스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 11은 G6P를 굴로스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; S6PE, 소르보스 6-포스페이트 에피머라제; Gul6PI, 굴로스 6-포스페이트 이소머라제; Gul6PP, 글루코스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 12는 G6P를 이도스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; S6PE, 소르보스 6-포스페이트 에피머라제; I6PI, 이도스 6-포스페이트 이소머라제; I6PP, 이도스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 13은 G6P를 타가토스로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; F6PE, 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제; T6PP, 타가토스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 14는 G6P를 이노시톨로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: IPS, 이노시톨-포스파타제 신타제; IMP, 이노시톨 모노 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 15는 G6P를 사이코스(알룰로스)로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: PGI, 포스포글루코이소머라제; P6PE, 사이코스 6-포스페이트 에피머라제; P6PP, 사이코스 6-포스페이트 포스파타제. 본 발명에 따른 개선된 방법을 위한 효소적 경로의 경우, 이 경로는 도 1, 도 2 또는 도 3의 경로와 조합된다.
도 16은 글루코스 1-포스페이트를 다른 헥소스로 전환시키기 위한 형성 깁스 에너지(formation Gibbs energy)에 기초한 중간체들 간의 반응 깁스 에너지(Reaction Gibbs Energy)를 도시한다.
도 17은 HPLC 크로마토그램을 통한 말토덱스트린의 G6P로의 전환을 도시한다; (파선) 0시간 크로마토그램; (점선) 이전에 개시된 αGP(Uniprot ID G4FEH8) 및 PGM(Uniprot ID Q68BJ6)을 사용한 30분 방법; 및 (실선) 더 높은 활성 αGP(Uniprot ID D1B926) 및 더 높은 활성 PGM(Uniprot ID A0A150LLZ1)을 사용한 30분 "개선된" 방법. (1) 없음(Void) 및 말토덱스트린, (2) G1P 및 G6P, (3) 말토트리오스 및 (4) 말토스.
도 18은 수크로스 포스포릴라제 활성의 크로마토그램을 도시한다. 상단 크로마토그램은 더 높은 활성 SP인 Uniprot ID F6BJS0와 비교한 Uniprot ID D9TT09(참조 SP)와의 반응을 나타낸다. 0시간 반응(수크로스에서 프럭토스로)은 파선으로서 나타내져 있고 동일한 양의 SP 및 기타 효소를 사용한 2시간 반응은 참조(실선) 및 더 높은 활성 SP(점선) 둘 다에 대해 나타내져 있다. 2시간차에, 더 높은 활성 SP는 참조 SP의 프럭토스 양의 약 150%를 생성한다. 하단 크로마토그램은 Uniprot ID D9TT09(참조 SP)를 더 높은 활성 Uniprot ID F6BJS0과 비교한다. 0시간 반응(수크로스에서 프럭토스)은 파선으로 나타내져 있고 동일한 양의 SP 및 기타 효소를 사용한 6시간 반응은 참조 SP(실선) 및 더 높은 활성 SP(점선) 둘 다에 대해 나타내져 있다. 6시간(두 반응 모두의 최대 수율)에서, 더 높은 활성 SP는 참조 SP의 프럭토스 양의 약 130%를 생성한다.
도 19는 훨씬 더 높은 활성 PGM과 비교한 Uniprot ID A0A150LLZ1과의 반응의 크로마토그램이다. 크로마토그램은 제한 PGM, 과량의 포스포글루코이소머라제 및 과량의 프럭토스 6-포스페이트 포스파타제와 함께 항온배양한 후 글루코스 1-포스페이트로부터 생성된 프럭토스 수준을 나타낸다. PGM이 효소적 방법의 제한 효소이기 때문에, 다른 모든 PGM을 동일한 양으로 사용하는 것은 프럭토스 생산을 개선시키고 따라서 PGM 활성을 향상시킨다는 것이 명백히 보인다. 본 도면에서, Uniprot ID A0A0P6YKY9 = 실선; Uniprot ID E8N4Y6 = 파선; Uniprot ID R7RR04 = 점선; Uniprot ID A0A023DI95 = 원의 선; UniParc ID UPI0001D17AE3 = 삼각형의 선; 및 Uniprot ID A0A150LLZ1 = 사각형의 선. 훨씬 더 낮은 참조 PGM Uniprot ID Q68BJ6의 활성(표 1 참조)은 나타내져 있지 않다.
본원에 설명된 발명은 생성물 분리 비용 및 헥소스 생산 비용을 크게 감소시키면서 높은 생성물 수율로 헥소스를 합성하기 위한 효소적 경로 또는 방법을 제공한다. 본원에 설명된 효소적 방법은 일반적으로 효소적 전환에 의해 당류로부터 헥소스 단당류를 제조하는 개선된 방법에 관한 것이다. 무세포(cell-free) 효소 칵테일을 사용하여 당류를 헥소스로 전환시키기 위한 인공(비천연) ATP-무함유(free) 효소적 경로가 제공된다. 세포-기반 제조 방법과 달리, 본 발명의 효소적 방법은 헥소스의 무세포 제조를 포함하고, 종종 세포의 안과 밖으로의 기질/생성물 수송을 느리게 하는 세포막의 제거로 인해 상대적으로 높은 반응 속도를 갖는다. 본 방법은 또한 영양소가 풍부한 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 생성물을 갖는다. 당류는 전분 또는 전분 유도체, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체 또는 수크로스로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 개선된 방법에서, 방법 단계에 사용되는 효소는, 지시된 바와 같이, 헥소스의 제조를 위해 이전에 개시된 효소에 비해 개선된 활성을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 발명은 이전에 개시된 αGP, PGM 및 4GT 대신에 더 높은 활성을 갖는 αGP, PGM 및 4GT 중 적어도 하나를 사용하여 전분 및 이의 유도체를 헥소스로 전환시키기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 서모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 알파-글루칸 포스포릴라제(αGP)(Uniprot ID G4FEH8); 서모코쿠스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis) 유래의 포스포글루코뮤타제(PGM)(Uniprot ID Q68BJ6); 및 서모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래의 4-알파-글루카노트랜스퍼라제(Uniprot ID O32462)를 개시하는 국제 특허출원공개 WO2018/169957 참조. 전분 또는 전분 유도체로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 개선은 a) 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계로서, 여기서 PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; b) 알파-글루칸 포스포릴라제(αGP)에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계로서, 여기서 αGP가 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및 4-알파-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계로서, 여기서 4GT가 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계 중 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 개선된 방법에서, 방법은 a) 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계로서, 여기서 PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; b) 알파-글루칸 포스포릴라제(αGP)에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계로서, 여기서 αGP가 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및 4-알파-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계로서, 여기서 4GT가 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 서모코쿠스 코다카라엔시스 유래의 PGM(Uniprot ID Q68BJ6) 대신에 더 높은 활성을 갖는 PGM을 사용하여 셀룰로스 및 이의 유도체를 헥소스로 전환시키는 개선된 방법에 관한 것이다. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 개선은 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계를 포함하며, 여기서 PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 이전에 개시된 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09) 대신에 더 높은 활성을 갖는 SP 및 서모코쿠스 코다카라엔시스 유래의 PGM(Uniprot ID Q68BJ6) 대신에 더 높은 활성을 갖는 PGM 중 적어도 하나를 사용하여 수크로스를 헥소스로 전환시키는 개선된 방법에 관한 것이다. 수크로스로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 개선은 a) 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계로서, 여기서 PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및 b) 수크로스 포스포릴라제를 사용하여 수크로스를 글루코스 1-포스페이트(G1P)로 전환시키는 단계로서, 여기서 수크로스 포스포릴라제가 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계 중 적어도 하나를 포함한다. 본 발명의 개선된 방법에서, 방법은 a) 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계로서, 여기서 PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및 b) 수크로스 포스포릴라제를 사용하여 수크로스를 글루코스 1-포스페이트(G1P)로 전환시키는 단계로서, 여기서 수크로스 포스포릴라제가 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 개선된 방법에서, 헥소스는 알로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 알트로스, 탈로스, 소르보스, 굴로스 이도스, 알룰로스, 이노시톨 및 타가토스로부터 선택된다. 본 발명의 일부 개선된 방법은 헥소스 포스페이트 포스파타제를 사용하여 헥소스-포스페이트를 탈인산화하는 단계를 추가로 포함한다.
전분 또는 전분 유도체, 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체 또는 수크로스로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 본 발명에 따른 일부 개선된 방법은 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계를 포함하며, 여기서 PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, PGM은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
포스포글루코뮤타제(PGM)(EC 5.4.2.2)는 글루코스 1-포스페이트와 글루코스 6-포스페이트의 상호전환을 촉매한다. 당류로부터 헥소스를 생산하기 위한 본 발명의 개선된 방법에서, 반응은 G6P의 방향으로 진행되며, 그 후 하류에서 추가로 처리되며 여기서 방법의 최종 효소적 단계는 에너지면에서 유리하고 비가역적인 탈인산화 단계이다.
본 발명의 개선된 방법에서, PGM은 서열번호 1에 열거된 아미노산 서열을 갖는 이전에 설명된 서모코쿠스 코다카라엔시스 유래의 PGM(Uniprot ID Q68BJ6)에 비해 더 높은 활성을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 PGM은 서모코쿠스 코다카라엔시스 유래의 PGM(Uniprot ID Q68BJ6)의 활성에 비해 적어도 10%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 2000%, 적어도 2500%, 적어도 3000%, 적어도 3500%, 적어도 4000%, 적어도 4500%, 적어도 5000% 또는 적어도 5500% 개선된 효소 활성을 갖는다.
예를 들어, 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 PGM은 서모코쿠스 코다카라엔시스 유래의 PGM(Uniprot ID Q68BJ6)에 비해 개선된 활성을 갖는다: 게오바실루스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus) NUB3621 유래의 PGM(Uniprot ID A0A023CRS6)은 약 700% 개선된 효소 활성을 갖고; 칼디바실루스 데빌리스(Caldibacillus debilis) 유래의 PGM(Uniprot ID A0A150LLZ1)은 약 1900% 개선된 효소 활성을 갖고; 게오바실루스 서모글루코시다시우스(Geobacillus thermoglucosidasius) 유래의 PGM(UniParc ID UPI0001D17AE3)은 약 2100% 개선된 효소 활성을 갖고; 파라게오바실루스 칼독실로실리티쿠스(Parageobacillus caldoxylosilyticus) NBRC 107762 유래의 PGM(Uniprot ID A0A023DI95)은 약 1980% 개선된 효소 활성을 갖고; 서모브라키움 셀레레(Thermobrachium celere) DSM 8682 유래의 PGM(Uniprot ID R7RR04)은 약 5100% 개선된 효소 활성을 갖고; 안에어롤리네아 서모필라(Anaerolinea thermophila) 유래의 PGM(Uniprot ID E8N4Y6)은 약 5800% 개선된 효소 활성을 갖고; 서만에어로트릭스 닥센시스(Thermanaerothrix daxensis) 유래의 PGM(Uniprot ID A0A0P6YKY9)은 약 6500% 개선된 효소 활성을 갖는다. 하기의 실시예는, 예를 들어 효소를 이의 기질과 함께 항온배양한 다음, HPLC를 통해 반응물 및 생성물 또는 후속적 하류 생성물의 양을 측정하는 것을 포함하는 효소적 방법의 일부분으로서 PGM의 활성을 결정하기 위한 프로토콜을 당업자에게 제공한다. 임의의 두 효소의 상대적 활성의 측정은 완충제, pH, 온도 등과 같은 동일한 반응 조건 하에 수행된다.
본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 PGM의 예로는 하기의 단백질이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 서열번호 2에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 게오바실루스 스테아로서모필루스 NUB3621 유래의 PGM(Uniprot ID A0A023CRS6); 서열번호 3에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 칼디바실루스 데빌리스 유래의 PGM(Uniprot ID A0A150LLZ1); 서열번호 4에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 게오바실루스 서모글루코시다시우스 유래의 PGM(UniParc ID UPI0001D17AE3); 서열번호 5에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 파라게오바실루스 칼독실로실리티쿠스 NBRC 107762 유래의 PGM(Uniprot ID A0A023DI95); 서열번호 6에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서모브라키움 셀레레 DSM 8682 유래의 PGM(Uniprot ID R7RR04); 서열번호 7에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 안에어롤리네아 서모필라 유래의 PGM(Uniprot ID E8N4Y6); 및 서열번호 8에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서만에어로트릭스 닥센시스 유래의 PGM(Uniprot ID A0A0P6YKY9); 및 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PGM.
본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 PGM은 일반적으로 알파-D-포스포헥소뮤타제 슈퍼패밀리(IPR005841)의 일부분이고 효소의 활성 부위를 형성하는 4개의 도메인을 함유한다. 처음 3개의 도메인은 αβ 코어로 이루어지고 4번째 도메인은 TATA 박스-결합 단백질-유사 폴드를 함유한다(Mehra-Chaudhary et al. Proteins 79(4): 1215-29, 2011). 1번째 도메인은 포스포릴 전달을 위한 보존된 세린 잔기(서열번호 3의 Ser147)를 활성 부위에 제공한다. 2번째 도메인은 보존된 Mg2+ 결합 잔기(서열번호 3의 Asp306, Asp308 및 Asp310)를 활성 부위에 제공한다. 3번째 도메인은 기질 특이성을 위한 보존된 잔기(서열번호 3의 Glu406 및 Ser408)를 활성 부위에 제공한다. 4번째 도메인은 포스페이트 결합을 위한 보존된 잔기(서열번호 3의 Arg538)를 활성 부위에 제공한다. 추가로, 양으로 하전된 잔기(Lys/Arg)는 촉매에서 역할을 하며 서열번호 3의 Lys420에서 보존된다. 문헌[Lee et al. FEBS J 280(11): 2622-32, 2013 및 Levin et al. Protein Engineering, Design and Selection 12(9): 737-746, 1999]에서 인용된 보존된 잔기.
본 발명에 따른 전분 또는 전분 유도체로부터 헥소스를 생산하기 위한 본 발명의 일부 개선된 방법은 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계를 포함하며, 여기서 αGP는 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, αGP는 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, αGP는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다.
알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제(αGP) (EC 2.4.1.1)는 말토올리고당을 가인산분해성으로 절단하여 G1P를 생성한다. 전분 포스포릴라제는 또한 역반응, 즉 G1P로부터 알파-1,4-D-글루칸 사슬의 비환원 말단으로의 글루코 실 단위 전달과 함께 포스페이트 방출을 촉매한다. 일반적으로, 올리고당 사슬의 중합도는 4 이상이다. 전분 유도체로부터 헥소스를 생산하기 위한 본 발명의 개선된 방법에서, 반응은 G1P의 방향으로 진행되고, 그 후 하류에서 추가로 처리되며 여기서 방법의 최종 효소적 단계는 에너지면에서 유리하고 비가역적인 탈인산화 단계이다.
본 발명의 개선된 방법에서, αGP는 서열번호 9에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 이전에 설명된 서모토가 마리티마 유래의 알파-글루칸 포스포릴라제(αGP)(Uniprot ID G4FEH8)에 비해 더 높은 활성을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 αGP는 서모토가 마리티마 유래의 αGP(Uniprot ID G4FEH8)의 활성에 비해 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150% 또는 적어도 200% 개선된 효소 활성을 갖는다. 예를 들어, 실시예 2에 나타낸 바와 같이, 서머스 서모필루스(Thermus thermophilus) 유래의 αGP(Uniprot ID Q5SJ42)는 서모토가 마리티마 유래의 αGP(Uniprot ID G4FEH8)에 비해 약 71% 개선된 효소 활성을 가지며; 서머스 종(Thermus sp.) CCB_US3_UF1 유래의 αGP(Uniprot ID G8NCC0)는 서모토가 마리티마 유래의 αGP(Uniprot ID G4FEH8)에 비해 약 186% 개선된 효소 활성을 갖고; 서모안에어로박테 슈데타놀리쿠스(Thermoanaerobacter pseudethanolicus) 균주 ATCC 33223 유래의 αGP(Uniprot ID B0K7V8)는 서모토가 마리티마 유래의 αGP(Uniprot ID G4FEH8)에 비해 약 128% 개선된 효소 활성을 갖고; 서만에어로비브리오 아시다미노보란스(Thermanaerovibrio acidaminovorans) 균주 ATCC 49978 유래의 αGP(Uniprot ID D1B926)는 서모토가 마리티마 유래의 αGP(Uniprot ID G4FEH8)에 비해 약 111% 개선된 효소 활성을 갖는다. 하기의 실시예는, 예를 들어 효소를 이의 기질과 함께 항온배양한 다음, 분광광도 측정 및 HPLC를 통해 반응물 및 생성물 또는 후속적 하류 생성물의 양을 측정하는 것을 포함하는 효소적 방법의 일부분으로서 αGP의 활성을 결정하기 위한 프로토콜을 당업자에게 제공한다. 임의의 두 효소의 상대적 활성의 측정은 완충제, pH, 온도 등과 같은 동일한 반응 조건 하에 수행된다.
본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 αGP의 예로는 하기의 단백질이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 서열번호 10에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서머스 서모필루스 유래의 αGP(Uniprot ID Q5SJ42); 서열번호 11에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서머스 종 CCB_US3_UF1 유래의 αGP(Uniprot ID G8NCC0); 서열번호 12에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서모안에어로박테 슈데타놀리쿠스 균주 ATCC 33223 유래의 αGP(Uniprot ID B0K7V8); 서열번호 13에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서만에어로비브리오 아시다미노보란스 균주 ATCC 49978 유래의 αGP(Uniprot ID D1B926); 및 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 또는 서열번호 13에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 αGP.
본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 알파-글루칸 포스포릴라제는 일반적으로 글리코실 트랜스퍼라제, 패밀리 35(IPR000811)의 일부분이며 '알파 글루칸 포스포릴라제' 도메인(IPR011834)을 함유한다. 일부 αGP는 PLP 결합, PLP 안정화 및 포스페이트 결합을 위한 보존된 잔기를 갖는다. 예를 들어, Uniprot ID D1B926(서열번호 13)에서 Lys585는 PLP 결합을 위해 보존되고; Arg484 및 Thr581은 PLP 안정화를 위해 보존되고; Gly110, Arg485 및 Lys490은 포스페이트 결합을 위해 보존된다(문헌[Watson et al. The EMBO Journal Vol.16 No.1 pp. 1-14, 1997]에 인용된 보존된 잔기).
전분 유도체로부터 헥소스를 생산하기 위한 본 발명에 따른 일부 개선된 방법에서, 개선은 4-알파-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)를 사용하여 전분 유도체를 당전이하는 단계를 포함하며, 여기서 4GT는 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 4GT는 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는 αGP는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.
4-알파-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)(EC 2.4.1.25)는 다양한 길이의 말토올리고당 및 글루코스를 산출하는 말토올리고당의 당전이를 촉매한다. 말토스와 글루코스는 전이 반응에서 어셉터(acceptor)로서 사용될 수 있다.
헥소스를 생산하기 위한 본 발명의 일부 방법은 헥소스 포스페이트를 헥소스로 전환시키는 에너지면에서 유리한 탈인산화 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 특히 단일 반응 용기에서 수행될 때, 포스페이트는 재활용되어 방법의 상류, 예를 들어 아밀로덱스트린을 G1P로 전환시키는 αGP에 의해 촉매되는 반응에서 사용된다. 그러나, αGP는 중합도(DP)가 4 미만인 아밀로덱스트린에 대해 높은 활성으로 반응하지 않는다. 본 발명에 따른 이러한 방법에서, 4GT가 반응에 첨가되어 전체 수율을 개선시킨다. 4GT는 아밀로덱스트린을 당전이시켜, 4보다 작은 DP, 예를 들어 말토트리오스가 αGP에 의해 분해될 수 있는 더 긴 사슬 아밀로덱스트린으로 전환되도록 한다. 4GT 부재 하에, 말토트리오스는 수율을 향상시키기 위해 방법에 다시 참여할 수 있는 더 긴 사슬 아밀로덱스트린으로 다시 재활용되기보다는 방법의 최종 생성물로서 축적될 수 있다. 4GT는 아밀로덱스트린이 αGP에 의해 충분히 분해되어 상당한 양의 말토트리오스를 생성할 때 수율을 증가시킨다. 이것은 에너지면에서 유리한 탈인산화 단계 및 포스페이트 재활용으로 인해 발생한다.
본 발명의 개선된 방법에서, 4GT는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 갖는, 이전에 설명된 서모코쿠스 리토랄리스 유래의 4-알파-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)(Uniprot ID O32462)에 비해 더 높은 활성을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 4GT는 서모코쿠스 리토랄리스 유래의 4GT(Uniprot ID O32462)의 활성에 비해 적어도 10%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150% 또는 적어도 200% 개선된 효소 활성을 갖는다. 예를 들어, 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 오셔니서머스 프로푼두스(Oceanithermus profundus) DSM 14977 유래의 4GT(Uniprot ID E4U8S9)는 서모코쿠스 리토랄리스 유래의 4GT(Uniprot ID O32462)에 비해 약 128% 개선된 효소 활성을 가지며; 메이오서머스 실바누스(Meiothermus silvanus) 균주 ATCC 700542 유래의 4GT(Uniprot ID D7BF07)는 서모코쿠스 리토랄리스 유래의 4GT(Uniprot ID O32462)에 비해 약 212% 개선된 효소 활성을 갖고; 안에어롤리네아 서모필라 균주 DSM 14523 유래의 4GT(Uniprot ID E8MXP8)는 서모코쿠스 리토랄리스 유래의 4GT(Uniprot ID O32462)에 비해 약 184% 개선된 효소 활성을 갖는다. 하기의 실시예는, 예를 들어 효소를 이의 기질과 함께 항온배양한 다음, 분광광도 측정을 통해 글루코스의 양을 측정하는 것을 포함하는 효소적 방법의 일부분으로서 GT의 활성을 결정하기 위한 프로토콜을 당업자에게 제공한다. 임의의 두 효소의 상대적 활성의 측정은 완충제, pH, 온도 등과 같은 동일한 반응 조건 하에 수행된다.
본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 4GT의 예로는 하기의 단백질이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 서열번호 15에 열거된 아미노산 서열을 갖는 오셔니서머스 프로푼두스 DSM 14977 유래의 4GT(Uniprot ID E4U8S9); 서열번호 16에 열거된 아미노산 서열을 갖는 메이오서머스 실바누스 균주 ATCC 700542 유래의 4GT(Uniprot ID D7BF07); 서열번호 17에 열거된 아미노산 서열을 갖는 안에어롤리네아 서모필라 균주 DSM 14523 유래의 4GT(Uniprot ID E8MXP8); 및 서열번호 15, 서열번호 16 또는 서열번호 17에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 4GT.
본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 4-글루칸 트랜스퍼라제는 일반적으로 글리코시드 트랜스퍼라제 슈퍼패밀리(IPR017853), 보다 구체적으로 글리코시드 하이드롤라제, 패밀리 77(IPR003385)의 일부분이다. 일반적으로 4-글루칸 트랜스퍼라제는 활성 부위가 배럴 β-가닥의 c-말단에 있는 (β/α)8-배럴 촉매 도메인을 함유한다. 활성 부위는 보존된 세작용기 촉매(catalytic tryad)를 함유한다. 서열번호 17에서, 이들 보존된 잔기는 Asp298(친핵체), Glu345(양성자 공여자) 및 Asp398(전이 상태 안정화인자)에 해당한다. 본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 4GT는 또한 기질 결합과 관련된 보존된 잔기를 함유한다. 예를 들어, 서열번호 17에서, 이들 보존된 잔기는 Tyr60, Asp218, Arg296 및 His397에 해당한다. 문헌[Przylas et al. Journal of Molecular Biology 296(3): 873-886, 2000] 참조.
수크로스로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 일부 개선된 방법에서, 개선은 수크로스 포스포릴라제에 의해 촉매되는 수크로스의 글루코스 1-포스페이트(G1P)로의 전환 단계를 포함하며, 여기서 수크로스 포스포릴라제는 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, SP는 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, SP는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
수크로스 포스포릴라제(EC : 2.4.1.7)는 수크로스 및 무기 포스페이트의 프럭토스 및 G1P로의 전환을 촉매한다. 수크로스로부터 헥소스를 생산하기 위한 본 발명의 개선된 방법에서, 반응은 G1P의 방향으로 진행되며, 그 후 하류에서 추가로 처리되며 여기서 방법의 최종 효소적 단계는 에너지면에서 유리하고 비가역적인 헥소스 포스페이트의 탈인산화 단계이다.
본 발명의 개선된 방법에서, SP는 서열번호 18에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 이전에 설명된 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)에 비해 더 높은 활성을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 SP는 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 100% 또는 적어도 200% 개선된 효소 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 SP는 헥소스, 특히 프럭토스의 개선된 최대 수율을 나타낸다. 예를 들어, 더 높은 활성을 갖는 몇몇 SP가 실시예 4에 제시되어 있다. 서모안에어로박테리움 종 PSU-2 유래의 SP(Uniprot ID A0A1X2FWC2)는 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 11% 개선된 효소 활성 및 9% 더 높은 최대 프럭토스 수율을 갖는다. 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID L0IL15)는 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 50% 개선된 효소 활성 및 1% 더 높은 최대 프럭토스 수율을 갖는다. 서모안에어로박테리움 자일라놀리티큠 유래의 SP(Uniprot ID F6BJS0)는 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 49% 개선된 효소 활성 및 32% 더 높은 최대 프럭토스 수율을 갖는다. 서모바실루스 종 ZCTH02-B1 유래의 SP(Uniprot ID A0A1Y3Q6Q6)는 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 50% 개선된 효소 활성 및 3% 더 높은 최대 프럭토스 수율을 갖는다. 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis) 유래의 SP(Uniprot ID Q84HQ2)는 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 31% 개선된 효소 활성 및 37% 더 높은 최대 프럭토스 수율을 갖는다. 패니바실루스 서모필루스(Paenibacillus thermophilus) 유래의 SP(Uniprot ID A0A388NK91)는 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 22% 개선된 효소 활성 및 19% 더 높은 최대 프럭토스 수율을 갖는다. 테피디바실루스 데카투렌시스(Tepidibacillus decaturensis) 유래의 SP(Uniprot ID A0A135L6L9)는 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 44% 개선된 효소 활성 및 9% 더 높은 최대 프럭토스 수율을 갖는다. 최대 수율의 증가는 상업적 방법에서 중요하며 각 SP에 의해 달성가능한 최대 프럭토스 수율에 대해 설명한다. 아마도, 기여 요인은 프럭토스에 의한 수크로스 포스포릴라제의 생성물 억제, 역반응 속도(G1P + 프럭토스 ↔ 수크로스 + Pi) 및 보다 광범위하게는 반응 후기 단계에서의 프럭토스 형성과 프럭토스 분해 사이의 평형을 포함할 것이다.
하기의 실시예는, 예를 들어 효소를 이의 기질과 함께 항온배양한 다음, HPLC를 통해 반응물 및 생성물 또는 후속적 하류 생성물의 양을 측정하는 것을 포함하는 효소적 방법의 일부분으로서 SP의 활성을 결정하기 위한 프로토콜을 당업자에게 제공한다. 임의의 두 효소의 상대적 활성의 측정은 완충제, pH, 온도 등과 같은 동일한 반응 조건 하에 수행된다.
본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 SP의 예로는 하기의 단백질이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 서열번호 19에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서모안에어로박테리움 종(Thermoanaerobacterium sp.) PSU-2 유래의 SP(Uniprot ID A0A1X2FWC2); 서열번호 20에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID L0IL15); 서열번호 21에 열거된 아미노산 서열을 갖는, 서모안에어로박테리움 자일라놀리티큠 유래의 SP(Uniprot ID F6BJS0); 서열번호 22에 열거된 아미노산 서열을 갖는 서모바실루스 종 ZCTH02-B1 유래의 SP(Uniprot ID A0A1Y3Q6Q6); 서열번호 23에 열거된 아미노산 서열을 갖는 비피도박테리움 아돌레센티스 유래의 SP(Uniprot ID Q84HQ2); 서열번호 24에 열거된 아미노산 서열을 갖는 패니바실루스 서모필루스 유래의 SP(Uniprot ID A0A388NK91); 서열번호 25에 열거된 아미노산 서열을 갖는 테피디바실루스 데카투렌시스 유래의 SP(Uniprot ID A0A135L6L9); 및 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 SP.
본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 SP는 일반적으로 글리코시드 하이드롤라제 슈퍼패밀리(IPR017853), 보다 구체적으로 수크로스 포스포릴라제 패밀리 (IPR022527)의 일부분이고, 글리코실 하이드롤라제, 패밀리 13, 촉매 도메인(IPR006047)을 함유한다. 글리코실 하이드롤라제 도메인은 (β/α)8-배럴로 이루어지며 촉매 도메인이다. 전체적으로, 수크로스 포스포릴라제는 4개의 도메인, N-말단 도메인, 글리코실 하이드롤라제 도메인, B 도메인(글리코실 도메인 내의 큰 루프로부터 형성됨)과 C-말단 도메인으로 이루어진다(Sprogøe D, van den Broek LA, Mirza O, Kastrup JS, Voragen AG, Gajhede M, Skov LK (February 2004). "Crystal structure of sucrose phosphorylase from Bifidobacterium adolescentis". Biochemistry. 43 (5): 1156-62. doi:10.1021/bi0356395. PMID 14756551.). 익히 연구된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 수크로스 포스포릴라제(Uniprot Q59495)에 대한 서열 정렬을 통해, 촉매성 잔기 Asp196(Schwarz A, Nidetzky B (July 2006). "Asp-196-->Ala mutant of Leuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase exhibits altered stereochemical course and kinetic mechanism of glucosyl transfer to and from phosphate". FEBS Letters. 580 (16): 3905-10. doi:10.1016/j.febslet.2006.06.020. PMID 16797542.), Glu237(Schwarz A, Brecker L, Nidetzky B (May 2007). "Acid-base catalysis in Leuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase probed by site-directed mutagenesis and detailed kinetic comparison of wild-type and Glu237-->Gln mutant enzymes". The Biochemical Journal. 403 (3): 441-9. doi:10.1042/BJ20070042. PMC 1876375. PMID 17233628.) 및 Asp 295(Mueller M, Nidetzky B (April 2007). "The role of Asp-295 in the catalytic mechanism of Leuconostoc mesenteroides sucrose phosphorylase probed with site-directed mutagenesis". FEBS Letters. 581 (7): 1403-8. doi:10.1016/j.febslet.2007.02.060. PMID 17350620.)의 보존을 볼 수 있다.
전분은 자연에서 가장 널리 사용되는 에너지 저장 화합물이며 대부분 식물 종자에 저장되어 있다. 천연 전분은 선형 아밀로스 및 분지형 아밀로펙틴을 함유한다. 전분 유도체의 예로는 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토스, 프럭토스 및 글루코스가 포함된다. 전분의 유도체는 전분의 효소적 가수분해에 의해 또는 전분의 산 가수분해에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 전분의 효소적 가수분해는 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 이소아밀라제(IA, EC. 3.2.1.68); α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 풀루라나제(PA, EC. 3.2.1.41); 또는 α-1,4-글리코시드 결합을 절단하는 알파-아밀라제(EC 3.2.1.1)에 의해 촉매될 수 있거나 향상될 수 있다. 옥수수 전분은 αGP 작용을 방해하는 분지를 많이 함유한다. 이소아밀라제는 전분을 탈분지화하여 선형 아밀로덱스트린을 생성하는 데 사용될 수 있다. 이소아밀라제-전처리된 전분은 최종 생성물에서 더 높은 F6P 농도를 초래할 수 있다. 이소아밀라제 및 풀루라나제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 절단하여 알파-글루칸 포스포릴라제에 의한 전분의 보다 완전한 분해를 가능하게 한다. 알파-아밀라제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 절단하고, 따라서 알파-아밀라제는 헥소스로의 더 빠른 전환 및 향상된 용해도를 위해 전분을 단편으로 분해하는 데 사용된다.
셀룰로스는 가장 풍부한 생물 자원이며 식물 세포벽의 주요 성분이다. 비-식품 리그노셀룰로스 바이오매스는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 리그닌뿐만 아니라 기타 미량 성분을 포함한다. 아비셀(Avicel)(미정질 셀룰로스), 재생된 무정형 셀룰로스, 세균 셀룰로스, 필터 페이퍼 등을 비롯한 순수한 셀룰로스는 일련의 처리를 통해 제조될 수 있다. 부분적으로 가수분해된 셀룰로스 기질은 중합도가 7보다 큰 수불용성 셀로덱스트린, 중합도가 3 내지 6인 수용성 셀로덱스트린, 셀로비오스, 글루코스 및 프럭토스를 포함한다. 셀룰로스 유도체의 예로는 전처리된 바이오매스, 재생된 무정형 셀룰로스, 셀로덱스트린, 셀로비오스, 프럭토스 및 글루코스가 포함된다. 더욱이, 셀룰로스의 유도체는 셀룰라제 혼합물에 의해 촉매되는 셀룰로스의 효소적 가수분해에 의해, 산에 의해 또는 바이오매스의 전처리에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 일부 방법에서, G1P는 셀룰로스 포스포릴라제에 의해 셀룰로스로부터 생성된다. 일부 방법에서, G1P는 셀로덱스트린과 셀로비오스 및 유리 포스페이트로부터 생성되고 이는 셀로덱스트린 포스포릴라제(CDP) 및 셀로비오스 포스포릴라제(CBP)에 의해 촉매된다.
본 발명의 일부 개선된 방법에서 헥소스는 알로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 알트로스, 탈로스, 소르보스, 굴로스 이도스, 알룰로스, 이노시톨 및 타가토스로부터 선택된다. 헥소스는 6개의 탄소 원자를 갖는 단당류이다. 헥소스는 작용기에 의해, 위치 1에 알데히드를 갖는 알도헥소스 및 위치 2에 케톤을 갖는 케토헥소스로 분류될 수 있다. 알도헥소스(또는 알도스)는 알로스, 알트로스, 글루코스, 굴로스, 갈락토스, 이도스, 탈로스 및 만노스를 포함한다. 케토헥소스(또는 케토스)는 사이코스(알룰로스), 프럭토스, 타가토스 및 소르보스를 포함한다. 이노시톨은 알데히드 또는 케토스 기가 없으며 카보사이클릭 당으로 특징지어진다. 본 발명의 개선된 방법은 전분 및 이의 유도체를 알로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 알트로스, 탈로스, 소르보스, 굴로스, 타가토스, 알룰로스, 이노시톨 및 이도스로부터 선택된 헥소스로 전환시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시형태는 이러한 개별 헥소스를 생산하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
헥소스 생산을 위한 본 발명의 개선된 방법에서, 헥소스 포스페이트 포스파타제를 사용하여 헥소스 포스페이트를 탈인산화하는 추가 단계가 포함된다. 헥소스 생산을 위한 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 단일 반응 용기에서 수행된다. 본 발명의 다른 개선된 방법에서, 방법 단계는 하나 초과의 단일 반응 용기에서 수행된다. 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 약 0.1 mM 내지 약 150 mM의 포스페이트 농도에서 ATP-무함유, NAD(P)(H)-무함유로 수행되고/되거나, 포스페이트는 재활용되고/되거나, 헥소스 포스페이트의 탈인산화 단계는 에너지면에서 유리한 화학 반응을 포함한다. 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 하기의 방법 조건 중 적어도 하나에서 수행된다: 약 37℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도에서, 약 5.0 내지 약 8.0 범위의 pH에서 또는 약 0.5시간 내지 약 48시간 동안. 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 연속 반응으로서 수행된다.
헥소스 생산을 위한 본 발명의 일부 방법에서, 헥소스 포스페이트 포스파타제를 사용하여 헥소스 포스페이트를 탈인산화하는 추가 단계가 포함된다. 본 발명의 방법에 사용되는 포스파타제는 헥소스 포스페이트에 대해 특이적이다. 예를 들어, 알로스 6-포스페이트는 알로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 알로스로 전환되고; 만노스 6-포스페이트는 만노스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 만노스로 전환되고; 갈락토스 6-포스페이트는 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 갈락토스로 전환되고; 프럭토스 6-포스페이트는 프럭토스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 프럭토스로 전환되고; 알트로스 6-포스페이트는 알트로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 알트로스로 전환되고; 탈로스 6-포스페이트는 탈로스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 탈로스로 전환되고; 소르보스 6-포스페이트는 소르보스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 소르보스로 전환되고; 글루코스 6-포스페이트는 글루코스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 글루코스로 전환되고; 타가토스 6-포스페이트는 타가토스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 타가토스로 전환되고; 사이코스 6-포스페이트는 사이코스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 사이코스로 전환되고; 이노시톨 3-포스페이트는 이노시톨 모노포스파타제에 의해 이노시톨로 전환되고; 이도스 6-포스페이트는 이도스 6-포스페이트 포스파타제에 의해 이도스로 전환된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 특이적은 다른 헥소스보다 표시된 헥소스에 대해 더 높은 특이적 활성을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, 알로스 6-포스페이트 포스파타제는, 예를 들어, 소르보스 6-포스페이트 또는 탈로스 6-포스페이트보다 알로스 6-포스페이트에 대해 더 높은 특이적 활성을 갖는다. 본 발명의 방법에서, 헥소스-포스페이트 포스파타제는 방법의 다른 헥소스 포스페이트 중간체에 비해 표시된 헥소스 포스페이트에 대해 더 높은 활성을 갖는다. 예시적인 예로서, 말토덱스트린을 알로스로 전환시키기 위한 방법에서, 알로스 6-포스페이트 포스파타제는 방법의 다른 헥소스 포스페이트 중간체, 예컨대 G1P, G6P, F6P 및 사이코스 6-포스페이트에 비해 알로스 6-포스페이트에 대해 더 높은 활성을 갖는다. 도 2 및 도 4 참조.
당 알코올은 본 발명의 개선된 방법에 의해 생산된 다양한 헥소스 당으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 만니톨 및 소르비톨이 제조될 수 있으며 현재 의료 및 식품 산업에서 상업적인 관심 대상이다. 이러한 개선된 효소적 방법들의 케토스 또는 알도스 생성물은 수소 가스 또는 수소화붕소나트륨과 같은 환원제를 사용하여 당 알코올 형태로 환원시킬 수 있다. 바람직하게는, 수소 가스는 미국 특허 제6,570,043 B2호; US 8,816,068 B2; 또는 US 5,466,795 A에서 이전에 설명된 바와 같이 환원제로서 사용될 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 알로스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; 사이코스 6-포스페이트 3-에피머라제(P6PE)에 의해 촉매되는 F6P의 사이코스 6-포스페이트(P6P)로의 전환 단계; 알로스 6-포스페이트 이소머라제(A6PI)에 의해 촉매되는 P6P의 알로스 6-포스페이트(A6P)로의 전환 단계; 및 알로스 6-포스페이트 포스파타제(A6PP)에 의해 촉매되는 A6P의 알로스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 만노스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; 만노스 6-포스페이트 이소머라제(M6PI) 또는 포스포글루코스/포스포만노스 이소머라제(PGPMI)에 의해 촉매되는 F6P의 만노스 6-포스페이트(M6P)로의 전환 단계; 및 만노스 6-포스페이트 포스파타제(M6PP)에 의해 촉매되는 M6P의 만노스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 갈락토스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; 프럭토스 6-포스페이트 4-에피머라제(F6PE)에 의해 촉매되는 F6P의 타가토스 6-포스페이트(T6P)로의 전환 단계; 갈락토스 6-포스페이트 이소머라제(Gal6PI)에 의해 촉매되는 T6P의 갈락토스 6-포스페이트(Gal6P)로의 전환 단계; 및 갈락토스 6-포스페이트 포스파타제(Gal6PP)에 의해 촉매되는 Gal6P의 갈락토스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 프럭토스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; 및 프럭토스 6-포스페이트 포스파타제(F6PP)에 의해 촉매되는 F6P의 프럭토스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 알트로스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; P6PE에 의해 촉매되는 F6P의 P6P로의 전환 단계; 알트로스 6-포스페이트 이소머라제(Alt6PI)에 의해 촉매되는 P6P의 알트로스 6-포스페이트(Alt6P)로의 전환 단계; 및 알트로스 6-포스페이트 포스파타제(Alt6PP)에 의해 촉매되는 생성된 Alt6P의 알트로스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 탈로스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P의 T6P로의 전환 단계; 탈로스 6-포스페이트 이소머라제(Tal6PI)에 의해 촉매되는 T6P의 탈로스 6-포스페이트(Tal6P)로의 전환 단계; 및 탈로스 6-포스페이트 포스파타제(Tal6PP)에 의해 촉매되는 Tal6P의 탈로스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 소르보스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P의 T6P로의 전환 단계; 소르보스 6-포스페이트 에피머라제(S6PE)에 의해 촉매되는 T6P의 소르보스 6-포스페이트(S6P)로의 전환 단계; 및 소르보스 6-포스페이트 포스파타제(S6PP)에 의해 촉매되는 S6P의 소르보스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 굴로스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P의 T6P로의 전환 단계; 굴로스 6-포스페이트 이소머라제(Gul6PI)에 의해 촉매되는 S6P의 굴로스 6-포스페이트(Gul6P)로의 전환 단계; 및 굴로스 6-포스페이트 포스파타제(Gul6PP)에 의해 촉매되는 Gul6P의 굴로스로의 전환 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 이도스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 다음의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; F6PE에 의해 촉매되는 F6P의 T6P로의 전환 단계; 소르보스 6-포스페이트 에피머라제(S6PE)에 의해 촉매되는 T6P의 소르보스 6-포스페이트(S6P)로의 전환 단계; 이도스 6-포스페이트 이소머라제(I6PI)에 의해 촉매되는 S6P의 이도스 6-포스페이트(I6P)로의 전환 단계; 및 이도스 6-포스페이트 포스파타제(I6PP)에 의해 촉매되는 I6P의 이도스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 타가토스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; 프럭토스 6-포스페이트 에피머라제(F6PE)에 의해 촉매되는 F6P의 타가토스 6-포스페이트(T6P)로의 전환 단계; 타가토스 6-포스페이트 포스파타제(T6PP)에 의해 촉매되는 T6P의 타가토스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 사이코스의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 포스포글루코이소머라제(PGI)에 의해 촉매되는 G6P의 프럭토스 6-포스페이트(F6P)로의 전환 단계; 사이코스 6-포스페이트 3-에피머라제(P6PE)에 의해 촉매되는 F6P의 사이코스 6-포스페이트(P6P)로의 전환 단계; 사이코스 6-포스페이트 포스파타제(P6PP)에 의해 촉매되는 P6P의 사이코스로의 전환 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 이노시톨의 생산에 관한 것이다. 전분 또는 전분 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 이상으로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; b) 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 αGP에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계; 및 c) 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 4GT에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이 단계. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체가 출발 재료인 경우, 개선은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계이다. 수크로스가 출발 재료인 경우, 개선은 하기의 단계 중 하나 또는 둘 다로부터 선택된다: a) 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 PGM에 의해 촉매되는 G1P의 G6P로의 전환 단계; 및 b) 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 SP에 의해 촉매되는 수크로스의 G1P로의 전환 단계. 상기 방법은 이노시톨 포스페이트 신타제를 사용하여 G6P를 이노시톨 3-포스페이트(I3P)로 전환시키는 단계 및 이노시톨 모노포스파타제를 사용하여 I3P를 이노시톨로 전환시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 개선된 방법은 수크로스로부터 이노시톨의 생산에 관한 것이다.
도 1은 수크로스를 G6P 중간체로 전환시키기 위한 효소적 경로를 도시한다. 본 발명의 개선된 방법은 하기의 개선 중 하나 이상을 함유한다: SP는 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, PGM은 적어도 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 방법에서, SP는 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직한 방법에서, SP는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하고, PGM은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
도 2는 전분 유도체 말토덱스트린을 G6P 중간체로 전환시키는 효소적 경로를 나타내는 개략도이다. 하기의 약어가 사용된다: IA, 이소아밀라제; PA, 풀루라나제; αGP, 알파-글루칸 포스포릴라제 또는 전분 포스포릴라제; 4GT, 4-글루칸 트랜스퍼라제; 및 PGM, 포스포글루코뮤타제. 본 발명의 개선된 방법은 하기의 개선 중 하나 이상을 함유한다: PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; αGP는 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 4GT는 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 방법에서, PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, αGP는 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 4GT는 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 보다 바람직한 방법에서, PGM은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, αGP는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 4GT는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.
도 3은 셀룰로스를 G6P 중간체로 전환시키기 위한 효소적 경로를 도시한다. 본 발명의 개선된 방법에서, PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, PGM은 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, PGM은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다. 헥소스 생산을 위한 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계 중 하나 이상은 단일 반응 용기에서 수행된다. 본 발명의 다른 개선된 방법에서, 방법 단계는 하나 초과의 반응 용기에서 수행된다. 이어서, 헥소스 포스페이트의 탈인산화에 의해 생성된 포스페이트 이온은 특히, 모든 방법 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때 전분 유도체를 G1P로 전환시키는 방법 단계에서 재활용될 수 있다. 포스페이트를 재활용하는 능력은 비-화학양론적 양의 포스페이트가 사용될 수 있도록 하여 반응 포스페이트 농도를 낮게 유지시킨다. 이는 전체 경로와 방법의 전체 속도에 영향을 주지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고 헥소스 제조 방법의 전체 효율성을 가능하게 한다.
헥소스 생산을 위한 본 발명의 개선된 방법에서, 방법 단계는 약 0.1 mM 내지 약 150 mM의 포스페이트 농도에서 ATP-무함유, NAD(P)(H)-무함유로 수행되고/되거나, 포스페이트는 재활용되고/되거나 헥소스 포스페이트의 탈인산화 단계는 에너지면에서 유리한 화학 반응을 포함한다. 본 발명의 일부 개선된 방법에서, 방법 단계는 하기의 방법 조건: 약 37℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도에서, 약 5.0 내지 약 8.0 범위의 pH에서, 또는 약 0.5시간 내지 약 48시간 동안 중 적어도 하나에서 수행되거나 연속 공정으로서 수행된다.
예를 들어, 각각의 방법에서 반응 포스페이트 농도는 약 0 mM 내지 약 300 mM, 약 0.1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 50 mM 또는 보다 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 50 mM이다. 예를 들어, 각각의 방법에서 반응 포스페이트 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM 또는 약 55 mM일 수 있다. 낮은 포스페이트 농도는 낮은 총 포스페이트로 인해 생산 비용을 감소시키고 이에 따라 포스페이트 제거 비용을 저하시킨다. 이는 또한 고 농도의 유리 포스페이트에 의한 방법의 포스파타제 또는 기타 효소 억제를 방지하고 포스페이트 오염 가능성을 감소시킨다.
더욱이, 본원에 개시된 각각의 방법은 포스페이트 공급원으로서 ATP 첨가 없이, 즉 ATP-무함유로 수행될 수 있다. 각각의 방법은 또한 NAD(P)(H)를 첨가하지 않고, 즉 NAD(P)(H)-무함유로 수행될 수 있다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 생물학적으로 양립가능한 완충제, 예컨대 HEPES, PBS, BIS-TRIS, MOPS, DIPSO, 트리즈마(Trizma) 등이 본 발명의 각각의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법을 위한 반응 완충제는 5.0 내지 8.0 범위의 pH를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 반응 완충제 pH는 약 6.0 내지 약 7.3 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 완충제 pH는 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2 또는 7.3일 수 있다.
반응 완충제는 또한 2가 금속 양이온을 함유할 수 있다. 일부 방법에서, 단계는 Mn2+, Zn2+, Ca2+, Co2+, Mn2+ 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 2가 금속 양이온의 존재 하에 수행된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 원하는 금속 양이온을 도입하기 위해 적합한 염이 사용될 수 있다.
본 발명의 각각의 방법에서, 방법 단계가 수행되는 반응 온도는 37℃ 내지 약 85℃ 범위일 수 있다. 보다 바람직하게는, 단계는 약 40℃ 내지 약 80℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 온도는 예를 들어 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃ 또는 약 85℃일 수 있다. 바람직하게는, 반응 온도는 약 40 ℃, 약 45℃, 약 50 ℃, 약 55℃, 약 60℃ 또는 약 65℃이다. 보다 바람직하게는, 반응 온도는 약 약 50℃ 내지 약 55℃ 범위이다.
본 발명의 개선된 방법 중 일부의 경우, 반응 시간은 필요에 따라 조정될 수 있으며 약 0.5시간 내지 약 48시간 범위일 수 있다. 예를 들어, 반응 시간은 약 1 시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 26시간, 약 28시간, 약 30시간, 약 32시간, 약 34시간, 약 36시간, 약 38시간, 약 40시간, 약 42시간, 약 44시간, 약 46시간 또는 약 48시간일 수 있다. 보다 바람직하게는, 반응 시간은 약 24시간이다.
방법은 또한 정해진 시간 제한 없이 하나 이상의 반응기에서 연속 공정으로서 수행될 수 있다. 예를 들어, 연속 공정에서, 용액 말토덱스트린은 용액이 하류 공정을 위해 하나 이상의 컬럼을 떠날 때 타가토스로의 전환이 완료될 수 있는 속도에서 고정된 효소 층을 통해 펌핑된다. 예를 들어, 말토덱스트린이 컬럼을 떠날 때 최대 타가토스 수율이 달성되도록 200 g/L의 말토덱스트린이 고정된 효소(예를 들어, 50℃에서 유지됨)로 충전된 컬럼을 통해 펌핑될 수 있다. 이러한 방법론은 회분식 방법에 비해 더 큰 용적 생산성을 제공한다. 이는 생성물이 컬럼 및 반응 조건과 접촉하는 시간을 제한하여 생성물 분해(예를 들어, 잠재적인 하이드록시메틸푸르푸랄 형성) 가능성을 감소시킨다. 이는 또한 생산의 자동화를 증가시키고 이에 따라 운용 비용을 절감시킨다.
본 발명의 단계에 사용되는 효소는 가용성, 고정된, 조립된, 포획된 또는 응집된 단백질의 형태를 취할 수 있다. 이들 효소는, 당업계에 공지된 바와 같이, 기능성을 개선하기 위해 통상적으로 사용되는 불용성 유기 또는 무기 지지체에 흡착될 수 있다. 여기에는 아가로스, 메타크릴레이트, 폴리스티렌 또는 덱스트란과 같은 중합체 지지체뿐만 아니라, 유리, 금속 또는 탄소계 재료와 같은 무기 지지체가 포함된다. 이들 재료는 종종 고정된 효소의 부착 및 활성을 촉진하는 큰 표면-대-용적 비 및 특수화된 표면을 갖도록 생산된다. 효소는 공유, 이온성 또는 소수성 상호작용을 통해 이들 고체 지지체에 부착될 수 있다. 효소는 또한 고체 지지체에 대한 친화도를 갖는 다른 단백질 또는 펩티드 서열, 가장 흔히 폴리히스티딘 서열에 대한 공유 융합과 같은 유전적으로 조작된 상호작용을 통해 부착될 수 있다. 효소는 표면 또는 표면 코팅에 직접 부착되거나, 표면 또는 표면 코팅에 이미 존재하는 다른 단백질에 부착될 수 있다. 효소는 모두 하나의 담체, 개별 담체, 또는 둘의 조합(예를 들어, 담체당 2종의 효소라면, 이들 담체를 혼합한다)에 고정될 수 있다. 이러한 변동은 균일하게 또는 정의된 층에서 혼합되어 연속 공정에서의 회전율을 최적화할 수 있다. 예를 들어, 반응기의 시작부는 높은 초기 G1P 증가를 보장하기 위해 αGP 층을 가질 수 있다. 효소는 모두 하나의 담체, 개별 담체 또는 군(group)에 고정될 수 있다. 이들 효소는 균일하게 또는 정의된 층 또는 구역에서 혼합되어 회전율을 최적화할 수 있다.
본 발명에 따른 각각의 방법은 전체 반응 동안의 매우 유리한 평형 상수로 인해 높은 수율을 달성할 수 있다. 이론적으로, 출발 재료가 인산화된 중간체로 완전히 전환되면, 최대 99% 수율이 달성될 수 있다.
본 발명의 방법은 저가의 출발 재료를 사용하고 공급원료 및 생성물 분리와 관련된 비용을 감소시킴으로써 생산 비용을 절감시킨다. 전분 및 이의 유도체는 예를 들어 락토스보다 덜 비싼 공급원료이다. 헥소스가 락토스로부터 생산될 때, 글루코스와 기타 헥소스(들)은 크로마토그래피를 통해 분리되고 이는 더 높은 생산 비용을 초래한다. 또한, 포스파타제에 의한 헥소스 탈인산화 단계는 공급원료에 관계 없이 비가역적인 포스파타제 반응이다. 따라서, 후속적인 생성물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서 헥소스가 매우 높은 수율로 생산된다.
본 발명에 따른 방법은 헥소스의 용이한 회수를 가능하게 하고 분리 비용을 최소화한다. 본 발명의 일부 바람직한 방법에서, 원하는 헥소스의 회수는 크로마토그래피 분리 없이 수행된다. 연속 반응으로 헥소스가 생산된 후, 생성물은 대신에 미세여과, 이온 교환(양이온 후에 음이온, 연마를 위한 가능한 혼합층), 농축, 결정화, 결정 단리 및 건조를 거친다. 헥소스의 높은 수율로 인해, 결정화 단계는 모두 헥소스를 정제하는 데 필요한 것이다. 결정화 전에 헥소스를 추가 정제하기 위해, 나노여과를 사용하여, 결정화 과정에서 효소가 존재할 위험을 제거하고 헥소스와 공결정화할 수 있거나 모액의 재활용성을 제한할 수 있는 미전환된 덱스트린(말토덱스트린, 말토테트라오스, 말토트리오스, 말토스 등)을 제거할 수 있다.
본 발명의 개선된 방법은 또한 수크로스, 전분 또는 전분 유도체, 또는 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체로부터 G6P를 생산하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법으로부터 생산된 G6P는, 예를 들어, 크로마토그래피와 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 단리 및 정제될 수 있다.
실시예
하기의 실시예는 더 높은 활성을 갖는 효소를 사용하는 개선된 방법을 설명한다.
재료 및 방법
글루코스 1-포스페이트, 염화마그네슘, 말토덱스트린 DE 4-7, 인산나트륨(일염기성 및 이염기성)을 포함하는 모든 화학물질은 달리 언급하지 않는 한, 시약 등급 이상이며 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트루이스) 또는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(미국 펜실베니아주 피츠버그)로부터 구매하였다. 말토트리오스는 카보신스(Carbosynth)(영국 버크셔)로부터 구매하였다. 이. 콜라이(E. coli) BL21(DE3)(시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스)를 재조합 단백질 발현을 위한 숙주 세포로서 사용하였다. 50 mg L-1 카나마이신을 포함하는 ZYM-5052 배지를 이. 콜라이 세포 성장 및 재조합 단백질 발현을 위해 사용하였다.
재조합 효소의 생산 및 정제
단백질 발현 플라스미드(pET28a)를 보유하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주를 50 mg L-1 카나마이신을 함유하는 100 mL의 ZYM-5052 배지를 갖는 1-L 에를렌마이어 플라스크에서 항온배양하였다. 세포를 16 내지 24시간 동안 220 rpm에서 회전 진탕하면서 30℃에서 성장시켰다. 세포를 12℃에서 원심분리하여 수거하고 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸(Ni 정제)을 함유하는 20 mM HEPES(pH 7.5)를 함유하는 20 mM HEPES(pH 7.5)로 1회 세척하였다. 세포 펠릿을 동일한 완충제에 재현탁하고 초음파 처리에 의해 용해시켰다. 원심분리 후, 상청액 중의 표적 단백질을 표준 방법을 통해 정제하였다. His-태그 부착된 단백질을 이미 설명한 완충제 중의 이미다졸 증가 구배를 사용하여 프로피니티(Profinity) IMAC Ni-충전된 수지(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘리즈)에 의해 정제하였다. 재조합 단백질의 순도는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 조사하였다.
실시예 1. 더 높은 활성 PGM을 사용하는 개선된 방법.
다양한 포스포글루코뮤타제(PGM)를 단리하고 다단계 효소 반응에서 G1P의 G6P로의 전환에 대해 분석하였다. 각 PGM의 상대적 활성을 하기의 방식으로 측정하였다. 50 mM HEPES pH 7.2, 5 mM MgCl2, 50 mM 글루코스 1-포스페이트, 0.02 g/L PGM, 0.1 g/L PGI 및 0.1 g/L F6PP의 반응물을 제조하고 50℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 비바스핀 2(Vivaspin 2) 농축기(10,000 MWCO)를 이용한 효소의 여과를 통해 반응을 중단시켰다. 생성물 프럭토스를 Hi-Plex H+ 컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하여 평가하였다. 샘플을 65℃에서 15.5분 동안 0.6 mL/분으로 5 mM H2SO4 중에서 흐르게 하였다. 30분 동안 제조된 프럭토스의 양을 사용하여 효소적 방법에서 각 PGM의 상대적 효율을 결정하였다. 활성의 증가는 프럭토스 피크 면적과 피크 높이의 증가의 평균을 사용하여 결정하였다.
도 19는 다양한 PGM의 활성을 나타내는 크로마토그램이다. 크로마토그램은 다양한 PGM, 과량의 포스포글루코이소머라제 및 과량의 프럭토스 6-포스페이트 포스파타제와 함께 항온배양한 후 글루코스 1-포스페이트로부터 제조된 프럭토스 수준을 나타낸다. PGM은 캐스케이드(cascade)의 제한 효소이다. 표 1은 본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 PGM이 이전에 개시된 서모코쿠스 코다카라엔시스 유래의 PGM(Uniprot ID Q68BJ6)에 비해 개선된 활성을 가짐을 보여준다. 국제 특허출원공개 WO2017/059278 참조.
PGM의 상대적 활성
PGM Uniprot ID
서열번호		 참조 PGM와 비교한 활성%
(참조)
Q68BJ6
서열번호 1		 100
A0A023CRS6
서열번호 2		 800
A0A150LLZ1
서열번호 3		 2000
UPI0001D17AE3 (UniParc ID)
서열번호 4 		2200
A0A023DI95
서열번호 5		 2080
R7RR04
서열번호 6		 5200
E8N4Y6
서열번호 7		 5900
A0A0P6YKY9
서열번호 8 		6600
실시예 2. 더 높은 활성 αGP를 사용하는 개선된 방법.
각 αGP의 상대적 활성을 하기의 방식으로 측정하였다. 25mM 인산나트륨 pH 7.2, 5mM MgCl2, 20 g/L 말토덱스트린 DE 4-7, 9㎍의 αGP 및 0.1 g/L PGM의 200 ㎕ 반응물을 제조하고 50℃에서 항온배양하였다. 샘플을 다양한 시점에서 1.5 mM NAD+ 및 3 U/mL 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제와 혼합하였다. 각 시점에서 340 nm에서의 흡광도를 사용하여 반응 속도를 얻었다. 상기 속도를 사용하여 각 αGP의 특이적 활성을 확인하고, 이를 상대적 활성 비교를 위해 사용하였다.
표 2는 본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 αGP가 이전에 개시된 서모토가 마리티마 유래의 αGP(Uniprot ID G4FEH8)에 비해 개선된 활성을 가짐을 보여준다. 국제 특허출원공개 WO2017/059278 참조.
αGP의 상대적 활성
αGP Uniprot ID
서열번호		 참조 αGP와 비교한 활성%
(참조)
G4FEH8
서열번호 9		 100
Q5SJ42
서열번호 10		 171
G8NCC0
서열번호 11		 286
B0K7V8
서열번호 12		 228
D1B926
서열번호 13		 211
실시예 3. 더 높은 활성 4GT를 사용하는 개선된 방법.
각 4GT의 상대적 활성을 하기의 방식으로 측정하였다. 50 mM 인산나트륨 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 20 g/L 말토트리오스 및 9㎍의 4GT의 200 ㎕ 반응물을 제조하고 50℃에서 항온배양하였다. 샘플을 다양한 시점에서 1.5 mM NAD+, 1 mM ATP, 1 U/mL 헥소키나제 및 1 U/mL 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제와 혼합하였다. 각 시점에서 340nm에서의 흡광도를 사용하여 반응 속도를 얻었다. 상기 속도를 사용하여 각 4GT의 특이적 활성을 확인하고, 이를 상대적 활성 비교를 위해 사용하였다.
표 3은 본 발명의 개선된 방법에 사용하기 위한 4GT가 이전에 개시된 서모코쿠스 리토랄리스 유래의 4GT(Uniprot ID 032462)에 비해 개선된 활성을 가짐을 보여준다. 국제 특허출원공개 WO2018/169957 참조.
4GT의 상대적 활성
4GT Uniprot ID
서열번호		 참조 4GT와 비교한 활성%
(참조)
O32462
서열번호 14		 100
E4U8S9
서열번호 15		 228
D7BF07
서열번호 16		 312
E8MXP8
서열번호 17		 284
실시예 4. 더 높은 활성 SP를 사용하는 개선된 방법.
Uniprot ID D9TT09에 대한 상동성에 의해 추정되는 다양한 수크로스 포스포릴라제(Verhaeghe et al. The quest for a thermostable sucrose phosphorylase reveals sucrose 6'-phosphate phosphorylase as a novel specificity. Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Aug;98(16):7027-37)를 단리하고 수크로스의 글루코스 6-포스페이트로의 전환에 대해 분석하였다.
각 SP의 상대적 활성을 하기의 방식으로 측정하였다. 25 mM 인산나트륨 pH 7.2, 5mM MgCl2, 200 g/L 수크로스, 0.15 g/L SP, 0.1 g/L PGM, 0.1 g/L PGI 및 0.3 g/L F6PP의 반응물을 제조하고 50℃에서 항온배양하였다. 샘플을 0시간 2시간, 6시간 및 8시간에 채취하였다. 비바스핀 2 농축기(10,000 MWCO)를 이용한 효소의 여과를 통해 반응을 중단시켰다. 생성물 프럭토스를 Supel Cogel Pb 컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하여 평가하였다. 샘플을 80℃에서 25분 동안 0.6 mL/분으로 초순수 중에서 흐르게 하였다. 2시간차에 제조된 프럭토스의 양을 사용하여 각 SP의 상대적 활성을 결정하였다. 6시간차에 제조된 프럭토스의 양(8시간차에 완료가 검증됨)은 각 SP에 대해 달성 가능한 최대 수율의 차이를 나타낸다.
수크로스의 프럭토스로의 완전한 전환에 대한 효과를 또한 조사하였다. 참조(하기 표)와 비교하여 시험된 8종의 효소 중 7종은 Uniprot ID D9TT09에 비해 개선된 활성을 나타내고, 1종은 수크로스로부터 프럭토스를 제조할 때 예상치 못한 이점을 나타낸다. 도 18은 Uniprot ID D9TT09(참조 SP)와 Uniprot ID F6BJS0을 비교하는 수크로스 포스포릴라제 활성의 크로마토그램을 도시한다. 2시간차에, 더 높은 활성 SP는 참조 SP의 프럭토스 양의 약 150%를 생성한다. 하단 크로마토그램은 최대 수율 측면에서 Uniprot ID D9TT09(참조 SP)와 Uniprot ID F6BJS0을 비교한다. 6시간차(두 반응 모두에 대한 최대 수율)에, 더 높은 활성 SP는 참조 SP의 프럭토스 양의 약 130%를 생성한다. 흥미롭게도, 상대적 수율은 상대적 활성과 직접적인 상관관계가 없다. 아마도, 기여 요인은 프럭토스에 의한 수크로스 포스포릴라제의 생성물 억제, 역반응 속도(G1P + 프럭토스 ↔ 수크로스 + Pi) 및 보다 광범위하게는 반응 후기 단계에서의 프럭토스 형성과 프럭토스 분해 사이의 평형을 포함할 것이다. 서열번호 26에 표시된 아미노산 서열을 갖는, 서만에어로트릭스 닥센시스 유래의 비교용 SP(Uniprot ID A0A0N8GPZ6)는 이전에 개시된 SP에 비해 낮은 상대적 활성 및 낮은 최대 프럭토스 수율을 나타냈다.
SP의 상대적 활성 및 달성 가능한 수율
SP Uniprot ID
서열번호		 참조 SP와 비교한 활성% 참조 SP와 비교한 최대 프럭토스 수율%
(참조)
D9TT09
서열번호 18		 100 100
A0A1X2FWC2
서열번호 19		 111 109
L0IL15
서열번호 20		 150 101
F6BJS0
서열번호 21		 149 132
A0A1Y3Q6Q6
서열번호 22		 150 103
Q84HQ2
서열번호 23		 131 137
A0A388NK91
서열번호 24		 122 119
A0A135L6L9
서열번호 25		 144 116
(비교)
A0A0N8GPZ6
서열번호 26		 92 71
실시예 5. G6P의 개선된 효소적 생산.
효소 활성의 개선을 가시화하기 위해, 이전에 개시된 αGP(Uniprot ID G4FEH8) 및 PGM(Uniprot ID Q68BJ6)을 사용하여 말토덱스트린의 G6P로의 전환을 수행하고, 그 과정을 더 높은 활성을 갖는 αGP(Uniprot ID D1B926) 및 PGM(Uniprot ID A0A150LLZ1)를 사용하는 방법과 비교하였다. 20 g/L 말토덱스트린 DE 5, 50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 0.05 g/L αGP 및 0.005 g/L PGM을 함유하는 200㎕ 반응 혼합물을 50℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 비바스핀 2 농축기(30,000 MWCO)를 이용한 효소의 여과를 통해 반응을 중단시키고 Agilent Hi-Plex H-컬럼 및 굴절률 검출기를 사용하여 HPLC(Agilent 1100 시리즈)를 통해 분석하였다. 샘플을 65℃에서 15.5분 동안 0.6 mL/분으로 5 mM H2SO4 중에서 흐르게 하였다. 없음(void), 말토덱스트린 및 G6P에 대한 피크들이 너무 가까워 임의의 개별 성분을 신뢰성 있게 정량할 수 없기 때문에(도 17) 결과를 정량하지 않았지만, 효소 αGP(Uniprot ID D1B926) 및 PGM(Uniprot ID A0A150LLZ1) 사용시 명백히 훨씬 더 많은 G6P가 생성된다.
SEQUENCE LISTING <110> Bonumose LLC <120> Enzymatic Production of Hexoses <130> 146.0010-WO00 <150> 62/752,061 <151> 2018-10-29 <150> 62/857,543 <151> 2019-06-05 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Thermococcus kodakaraensis <400> 1 Met Gly Lys Leu Phe Gly Thr Phe Gly Val Arg Gly Ile Ala Asn Glu 1 5 10 15 Glu Ile Thr Pro Glu Phe Ala Leu Lys Ile Gly Met Ala Phe Gly Thr 20 25 30 Leu Leu Lys Arg Glu Gly Arg Glu Arg Pro Leu Val Val Val Gly Arg 35 40 45 Asp Thr Arg Val Ser Gly Glu Met Leu Lys Asp Ala Leu Ile Ser Gly 50 55 60 Leu Leu Ser Thr Gly Cys Asp Val Ile Asp Val Gly Ile Ala Pro Thr 65 70 75 80 Pro Ala Ile Gln Trp Ala Thr Asn His Phe Asn Ala Asp Gly Gly Ala 85 90 95 Val Ile Thr Ala Ser His Asn Pro Pro Glu Tyr Asn Gly Ile Lys Leu 100 105 110 Leu Glu Pro Asn Gly Met Gly Leu Lys Lys Glu Arg Glu Ala Ile Val 115 120 125 Glu Glu Leu Phe Phe Ser Glu Asp Phe His Arg Ala Lys Trp Asn Glu 130 135 140 Ile Gly Glu Leu Arg Lys Glu Asp Ile Ile Lys Pro Tyr Ile Glu Ala 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Lys Thr Leu Ala Thr His 100 105 110 Gly Ile Gln Thr Tyr Val Phe Asp Glu Leu Arg Pro Thr Pro Glu Leu 115 120 125 Ser Phe Ala Val Arg Tyr Leu His Ala Phe Ser Gly Ile Val Ile Thr 130 135 140 Ala Ser His Asn Pro Pro Glu Tyr Asn Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Glu 145 150 155 160 Asp Gly Gly Gln Leu Pro Pro Glu Thr Ala Asp Ala Val Ile Arg Tyr 165 170 175 Val Asn Glu Val Glu Asn Glu Leu Asp Ile His Val Glu Asp Glu Ala 180 185 190 Ile Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ile Gln Ile Ile Gly Glu Glu Val Asp 195 200 205 Asn Ala Tyr Ile Glu Ala Val Lys Thr Val Ser Leu Gln Pro Lys Leu 210 215 220 Ala Glu Glu Val Asp Ile Asn Ile Val Phe Thr Pro Leu His Gly Thr 225 230 235 240 Ser Asn Lys Pro Val Arg Arg Ala Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Arg Asn 245 250 255 Val Phe Val Val Lys Glu Gln Glu Gln Pro Asp Pro Asn Phe Ser Thr 260 265 270 Val Ala Ser Pro Asn Pro Glu Glu His Ala Ala Phe Ala Leu Ala Ile 275 280 285 Glu Leu Gly Lys Gln Val Asn Ala Asp Leu Leu Ile Ala Thr Asp Pro 290 295 300 Asp Ala Asp Arg Leu Gly Ile Ala Val Lys Asn Glu Gln Gly Glu Tyr 305 310 315 320 Ile Val Leu Thr Gly Asn Gln Thr Gly Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Leu 325 330 335 Leu Ser Gln Lys Lys Glu Lys Gly Ile Leu Pro Glu Asn Gly Val Val 340 345 350 Leu Lys Thr Ile Val Thr Ser Glu Phe Gly Arg Val Ile Ala Gln Ser 355 360 365 Phe Gly Leu Asp Thr Val Asp Thr Leu Thr Gly Phe Lys Phe Ile Gly 370 375 380 Glu Lys Ile Lys Glu Tyr Glu Gln Thr Gly Gln Tyr Thr Phe Gln Phe 385 390 395 400 Gly Tyr Glu Glu Ser Tyr Gly Tyr Leu Ile Gly Asp Phe Ala Arg Asp 405 410 415 Lys Asp Ala Val Gln Ala Ala Val Leu Ala Ala Glu Val Cys Ala Phe 420 425 430 Tyr Lys Lys Gln Gly Met Ser Leu Tyr Glu Gly Leu Ile Gln Leu Phe 435 440 445 Asp Gln Tyr Gly Tyr Tyr Arg Glu Gly Gln Gln Ser Leu Thr Leu Lys 450 455 460 Gly Lys Glu Gly Ala Glu Thr Ile Gln Ala Ile Leu Thr Ser Phe Arg 465 470 475 480 Asn Glu Pro Pro Thr Glu Val Ala Gly Lys Lys Val Thr Val Ile Glu 485 490 495 Asp Tyr Lys Thr Lys Glu Arg Ile His Thr Leu Thr Gly Glu Lys Thr 500 505 510 Val Ile Thr Leu Pro Thr Ser Asn Val Leu Lys Tyr Val Leu Glu Asp 515 520 525 Asp Ser Trp Phe Cys Leu Arg Pro Ser Gly Thr Glu Pro Lys Ile Lys 530 535 540 Val Tyr Phe Gly Val Lys Gly Gln Ser Leu Ala Asp Ser Glu Ala Lys 545 550 555 560 Leu Gln Gln Leu Ser Asp Ala Val Met Lys Arg Val His Asp Phe Leu 565 570 575 Arg Thr Ala Ser Leu Ser 580 <210> 3 <211> 581 <212> PRT <213> Caldibacillus debilis <400> 3 Met Glu Trp Lys Gln Arg Ala Glu Arg Trp Leu Arg Phe Glu Asn Leu 1 5 10 15 Asp Pro Glu Leu Lys Lys Gln Leu Glu Glu Met Ala Lys Asp Glu Lys 20 25 30 Lys Leu Glu Asp Leu Phe Tyr Lys Tyr Leu Glu Phe Gly Thr Gly Gly 35 40 45 Met Arg Gly Glu Ile Gly Pro Gly Thr Asn Arg Ile Asn Ile Tyr Thr 50 55 60 Val Arg Lys Ala Ser Glu Gly Leu Ala Arg Phe Leu Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Gly Glu Glu Lys Ala Lys Gln Gly Val Val Ile Ala Tyr Asp Ser Arg 85 90 95 Arg Lys Ser Arg Glu Phe Ala Leu Glu Thr Ala Lys Thr Val Gly Lys 100 105 110 His Gly Ile Lys Ala Tyr Val Phe Glu Ser Leu Arg Pro Thr Pro Glu 115 120 125 Leu Ser Phe Ala Val Arg Tyr Leu His Ala Ala Ala 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Leu Val Arg Asn 340 345 350 Ser Ala Val Leu Lys Thr Ile Val Thr Ser Glu Leu Gly Arg Ala Ile 355 360 365 Ala Ser Asp Phe Gly Val Glu Thr Ile Asp Thr Leu Thr Gly Phe Lys 370 375 380 Phe Ile Gly Glu Lys Ile Lys Glu Phe Lys Glu Thr Gly Ser His Val 385 390 395 400 Phe Gln Phe Gly Tyr Glu Glu Ser Tyr Gly Tyr Leu Ile Gly Asp Phe 405 410 415 Val Arg Asp Lys Asp Ala Ile Gln Ala Ala Leu Phe Ala Ala Glu Ala 420 425 430 Ala Ala Tyr Tyr Lys Ala Gln Gly Lys Ser Leu Tyr Asp Val Leu Met 435 440 445 Glu Ile Tyr Lys Lys Tyr Gly Phe Tyr Lys Glu Ser Leu Arg Ser Ile 450 455 460 Thr Leu Lys Gly Lys Asp Gly Ala Glu Lys Ile Arg Ala Ile Met Asp 465 470 475 480 Ala Phe Arg Gln Asn Pro Pro Glu Glu Val Ser Gly Ile Pro Val Ala 485 490 495 Ile Thr Glu Asp Tyr Leu Thr Gln Lys Arg Val Asp Lys Ala Ala Gly 500 505 510 Gln Thr Thr Pro Ile His Leu Pro Lys Ser Asn Val Leu Lys Tyr Tyr 515 520 525 Leu Ala Asp Glu Ser Trp Phe Cys Ile Arg Pro Ser Gly Thr Glu Pro 530 535 540 Lys Cys Lys Phe Tyr Phe Ala Val Arg Gly Asp Ser Glu 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Val Ile Arg Tyr 165 170 175 Val Asn Glu Val Glu Asn Glu Leu Glu Ile Asp Val Glu Glu Glu Ala 180 185 190 Val Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ile Gln Met Ile Gly Glu Glu Val Asp 195 200 205 Asn Ala Tyr Ile Asp Ala Val Lys Thr Ile Ser Phe Gln Pro Lys Leu 210 215 220 Ala Glu Glu Thr Asp Val Asn Ile Val Phe Thr Pro Leu His Gly Thr 225 230 235 240 Ser Asn Lys Pro Ile Arg Arg Ala Leu Thr Glu Leu Gly Tyr Arg His 245 250 255 Val Phe Val Val Glu Glu Gln Glu His Pro Asp Pro Asn Phe Ser Thr 260 265 270 Val Ser Ser Pro Asn Pro Glu Glu His Ala Ala Phe Ala Leu Ala Ile 275 280 285 Glu Leu Gly Lys Lys Val Asn Ala Asp Leu Leu Ile Ala Thr Asp Pro 290 295 300 Asp Ala Asp Arg Leu Gly Ile Ala Val Lys Asn Asp Lys Gly Asp Tyr 305 310 315 320 Ile Val Leu Thr Gly Asn Gln Thr Gly Gly Leu Leu Leu His Tyr Leu 325 330 335 Leu Ser Gln Lys Lys Glu Lys Gly Ile Leu Pro Glu Asn Gly Val Val 340 345 350 Leu Lys Thr Ile Val Thr Ser Glu Phe Gly Arg Ala Ile Ala Gln Ser 355 360 365 Phe Gly Leu Asp Thr Val Asp Thr Leu Thr Gly Phe Lys Phe Ile Gly 370 375 380 Glu Lys Ile Lys Glu Tyr Glu Gln Thr Gly Gln Tyr Thr Phe Gln Phe 385 390 395 400 Gly Tyr Glu Glu Ser Tyr Gly Tyr Leu Ile Gly Asp Phe Val Arg Asp 405 410 415 Lys Asp Ala Val Gln Ala Ala Val Leu Ala Ala Glu Val Cys Ala Phe 420 425 430 Tyr Lys Lys His Gly Met Ser Leu Tyr Glu Gly Leu Leu Arg Leu Phe 435 440 445 Asp Gln Tyr Gly Tyr Tyr Arg Glu Gly Gln Gln Ser Leu Thr Leu Lys 450 455 460 Gly Lys Lys Gly Ser Glu Thr Ile Gln Ala Ile Leu Thr Ser Phe Arg 465 470 475 480 His Glu Pro Pro Thr Glu Val Ala Gly Lys Lys Val Ile Val Ile Glu 485 490 495 Asp Tyr Lys Thr Lys Glu Arg Val Asn Thr Ala Thr Gly Glu Lys Thr 500 505 510 Leu Ile Ala Leu Pro Thr Ser Asp Val Leu Lys Tyr Val Leu Glu Asp 515 520 525 Asp Ser Trp Phe Cys Leu Arg Pro Ser Gly Thr Glu Pro Lys Leu Lys 530 535 540 Val Tyr Phe Gly Val Lys Gly Glu Ser Leu Ser Asp Ser Glu Ala Lys 545 550 555 560 Leu Gln Gln Leu Ser Asp Thr Val Met Glu Arg Val Arg Gly Phe Leu 565 570 575 Asn Thr Ala Ser Pro Phe Gln Pro 580 <210> 5 <211> 582 <212> PRT <213> Parageobacillus caldoxylosilyticus NBRC 107762 <400> 5 Met Asp Trp Lys Ser Lys Tyr Glu Gln Trp Met Ala Tyr Glu Gln Leu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Leu Lys Arg Leu Leu Gln Asp Arg Gln Asp Asp Leu Lys 20 25 30 Trp Val Glu Asp Gly Phe Tyr Lys Asn Leu Glu Phe Gly Thr Gly Gly 35 40 45 Met Arg Gly Glu Ile Gly Pro Gly Thr Asn Arg Met Asn Ile Tyr Thr 50 55 60 Val Arg Lys Ala Ser Glu Gly Leu Ala Arg Tyr Ile Glu Ser Phe Gly 65 70 75 80 Glu Glu Ala Lys Lys Arg Gly Val Val Ile Ala Tyr Asp Ser Arg His 85 90 95 Lys Ser Arg Asp Phe Ala Met Glu Ala Ala Lys Thr Leu Ala Thr His 100 105 110 Gly Ile Gln Thr Tyr Val Phe Asp Glu Leu Arg Pro Thr Pro Glu Leu 115 120 125 Ser Phe Ala Val Arg Tyr Leu Gln Ala Phe Ser Gly Ile Val Ile Thr 130 135 140 Ala Ser His Asn Pro Pro Glu Tyr Asn Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Glu 145 150 155 160 Asp Gly Gly Gln Leu Pro Pro Asp Thr Ala Asp Ala Val Ile Arg Tyr 165 170 175 Val Asn Glu Val Ala Asn Glu Leu Asp Ile His Val Glu Asp Glu Ala 180 185 190 Ile Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ile Gln Ile Ile Gly Glu Glu Val Asp 195 200 205 Asn Ala Tyr Ile Asp Ala Val Lys Thr Ile Ser Leu Gln Pro Lys Leu 210 215 220 Ala Glu Glu Val Asp Ile Asn Ile Val Phe Thr Pro Leu His Gly Thr 225 230 235 240 Ser Asn Lys Pro Val Arg Arg Ala Leu Lys Glu Leu Gly Tyr Arg Asn 245 250 255 Val Phe Val Val Lys Glu Gln Glu Gln Pro Asp Pro Asn Phe Ser Thr 260 265 270 Val Ala Ser Pro Asn Pro Glu Glu His Ala Ala Phe Ala Leu Ala Ile 275 280 285 Glu Leu Gly Lys Lys Val Asn Ala Asp Leu Leu Ile Ala Thr Asp Pro 290 295 300 Asp Ala Asp Arg Leu Gly Val Ala Val Lys Asn Asp Gln Gly Glu Tyr 305 310 315 320 Val Val Leu Thr Gly Asn Gln Thr Gly Ala Leu Leu Leu His Tyr Leu 325 330 335 Leu Ser Gln Arg Lys Glu Lys Glu Ile Leu Pro Glu Asn Gly Val Val 340 345 350 Leu Lys Thr Ile Val Thr Ser Glu Phe Gly Arg Ala Ile Ala Gln Ser 355 360 365 Phe Gly Leu Glu Thr Val Asp Thr Leu Thr Gly Phe Lys Phe Ile Gly 370 375 380 Glu Lys Ile Lys Glu Tyr Glu Gln Thr Gly Gln Tyr Thr Phe Gln Phe 385 390 395 400 Gly Tyr Glu Glu Ser Tyr 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Tyr Lys 325 330 335 Ser Glu Asp Gly Phe Asp Val His Gln Ile Gly Cys Thr Tyr Tyr Ser 340 345 350 Ala Leu Asn Cys Asp Asp Asp Ala Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Ile Gln 355 360 365 Phe Phe Thr Pro Gly Ile Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala 370 375 380 Gly Val Asn Asp Phe Glu Ala Val Lys Lys Thr Lys Glu Gly Arg Glu 385 390 395 400 Ile Asn Arg His Asn Tyr Gly Leu Lys Glu Ile Glu Glu Ser Val Gln 405 410 415 Lys Lys Ala Val Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Arg Phe Arg Asn Glu 420 425 430 Tyr Glu Ala Phe Asn Gly Glu Phe Met Val Gln Asp Cys Gln Lys Asp 435 440 445 Glu Ile Arg Leu Thr Trp Lys Lys Asp Asp Lys Arg Cys Ser Leu Phe 450 455 460 Ile Asp Leu Lys Thr Tyr Lys Thr Thr Ile Asp Tyr Ile Asn Glu Asn 465 470 475 480 Gly Glu Glu Val Lys Tyr Leu Val 485 <210> 21 <211> 488 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium xylanolyticum <400> 21 Met Ala Leu Asn Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Pro Asp Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gly Asp Leu Lys Thr Leu Asn Asp Val Leu Glu Lys Tyr Phe Ser 20 25 30 Asp Val Phe Gly Gly Ile His Ile Leu Pro Pro Phe Pro Ser Ser Gly 35 40 45 Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Glu Ile Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gly Ser Trp Tyr Asp Ile Lys Lys Met Ala Asp Asn Phe Asp Ile Leu 65 70 75 80 Leu Asp Leu Met Val Asn His Val Ser Arg Arg Ser Ile Tyr Phe Gln 85 90 95 Asp Phe Leu Lys Lys Gly Arg Met Ser Glu Tyr Ala Asp Met Phe Ile 100 105 110 Thr Leu Asp Lys Leu Trp Lys Asp Gly Lys Pro Val Lys Thr Asp Ile 115 120 125 Glu Lys Met Phe Leu Arg Arg Thr Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Lys Ile 130 135 140 Glu Glu Thr Gly Glu Glu Glu Arg Val Trp Thr Thr Phe Gly Lys Thr 145 150 155 160 Asp Pro Ser Glu Gln Ile Asp Leu Asp Val Asn Ser His Leu Val Arg 165 170 175 Glu Phe Leu Leu Glu Val Phe Lys Thr Phe Ser Asn Phe Gly Val Asn 180 185 190 Ile Val Arg Leu Asp Ala Val Gly Tyr Val Ile Lys Lys Met Gly Thr 195 200 205 Ser Cys Phe Phe Val Glu Pro Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Asn Trp Ile 210 215 220 Lys Gly Gln Ala Ala Ser Tyr Gly Ile Glu Leu Leu Leu Glu Val His 225 230 235 240 Ser Gln Phe Glu Val Gln Tyr Lys Leu Ala Glu Arg Gly Phe Trp Ile 245 250 255 Tyr Asp Phe Ile Leu Pro Phe Thr Val Leu Tyr Thr Leu Ile Asn Arg 260 265 270 Ser Asn Glu Met Leu Tyr Asp Tyr Leu Lys Asn Arg Pro Met Asn Gln 275 280 285 Phe Thr Met Leu Asp Cys His Asp Gly Ile Pro Val Lys Pro Asp Leu 290 295 300 Asp Gly Leu Ile Asp Thr Lys Lys Ala Lys Glu Val Val Asp Ile Cys 305 310 315 320 Val Gln Arg Gly Ala Asn Leu Ser Leu Ile Tyr Gly Asp Lys Tyr Lys 325 330 335 Ser Glu Asp Gly Phe Asp Val His Gln Ile Gly Cys Thr Tyr Tyr Ser 340 345 350 Ala Leu Asn Cys Asp Asp Asp Ala Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Ile Gln 355 360 365 Phe Phe Thr Pro Gly Ile Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala 370 375 380 Gly Val Asn Asp Phe Glu Ala Val Lys Arg Thr Lys Glu Gly Arg Glu 385 390 395 400 Ile Asn Arg His Asn Tyr Gly Leu Asn Glu Ile Glu Glu Ser Val Gln 405 410 415 Lys Asp Val Val Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Arg Phe Arg Asn Arg 420 425 430 Tyr Glu Ala Phe Asn Gly Glu Phe Leu Val Glu Asp Cys Lys Asp Asp 435 440 445 Glu Ile Arg Leu Thr Trp Glu Lys Asp Asp Lys His Cys Ser Leu Phe 450 455 460 Ile Asp Leu Gly Ser Tyr Arg Thr Ile Val Asn Tyr Val Asp Glu Asn 465 470 475 480 Gly Lys Asp Val Glu Tyr Ile Val 485 <210> 22 <211> 488 <212> PRT <213> Thermobacillus sp. ZCTH02-B1 <400> 22 Met Lys Leu Glu Asn Arg Val Gln Leu Ile Thr Tyr Pro Asp Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gly Asn Leu Ala Ala Leu Arg Glu Val Leu Arg Arg His Phe Pro 20 25 30 Gly Leu Phe Leu Gly Gly Ile His Ile Leu Pro Pro Phe Pro Ser Ser 35 40 45 Gly Asp Arg Gly Phe Ala Pro Leu Asp Tyr Gly Met Ile Asp Pro Ala 50 55 60 Phe Gly Thr Trp Glu Asp Ile Ala Gln Leu Gly Glu Glu Tyr Gly Val 65 70 75 80 Met Leu Asp Val Met Val Asn His Ile Ser Arg Arg Ser Pro Gln Phe 85 90 95 Met Asp Phe Leu Lys Gln Gly Arg Ser Ser Pro Tyr Ala Asp Met Phe 100 105 110 Leu Thr Leu Asp Lys Ile Trp Pro Asp Gly Arg Pro Val Gln Ala Asp 115 120 125 Ile Asp Lys Met Phe Leu Arg Arg Lys Leu Pro Tyr Ser Ala Phe Thr 130 135 140 Val Gly Asp Gly Arg Glu Glu Leu Val Trp Thr Thr Phe Gly Lys Thr 145 150 155 160 Asp Pro Ser Glu Gln Ile Asp Leu Asp Val Arg Ser Pro Leu Ala Arg 165 170 175 His Tyr Leu Ser Gly Ile Phe Gln Arg Phe Lys Ala Asn Arg Val Asn 180 185 190 Met Val Arg Leu Asp Ala Val Gly Tyr Val Ile Lys Lys Pro Gly Thr 195 200 205 Ser Cys Phe Phe Val Glu Pro Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Asp Trp Val 210 215 220 Ala Asp Gln Ala Lys Glu His Asp Ile Ala Leu Leu Pro Glu Val His 225 230 235 240 Ala His Tyr Ser Ile Gln Tyr Lys Leu Ala Glu Arg Gly Phe Trp Ile 245 250 255 Tyr Asp Phe Ile Leu Pro Phe Met Val Leu Asp Ala Leu Val Asn Arg 260 265 270 Ser Ser Ala Met Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Thr Arg Pro Ala Asn Gln 275 280 285 Phe Thr Met Leu Asp Cys His Asp Gly Ile Pro Val Lys Pro Asp Leu 290 295 300 Asp Asp Leu Val Asp Thr Ala Gln Ala Arg Arg Val Val Asp Leu Cys 305 310 315 320 Leu Ala Arg Gly Ala Asn Leu Ser Tyr Val Ile Ser Asp Arg His Lys 325 330 335 Ser Pro Asp Gly Phe Asp Val His Gln Ile Arg Cys Thr Tyr Tyr Asp 340 345 350 Ala Leu Gly Arg Asn Asp Asp Ala Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Ile Gln 355 360 365 Leu Phe Val Pro Gly Ile Pro Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala 370 375 380 Gly Glu Asn Asp Pro Ala Arg Ala Glu Ala Thr Gly Asp Gly Arg Glu 385 390 395 400 Ile Asn Arg His Asn Tyr Thr Leu Glu Glu Ile Glu Gln Ala Val Arg 405 410 415 Arg Pro Val Val Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Arg Phe Arg Asn Glu 420 425 430 His Glu Ala Phe Gln Gly Ser Phe Arg Val Cys Glu Ser Glu Asp Ser 435 440 445 Lys Ile Arg Leu Glu Trp Glu Lys Asp Ala Ile Arg Cys Ala Leu His 450 455 460 Val Asp Leu Asp Thr Tyr Arg Ser Ile Ile Thr Cys Thr Asp Gly Gln 465 470 475 480 Gly Lys Glu Ala Gln Trp Val Val 485 <210> 23 <211> 504 <212> PRT <213> Bifidobacterium adolescentis <400> 23 Met Lys Asn Lys Val Gln Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Arg Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Thr Ile Lys Ser Met Thr Asp Ile Leu Arg Thr Arg Phe Asp Gly 20 25 30 Val Tyr Asp Gly Val His Ile Leu Pro Phe Phe Thr Pro Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Lys Val Asp Glu Arg 50 55 60 Leu Gly Ser Trp Asp Asp Val Ala Glu Leu Ser Lys Thr His Asn Ile 65 70 75 80 Met Val Asp Ala Ile Val Asn His Met Ser Trp Glu Ser Lys Gln Phe 85 90 95 Gln Asp Val Leu Ala Lys Gly Glu Glu Ser Glu Tyr Tyr Pro Met Phe 100 105 110 Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu 115 120 125 Ala Gly Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Thr His Tyr Lys 130 135 140 Phe Ala Gly Lys Thr Arg Leu Val Trp Val Ser Phe Thr Pro Gln Gln 145 150 155 160 Val Asp Ile Asp Thr Asp Ser Asp Lys Gly Trp Glu Tyr Leu Met Ser 165 170 175 Ile Phe Asp Gln Met Ala Ala Ser His Val Ser Tyr Ile Arg Leu Asp 180 185 190 Ala Val Gly Tyr Gly Ala Lys Glu Ala Gly Thr Ser Cys Phe Met Thr 195 200 205 Pro Lys Thr Phe Lys Leu Ile Ser Arg Leu Arg Glu Glu Gly Val Lys 210 215 220 Arg Gly Leu Glu Ile Leu Ile Glu Val His Ser Tyr Tyr Lys Lys Gln 225 230 235 240 Val Glu Ile Ala Ser Lys Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu Pro 245 250 255 Pro Leu Leu Leu His Ala Leu Ser Thr Gly His Val Glu Pro Val Ala 260 265 270 His Trp Thr Asp Ile Arg Pro Asn Asn Ala Val Thr Val Leu Asp Thr 275 280 285 His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ser Asp Gln Leu Asp Arg 290 295 300 Ser Leu Lys Gly Leu Val Pro Asp Glu Asp Val Asp Asn Leu Val Asn 305 310 315 320 Thr Ile His Ala Asn Thr His Gly Glu Ser Gln Ala Ala Thr Gly Ala 325 330 335 Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Ser Thr Tyr Tyr Ser 340 345 350 Ala Leu Gly Cys Asn Asp Gln His Tyr Ile Ala Ala Arg Ala Val Gln 355 360 365 Phe Phe Leu Pro Gly Val Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Ala Leu Ala 370 375 380 Gly Lys Asn Asp Met Glu Leu Leu Arg Lys Thr Asn Asn Gly Arg Asp 385 390 395 400 Ile Asn Arg His Tyr Tyr Ser Thr Ala Glu Ile Asp Glu Asn Leu Lys 405 410 415 Arg Pro Val Val Lys Ala Leu Asn Ala Leu Ala Lys Phe Arg Asn Glu 420 425 430 Leu Asp Ala Phe Asp Gly Thr Phe Ser Tyr Thr Thr Asp Asp Asp Thr 435 440 445 Ser Ile Ser Phe Thr Trp Arg Gly Glu Thr Ser Gln Ala Thr Leu Thr 450 455 460 Phe Glu Pro Lys Arg Gly Leu Gly Val Asp Asn Thr Thr Pro Val Ala 465 470 475 480 Met Leu Glu Trp Glu Asp Ser Ala Gly Asp His Arg Ser Asp Asp Leu 485 490 495 Ile Ala Asn Pro Pro Val Val Ala 500 <210> 24 <211> 480 <212> PRT <213> Paenibacillus thermophilus <400> 24 Met Lys Ile Lys Asn Glu Ala Met Leu Ile Thr Tyr Ala Asp Ser Leu 1 5 10 15 Gly Thr Asn Leu Lys Glu Leu Asn Gln Val Leu Asp Lys His Leu Gln 20 25 30 Gly Val Val Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Ser Ser Gly 35 40 45 Asp Arg Gly Phe Ala Pro Met Asp Tyr Thr Lys Val Asp Pro Ala Phe 50 55 60 Gly Asp Trp Ser Asp Val Glu Gln Met Ser Gln Lys Tyr Tyr Met Met 65 70 75 80 Tyr Asp Phe Met Ile Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Pro Tyr Phe Gln 85 90 95 Asp Phe Leu Glu Asn Lys Asp Glu Ser Ala Tyr Lys Asp Leu Phe Ile 100 105 110 Arg Tyr Lys Asn Phe Trp Pro Gly Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp Val 115 120 125 Asp Leu Ile Tyr Lys Arg Lys Pro Arg Ala Pro Tyr Val Glu Val Thr 130 135 140 Phe Lys Asp Gly Ser Thr Glu Lys Val Trp Cys Thr Phe Asp Glu Gln 145 150 155 160 Gln Ile Asp Leu Asp Val Thr Thr Asp Thr Thr Lys Lys Phe Ile Arg 165 170 175 Asp Asn Leu Thr Phe Leu Ala Gln Lys Gly Ala Ser Ile Ile Arg Leu 180 185 190 Asp Ala Phe Ala Tyr Ala Asn Lys Lys Ile Gly Thr Asn Cys Phe Phe 195 200 205 Val Glu Pro Asp Ile Trp Asp Met Leu Arg Tyr Ser Lys Asp Ile Ile 210 215 220 Ser Pro Ser Gly Ile Thr Val Leu Pro Glu Ile His Glu His Tyr Ser 225 230 235 240 Ile Gln Leu Lys Ile Ala Glu Gln Asp Tyr Tyr Val Tyr Asp Phe Ala 245 250 255 Leu Pro Met Leu Val Leu His Ala Leu Tyr Ser Gly Gln Val His Arg 260 265 270 Leu Val His Trp Leu Asn Ile Cys Pro Arg Lys Gln Phe Thr Thr Leu 275 280 285 Asp Thr His Asp Gly Ile Gly Val Val Asp Val Lys Asp Leu Leu Ser 290 295 300 Asp Glu Glu Cys Glu Met Thr Arg Glu Ser Leu Tyr Ser Gln Gly Ala 305 310 315 320 Asn Val Lys Lys Ile Tyr Ser Thr Glu Ala Tyr Asn Asn Leu Asp Ile 325 330 335 Tyr Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Gly Asn Asn Asp Gln 340 345 350 Ser Tyr Leu Leu Ala Arg Ala Ile Gln Cys Phe Ala Pro Gly Ile Pro 355 360 365 Gln Ile Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Glu Asn Asp Ile Glu Leu 370 375 380 Leu Glu Arg Thr Lys Glu Gly Arg Asn Ile Asn Arg His Tyr Tyr Thr 385 390 395 400 Leu Glu Glu Ile Glu Arg Glu Val Glu Arg Pro Val Val Lys Gln Leu 405 410 415 Phe Arg Leu Leu Lys Phe Arg Asn Thr Cys Pro Ala Phe Asp Gly Thr 420 425 430 Val Glu Ala Glu Gln Ala Asp Ile Asn Asn Leu Arg Ile Ile Trp Lys 435 440 445 Asn Gly Ala Ser Glu Ala Lys Leu Glu Ala Asn Leu Ala Thr Lys Glu 450 455 460 Phe Ser Ile Arg Tyr Lys Asp Ala Glu Thr Asn Trp Thr Leu Leu Met 465 470 475 480 <210> 25 <211> 489 <212> PRT <213> Tepidibacillus decaturensis <400> 25 Met Asn Val Lys Asn Gln Val Gln Leu Ile Thr Tyr Pro Asp Ser Leu 1 5 10 15 Gly Gly Asn Leu Lys Asn Leu His His Val Leu Leu Lys Tyr Phe Val 20 25 30 Asp Ile Phe Lys Gly Gly Val His Ile Leu Pro Pro Tyr Pro Ser Ser 35 40 45 Gly Asp Arg Gly Phe Ala Pro Ile Asn Tyr Leu Glu Ile Asp Pro Arg 50 55 60 Phe Gly Thr Trp Ala Asp Ile Lys Ala Ile Gly Glu Asn Phe Asp Val 65 70 75 80 Met Leu Asp Leu Met Val Asn His Ile Ser Arg Gln Ser Leu Tyr Phe 85 90 95 Gln Asp Phe Leu Lys Lys Gly Arg Gln Ser Glu Tyr Ala Asp Met Phe 100 105 110 Ile Thr Leu Asp Lys Ile Trp Asp Asp Gly Glu Pro Val Gln Glu Asp 115 120 125 Ile Asp Lys Met Phe Leu Arg Arg Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Ser 130 135 140 Ile Lys Glu Thr Gly Glu Gln Glu Arg Val Trp Thr Thr Phe Gly Lys 145 150 155 160 Thr Asp Pro Ser Glu Gln Ile Asp Leu Asp Ile Lys Ser Gln Lys Val 165 170 175 Lys Gln Leu Leu Thr Ser Phe Phe Gln Asn Phe Lys Gln Gln Asn Val 180 185 190 Lys Met Val Arg Leu Asp Ala Val Gly Tyr Val Ile Lys Lys Leu Gly 195 200 205 Thr Ser Cys Phe Phe Val Glu Pro Asp Ile Tyr Asp Phe Leu Asp Trp 210 215 220 Met Arg Glu Ile Ala Asp Ser Met Glu Ile Glu Leu Leu Pro Glu Val 225 230 235 240 His Ala His Tyr Ser Ile Gln Tyr Lys Leu Ala Glu His Gly Phe Trp 245 250 255 Ile Tyr Asp Phe Ile Leu Pro Tyr Arg Ile Leu Asp Ala Leu Val Asn 260 265 270 Lys Ser Ser Lys Asp Leu Leu Asp Tyr Leu Lys Asn Arg Pro His Lys 275 280 285 Gln Val Thr Met Leu Asp Cys His Asp Gly Ile Pro Val Lys Pro Asp 290 295 300 Leu Asp Asp Leu Ile Asp Thr Lys Glu Ala Arg Lys Leu Val Asn Val 305 310 315 320 Cys Leu Glu Arg Gly Ser Asn Leu Ser Leu Ile Leu Ser His Glu His 325 330 335 Lys Asp Lys Asp Gly Phe Asp Val His Gln Ile Arg Cys Ser Tyr Tyr 340 345 350 Ser Val Leu Asn Arg Asp Asp Asp Ala Tyr Leu Ala Ala Arg Ala Ile 355 360 365 Gln Phe Phe Thr Pro Gly Ile Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu Leu 370 375 380 Ala Gly Glu Asn Asp Met Glu Gly Val Lys Lys Thr Gly Glu Gly Arg 385 390 395 400 Glu Ile Asn Arg His Asn Phe Ser Leu Asp Glu Ile Glu His Ser Leu 405 410 415 Asn Lys Lys Val Val Gln Arg Leu Leu Gln Leu Ile Arg Phe Arg Asn 420 425 430 Glu Tyr Asp Ala Phe Asn Gly Glu Phe Lys Val Leu Asp Ser Ala Gln 435 440 445 Asp Glu Ile Arg Leu Ser Trp Gln Lys Glu Glu Lys Arg Cys Thr Leu 450 455 460 Gln Ile Asp Leu Lys Thr Asn Lys Ser Val Ile Glu Tyr Val Asp Glu 465 470 475 480 Lys Asp Gly Glu Ile Pro Tyr Phe Ile 485 <210> 26 <211> 504 <212> PRT <213> Thermanaerothrix daxensis <400> 26 Met Lys Asn Gln Val Gln Leu Ile Thr Tyr Val Asp Arg Leu Gly Ser 1 5 10 15 Gly Asn Ile Lys Thr Leu His Gln Leu Leu Arg Gly Pro Leu Ala Gly 20 25 30 Leu Phe Gly Gly Val His Leu Leu Pro Phe Tyr Tyr Pro Ile Lys Gly 35 40 45 Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ile Asp His Thr Arg Val Asp Pro Cys 50 55 60 Leu Gly Ser Trp Glu Asp Ile Arg Ala Leu Gly Gln Asp Val Asp Leu 65 70 75 80 Met Ala Asp Leu Ile Val Asn His Ile Ser Ser Ser Ser Pro Gln Phe 85 90 95 Leu Asp Tyr Leu Glu Lys Gly Asp Asp Ser Ile Tyr Lys Asp Leu Phe 100 105 110 Leu Thr Met Ser Ser Val Phe Pro Asn Gly Ala Thr Glu Ala Asp Leu 115 120 125 Leu Thr Ile Tyr Arg Pro Arg Pro Gly Leu Pro Phe Ser Tyr Ile Thr 130 135 140 Leu Lys Asn Gly Gln Lys Arg Leu Leu Trp Thr Thr Phe Ser Arg Gln 145 150 155 160 Gln Ile Asp Ile Asn Val Leu His Pro Met Gly Arg Glu Tyr Leu His 165 170 175 Ser Val Leu Arg Thr Leu His Glu Asn Gly Ile Arg Met Val Arg Leu 180 185 190 Asp Ala Val Gly Tyr Ala Val Lys Lys Ala Gly Thr Thr Cys Phe Met 195 200 205 Ile Pro Glu Thr Phe Asp Phe Ile Glu Asn Leu Thr His Gln Ala Gln 210 215 220 Glu Leu Gly Met Glu Val Leu Val Glu Ile His Ser His Tyr Arg Lys 225 230 235 240 Gln Ile Glu Ile Ala Arg Gln Val Asp Arg Val Tyr Asp Phe Ala Leu 245 250 255 Pro Pro Leu Val Leu His Ala Ile Phe Asn Arg Thr Ala Tyr Tyr Leu 260 265 270 Lys Gln Trp Leu Ser Ile Ser Pro Arg Asn Ala Ile Thr Val Leu Asp 275 280 285 Thr His Asp Gly Ile Gly Val Ile Asp Ile Gly Ala Asp Ser Ser Asp 290 295 300 Pro Gln Asn Tyr Pro Gly Leu Ile Pro Pro Glu Glu Leu Glu Ala Leu 305 310 315 320 Val Glu Gln Ile His Leu Asn Ser Asn Gly Gln Ser Arg Leu Ala Ser 325 330 335 Gly Ala Ala Ala Ser Asn Leu Asp Leu Tyr Gln Val Asn Cys Thr Phe 340 345 350 Tyr Asp Ala Leu Gly Arg Asn Asp Arg Asp Tyr Leu Leu Ala Arg Ala 355 360 365 Ile Gln Phe Phe Ser Pro Gly Ile Pro Gln Val Tyr Tyr Val Gly Leu 370 375 380 Leu Ala Gly Glu Asn Asp Met Asp Leu Leu Ala Arg Thr Gly Val Gly 385 390 395 400 Arg Asp Ile Asn Arg His Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu Ile Ala Gln Ala 405 410 415 Ile Gln Arg Pro Val Val Gln Ser Leu Phe Arg Leu Ile Arg Phe Arg 420 425 430 Asn Gln His Pro Ala Phe Asn Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ser Pro 435 440 445 Asp Ser Arg Leu Ile Leu Arg Trp Asp Asn Gly Ala Ala Trp Ala Val 450 455 460 Leu Glu Val Asp Phe Ala Ala Gly Thr Phe Ser Ile Ser Gly Ser Pro 465 470 475 480 Leu Glu Gly Ala Glu Pro Ile Glu Ala Leu Pro Gly Ala His Pro Asp 485 490 495 Asn Arg Tyr Gly Gly Ile Ala Thr 500

Claims (15)

  1. 전분 또는 전분 유도체로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 개선된 방법으로서, 여기서 개선이
    a) 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계로서, 여기서 PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    b) 알파-글루칸 포스포릴라제(αGP)에 의해 촉매되는 전분 유도체의 G1P로의 전환 단계로서, 여기서 αGP가 서열번호 10 내지 서열번호 13 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및
    c) 4-알파-글루칸 트랜스퍼라제(4GT)에 의해 촉매되는 전분 유도체의 당전이(transglycosylating) 단계로서, 여기서 4GT가 서열번호 15 내지 서열번호 17 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    중 적어도 하나를 포함하는, 개선된 방법.
  2. 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 개선된 방법으로서, 여기서 개선이 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 G1P의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계를 포함하며, PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 개선된 방법.
  3. 수크로스로부터 헥소스의 효소적 생산을 위한 개선된 방법으로서, 여기서 개선이
    a) 포스포글루코뮤타제(PGM)에 의해 촉매되는 글루코스 1-포스페이트(G1P)의 글루코스 6-포스페이트(G6P)로의 전환 단계로서, 여기서 PGM이 서열번호 2 내지 서열번호 8 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계; 및
    b) 수크로스 포스포릴라제를 사용하여 수크로스를 글루코스 1-포스페이트(G1P)로 전환시키는 단계로서, 여기서 수크로스 포스포릴라제가 서열번호 19 내지 서열번호 25 중 어느 하나와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단계;
    중 적어도 하나를 포함하는, 개선된 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 헥소스가 알로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 알트로스, 탈로스, 소르보스, 굴로스 이도스, 알룰로스, 이노시톨 및 타가토스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 개선된 방법.
  5. 제1항에 있어서, 전분 유도체가 아밀로스, 아밀로펙틴, 가용성 전분, 아밀로덱스트린, 말토트리오스, 말토스 및 말토덱스트린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 개선된 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 헥소스 포스페이트 포스파타제를 사용하여 헥소스-포스페이트를 탈인산화하는 단계를 추가로 포함하는, 개선된 방법.
  7. 제6항에 있어서, 방법 단계가 단일 반응 용기에서 수행되는, 개선된 방법.
  8. 제7항에 있어서, 방법 단계가 약 0.1 mM 내지 약 150 mM의 포스페이트 농도에서 ATP-무함유, NAD(P)(H)-무함유로 수행되고/되거나, 포스페이트가 재활용되고/되거나, 헥소스 포스페이트의 탈인산화 단계가 에너지면에서 유리한 화학 반응을 포함하는, 개선된 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 방법 단계가 하기의 방법 조건:
    약 37℃ 내지 약 85℃ 범위의 온도에서,
    약 5.0 내지 약 8.0 범위의 pH에서, 또는
    약 0.5시간 내지 약 48시간 동안
    중 적어도 하나에서 또는 연속 반응으로서 수행되는, 개선된 방법.
  10. 제4항에 있어서, 헥소스를 이의 당 알코올로 환원시키는 단계를 추가로 포함하는, 개선된 방법.
  11. 제4항에 있어서, PGM이 서모코쿠스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis) 유래의 PGM(Uniprot ID Q68BJ6)의 활성에 비해 적어도 10% 더 높은 활성을 갖는, 개선된 방법.
  12. 제1항에 있어서, αGP가 서모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 유래의 αGP(Uniprot ID G4FEH8)의 활성에 비해 적어도 10% 더 높은 활성을 갖는, 개선된 방법.
  13. 제1항에 있어서, 4GT가 서모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litorolis) 유래의 4GT(Uniprot ID 032462)의 활성에 비해 적어도 10% 더 높은 활성을 갖는, 개선된 방법.
  14. 제3항에 있어서, SP가 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 활성에 비해 적어도 10% 더 높은 활성을 갖는, 개선된 방법.
  15. 제3항에 있어서, SP가 서모안에어로박테리움 서모사카롤리티큠 유래의 SP(Uniprot ID D9TT09)의 달성 가능한 수율에 비해 적어도 10% 더 높은 달성 가능한 수율을 갖는, 개선된 방법.
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