CN115851648A - 一种热稳定性及催化活性提高的甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体及其应用 - Google Patents
一种热稳定性及催化活性提高的甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及热稳定性和催化活性甘油葡萄糖苷磷酸化酶的突变位点和/或突变体变体及其组合，以及上述组合突变位点和/或突变体在蔗糖体系合成甘油葡萄糖苷中的应用，特别是在麦芽糊精体系中合成甘油葡萄糖苷。本发明的突变体，在55℃下的T1/2相较野生型提高了800‑2000倍，对甘油和α‑G1P的催化效率较野生型提高了2‑30倍，并且该酶突变体能够以直链淀粉、支链淀粉、麦芽糊精和甘油为底物制备甘油葡萄糖苷。
Description
技术领域
本发明涉及热稳定性和催化活性甘油葡萄糖苷磷酸化酶变体以及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
甘油葡萄糖苷是由一分子的葡萄糖和一分子的甘油以糖苷键的形式进行连接。在自然界中，迄今已鉴定出六种结构不同的GG。根据糖苷键和立体化学结构的差别，可分为2-O-α-D-glucosylglycerol(αGG)、(2S)-1-O-α-D-glucosylglycerol、(2R)-1-O-α-D-glucosylglycerol、2-O-β-D-glucosylglycerol、(2S)-1-O-β-D-glucosylglycerol、(2R)-1-O-β-D-glucosylglycerol。其中αGG作为化妆品中的保湿剂而引起广泛的关注，是名贵化妆品的常用成分之一。目前甘油葡萄糖苷的合成方法主要有化学法、发酵法和酶催化的方法等。化学合成方法得率低、立体选择性差，产物多是混合物，后续的分离纯化步骤繁琐且耗费较高；合成甘油葡萄糖苷的发酵菌株普遍生产效率较低，且体内代谢途径还不清晰；而酶催化的方法是利用蔗糖磷酸化酶的副反应—转糖苷反应，存在热力学平衡，因此转化率较低，此外，专利CN201910710353.3公布了以蔗糖或者淀粉为底物，在磷酸化酶的催化下生成中间产物α-G1P，然后甘油葡萄糖苷磷酸化酶催化α-G1P和甘油生成甘油葡萄糖苷，该路线由热力学驱动，因此具有较好的转化率。但是，甘油葡萄糖苷磷酸化酶的热稳定性较低，催化活性差，这极大的限制了它的应用，因此，提高甘油葡萄糖苷磷酸化酶的热稳定性及催化效率对于甘油葡萄糖苷的合成途径具有重要的意义。
发明内容
本发明涉及一种热稳定性和催化活性甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变位点和/或突变体及其组合，本发明通过理性设计、定点饱和突变、组合突变，筛选得到酶活提高和热稳定提高的突变体。本发明通过如下技术方案实现：
本发明的目的之一，是提供能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶稳定性的突变位点，其中，所述突变位点选自64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的一个或多个位置上突变，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号。
本发明还提供能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶稳定性的突变体，其包含上述突变位点，即选自64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的一个或多个位置上突变，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号。
根据本发明的优选技术方案，所述突变位点和/或突变体选自64、96、125、127、143、166、217、236、386中的一个或多个位置上突变。
根据本发明的优选技术方案，所述突变位点和/或突变体选自64突变为F、C、A；96突变为K、M；106突变为S；125突变为I、L、E、P；127突变为A、S、L；143突变为A、P、E、K；166突变为P、A、R；167突变为K；185突变为K；217突变为L、I、V、Y；236突变为L、I、D；386突变为Q、T、G、H中的一个或多个位置上包含取代。
根据本发明的优选技术方案，所述突变位点和/或突变体选自64突变为F、C、A；96突变为K、M；125突变为I、L、E、P；127突变为A、S、L；143突变为A、P、E、K；166突变为P、A、R；217突变为L、I、V、Y；236突变为L、I、D；386突变为Q、T、G、H中的一个或多个位置上突变。
本发明的目的之二，是提供能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶活性的突变位点，其特征在于，突变位点和/或突变体选自48、50、61、119、321和438中的一个或多个位置上突变，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号。
本发明还提供能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶活性的的突变体，其包含上述突变位点，即选自48、50、61、119、321和438中的一个或多个位置上突变，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号。
根据本发明的优选技术方案，所述突变位点和/或突变体选自119、321、438中的一个或多个位置上突变。
根据本发明的优选技术方案，所述突变位点和/或突变体选自48突变为G；50突变为S；61突变为E；119突变为I、P、L、A；321突变为V、Y、I、K、L；438突变为F、D、P中的一个或多个位置上包含取代。
根据本发明的优选技术方案，所述突变位点和/或突变体选自119突变为I、P、L、A；321突变为V、Y、I、K、L；438突变为F、D、P中的一个或多个位置上突变。
本发明的目的之三，是提供能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶稳定性和/或活性的组合突变位点，其特征在于，选自如上所述的突变位点组合。其选自如下任何一种：
(1)本发明的目的之一中的两个以上的突变位点的组合；
(2)本发明的目的之二中的两个以上的突变位点的组合；或者
(3)本发明的目的之一中的至少一个的突变位点和本发明的目的之二中的至少一个的突变位点。
根据本发明的技术方案，提供能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶稳定性和/或活性的组合突变体，其特征在于，选自如上所述的突变体组合。其选自如下任何一种：
(1)本发明的目的之一中的两个以上的突变体的组合；
(2)本发明的目的之二中的两个以上的突变体的组合；或者
(3)本发明的目的之一中的至少一个的突变体和本发明的目的之二中的至少一个的突变体。
根据本发明的技术方案，其组合选自
(1)64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的两个以上的位置上突变的突变位点和/或突变体的组合，或者
(2)选自48、50、61、119、321和438中的两个以上的位置上突变的突变位点和/或突变体的组合，或者
(3)选自64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的一个或多个的位置上突变的突变位点和/或突变体，与选自48、50、61、119、321和438中的一个或多个的位置上突变的突变位点和/或突变体的组合。
根据本发明的优选技术方案，所述组合的突变位点和/或突变体中，选自64、96、125、127、143、166、217、236、386中的一个或多个位置上突变，和119、321、438中的一个或多个位置上突变。例如，其中的两个位置或者两个以上位置。
根据本发明的优选技术方案，所述组合的突变位点和/或突变体中，选自64突变为氨基酸F、C、A；96突变为K、M；125突变为I、L、E、P；127突变为A、S、L；143突变为A、P、E、K；166突变为P、A、R；217突变为L、I、V、Y；236突变为L、I、D；386突变为Q、T、G、H；中的一个或多个位置上突变，和119突变为I、P、L、A；321突变为V、Y、I、K、L；438突变为F、D、P中的一个或多个位置上突变组合。
本发明的目的之四，是提供一种酶，其特征在于，所述酶的氨基酸序列含有上述的突变位点，和/或组合突变位点。
根据本发明所述的酶，其特征在于，含有上述突变位点的突变体，和/或上述组合突变位点的突变体。
本发明的目的之五，是提供一种催化生成甘油葡萄糖苷转化率较高的方法，其特征在于，将本发明上述突变位点和/或突变体，和/或组合突变位点和/或突变体用于制备甘油葡萄糖苷。
根据本发明的优选技术方案，其特征在于，上述突变位点和/或突变体，和/或组合突变位点和/或突变体用于在直链淀粉、支链淀粉、蔗糖、麦芽糊精和甘油为底物，制备甘油葡萄糖苷。
根据本发明的优选技术方案，以淀粉或麦芽糊精为原料制备甘油葡萄糖苷体系包括：包括：异淀粉酶，葡聚糖磷酸化酶，4-α-葡聚糖转移酶，磷酸盐缓冲液，蔗糖和甘油。
根据本发明的优选技术方案，其特征在于，异淀粉酶(EC 3.2.1.68)，来源于超嗜热古菌Sulfurisphaera tokodaii，命名为StIA，基因在UniProt上的编号为Q973H3，该酶催化麦芽糊精中以α-1,6糖苷键连接的支链的断裂，形成直链聚糖，其在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选0.5U/mL；葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，命名为TmGP，基因在KEGG上的编号为TM1168，该酶具有催化直链聚糖和磷酸基团(PO4 3-)合成α-G1P功能，其在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选10U/mL；4-α-葡聚糖转移酶来源于Thermococcuslitoralis，命名为TlGT，基因在UniProt上的编号为O32462，该酶具有催化麦芽糖、麦芽三糖聚合生成麦芽四糖或更高聚合度的寡糖功能，其在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选0.5U/mL；甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体为上述突变位点和/或突变体，和/或组合突变位点和/或突变体，其在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选10U/mL；磷酸盐缓冲液浓度1-100mM，优选20mM；淀粉或麦芽糊精浓度为0.01-150g/L，优选100g/L；甘油浓度为0.001-1mol/L，优选0.6mol/L.
根据本发明的优选技术方案，其特征在于，上述反应体系反应温度为30-55℃，优选55℃；反应时间为1-48h，优选12h。
根据本发明的另一个优选技术方案，以蔗糖为原料制备甘油葡萄糖苷体系包括：蔗糖磷酸化酶，磷酸盐缓冲液，蔗糖和甘油。
根据本发明的优选技术方案，所述蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)来源于青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis，命名为BaSP，在UniProt上的编号为A0ZZH6，该酶具有催化蔗糖和磷酸合成α-G1P和果糖功能，其在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选10U/mL；甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体为上述突变位点和/或突变体和/或组合突变位点和/或突变体，其在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选10U/mL；磷酸盐缓冲液浓度1-100mM，优选50mM；蔗糖浓度为0.01-2mol/L，优选1mol/L；甘油浓度为1-2.4mol/L，优选1.2mol/L.
根据本发明的优选技术方案，其特征在于，上述反应体系反应温度为30-55℃，优选55℃；反应时间为1-48h，优选12h。
本发明的目的之六，提供本发明上述突变位点和/或突变体，和/或组合突变位点和/或突变体在制备甘油葡萄糖苷中的应用。
根据本发明的优选技术方案，提供上述突变位点和/或突变体，和/或组合突变位点和/或突变体在直链淀粉、支链淀粉、蔗糖、麦芽糊精和甘油为底物，制备甘油葡萄糖苷的应用。
例如，本发明提供上述组合突变位点和/或突变体在蔗糖体系合成甘油葡萄糖苷中的应用。
又例如，本发明提供所述的组合突变位点和/或突变体在麦芽糊精体系中合成甘油葡萄糖苷的应用。
此外，本发明还包含上述突变位点和/或突变体，和/或组合突变位点和/或突变体的表达载体和/或宿主细胞。
本发明的目的之七，是提供了一种热稳定性和催化活性甘油葡萄糖苷磷酸化酶变体的制备方法，包括定点突变，和/或在合适的条件下在培养基中培养包含上述突变位点和/或突变体，和/或组合突变位点和/或突变体的宿主细胞以产生所述的突变位点和/或突变体。
根据本发明的优选技术方案，通过蛋白结构模拟、易错PCR、定点饱和突变等方法，或者酶分子理性设计潜在影响活性和热稳定性的氨基酸位点。采用了定点饱和突变策略构建突变体库并经测序验证，筛选得到酶活提高或者热稳定提高的突变体。进而通过组合突变的方式，对这些位点进行组合突变，获得热稳定性和催化活性均提高的突变体，用于制备甘油葡萄糖苷。
有益效果
本发明得到一系列热稳定性和催化活性显著提高的突变体，在55℃下的T1/2相较野生型提高了2-1730倍，对甘油和α-G1P的催化效率较野生型提高了2-30倍。应用该酶突变体能够以直链淀粉、支链淀粉、麦芽糊精和甘油为底物制备甘油葡萄糖苷，有效的提高了转化率。
附图说明
图1为突变体催化蔗糖生产甘油葡萄糖苷HPLC图。
图2为突变体催化麦芽糊精生产甘油葡萄糖苷HPLC图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
实施例1原核表达体系的构建
1、基因合成甘油葡萄糖苷磷酸化酶基因片段(MaGGP)(南京金斯瑞生物科技有限公司)，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并重组到PUC57载体上。
2、以合成的基因为模板，设计引物P1和P2进行PCR扩增，并回收PCR扩增产物。
P1：GGAATTCCATATGATGCATCATCACCATCACCATCTGCTGAAAAACGCTGTTC
P2：CCGCTCGAGTTAGCATTCCAGGTGACGGG
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切，回收酶切产物。
4、采用限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切载体pET21a，回收酶切产物。
5、将步骤3得到的酶切片段和步骤4得到的酶切载体采用T4 DNA连接酶进行连接，并将连接产物转化DH5α。
6、经菌落PCR筛选和测序验证后，得到阳性重组质粒MaGGP-pET21a。
7、将阳性重组质粒MaGGP-pET21a转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到原核表达菌株MaGGP-pET21a(BL21)，作为后续定向进化和发酵的原代菌株。
实施例2.甘油葡萄糖苷磷酸化酶的表达及活性评价
1、原代菌株MaGGP-pET21a(BL21)及其突变体接种于3mL LB培养基进行过夜活化得到种子液，以1％的接种量转接至LB培养基培养至OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.1mMIPTG进行异源蛋白的诱导表达。离心收集菌株，用50mM MES(pH＝6.5)缓冲液对菌体进行悬浮，然后进行超声破碎，14000rpm离心30min获得破碎上清，采用Ni柱亲和层析的方法进行纯化，并进一步用30kDa的超滤管进行超滤，得到浓缩纯化的野生型及突变体蛋白。
2、甘油葡萄糖苷磷酸化酶酶活测定体系如下：50mMα-G1P，50mM甘油，50mM MES缓冲液(pH＝6.5)，50μg/mL的纯化蛋白，30℃、850rpm反应10分钟。反应结束后，立即置于沸水浴10分钟终止反应，利用高效液相色谱进行测定。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，色谱柱为Sugar-Pak柱，柱温：80℃，流动相：ddH2O，流速：0.4mL/min，上样量为10μL。
实施例3.突变体库的构建
1、设计易错PCR所使用的的引物如下：
P3：GGAATTCCATATGATGCATCATCACCATCACCA
P4：CCGCTCGAGTTAGCATTCCAGGTGACGGG
2、以实施例1中合成的甘油葡萄糖苷磷酸化酶的基因为模板，采用上述引物及随机突变PCR试剂盒以野生型甘油葡萄糖苷磷酸化酶的基因为模板进行PCR扩增，并对PCR产物进行切胶回收，经限制性内切酶NdeI、XhoI处理后与同样经过双酶切的pET21a载体进行连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，突变LB平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜，待长出转化子后，用灭菌的牙签挑取单个转化子至96孔板中，每个孔中加1mL LB液体培养基，37℃培养6h后，加入终浓度为0.1mM IPTG，并降低温度至16℃诱导过夜。
3、将上述培养的96孔板进行离心，弃上清，用50mM MES(pH＝6.5)重悬菌体沉淀，并加入溶菌酶，37℃处理1h，反复冻融2次，获得含甘油葡萄糖苷磷酸化酶的大肠杆菌细胞裂解液。
4、取20μL上述大肠杆菌细胞裂解液测定突变体的活性及热稳定性，得到活性或者热稳定性提升的突变位点。
实施例4.热稳定性提升位点的定点饱和突变
以重组质粒pET21a-MaGGP为模板，以带有突变位点的一对引物，用高保真酶进行全质粒PCR扩增，获得指定突变位点的重组质粒。扩增产物用DpnI酶在37℃条件下消化2h，降解初始模板。消化产物转化至E.coli BL21，涂布到含有100μg/mL氨苄霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，每个位点筛选100个阳性克隆。
分析测定突变体的催化活性及热稳定性，将催化活性提高或者热稳定提高的甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体进行测序，分析相应位置氨基酸突变为何种氨基酸。热稳定性提高的突变体的突变位点及在55℃下的相对热稳定性如表1所示，野生型在55℃下的T1/2为1。
表1热稳定性提高的突变体
本发明提供了能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶稳定性的突变位点和/或突变体，经筛选发现，64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386位点氨基酸突变之后热稳定性的影响较大。其中，如表1所示，这些突变体稳定性提升2-25倍不等。尤其，96位氨基酸残基的突变对热稳定性的提高较显著，96K在55℃下的T1/2时间最长，相较野生型提高了25倍，因此，在突变96K的基础上进行下一轮的组合突变。
实施例5热稳定性提高位点的组合突变
将上述相对热稳定性显著提高的双突变体与其他在单点饱和突变中热稳定性提升的位点进行逐轮组合突变，并测定在55℃下的T1/2，计算相较野生型提升的倍数。表2中列举出热稳定性提高显著的组合突变体的相对热稳定性及突变情况，野生型为1。
表2热稳定性提高显著的组合突变体
本发明提供了能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶稳定性的组合突变位点和/或突变体，经筛选发现，如表2中所示，突变位点选自64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的两个以上的位置上突变的突变位点和/或突变体的组合，均获得较好的相对热稳定性效果。令人惊讶的是，有的甚至相对野生型提高了1732倍，远远高于单突变及其加和。
实施例6.活性提升位点的定点饱和突变
以重组质粒pET21a-MaGGP为模板，以带有突变位点的一对引物，用高保真酶进行全质粒PCR扩增，获得指定突变位点的重组质粒。扩增产物用DpnI酶在37℃条件下消化2h，降解初始模板。消化产物转化至E.coli BL21，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养，每个位点筛选100个阳性克隆。
分析测定突变体的催化活性，将催化活性提高的甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体进行测序，分析相应位置氨基酸突变为何种氨基酸。活性提高的突变体的突变位点及相对活性如表3所示，野生型相对活性为1。
酶活定义为：1min生成1μmol甘油葡萄糖苷所需要的酶量定义为1U。酶活测定体系为1mL，包含50mMα-G1P，50mM甘油，50μg/mL甘油葡萄糖苷磷酸化酶，50mM MES缓冲液(pH＝6.5),30℃反应10min后，立即沸水浴10min终止反应，并利用高效液相色谱进行测定。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，色谱柱为Sugar-Pak柱，柱温：80℃，流动相：ddH2O，流速：0.4mL/min，上样量为10μL。
表3活性提高的突变体的突变位点及相对活性
本发明提供了能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶活性的突变位点和/或突变体，经筛选发现，位点48、50、61、119、321、438突变之后对酶催化活性的影响较大。突变体48G、50S、61E、119I、321V、438F相对活性为野生型的1.5、1.3、1.4、4.8、4.3、3.7倍。其中，如表3所示，与活性密切相关的3个位点，其在序列总的位置编号为119、321、438。321位氨基酸残基的突变对催化活性提高较显著，321V相较野生型提高了4.8倍，因此，在获得的热稳定提升的突变体的基础上组合321位点的突变。
实施例7活性提高位点的组合突变
将上述相对稳定性显著提高和活性显著提高的突变体与其他在单点饱和突变中相对活性性提升的位点进行逐轮组合突变，并测定活性，计算相较野生型提升的倍数。表4中列举出相对活性提高显著的组合突变体的活性及突变情况，野生型为1。
酶活定义为：1min生成1μmol甘油葡萄糖苷所需要的酶量定义为1U。酶活测定体系为1mL，包含50mMα-G1P，50mM甘油，50μg/mL甘油葡萄糖苷磷酸化酶，50mM MES缓冲液(pH＝6.5),30℃反应10min后，立即沸水浴10min终止反应，并利用高效液相色谱进行测定。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，色谱柱为Sugar-Pak柱，柱温：80℃，流动相：ddH2O，流速：0.4mL/min，上样量为10μL。
表4例举热稳定性和催化活性均提高的突变体
本发明提供了能够提升甘油葡萄糖苷磷酸化酶稳定性和活性的组合突变位点和/或突变体，经大量的筛选发现，选自64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的一个或多个的位置上突变的突变位点和/或突变体，与选自119、321和438中的一个或多个的位置上突变的突变位点和/或突变体的组合，其中，如表4中所示，上述组合不仅稳定性提高了，而且相对活性也得到了显著提升，甚至相对于野生型提高了20倍。
实施例8.利用甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体以蔗糖为底物合成甘油葡萄糖苷
将上述位点构建组合突变体，转化蔗糖和甘油生成甘油葡萄糖苷，反应体系除甘油葡萄糖苷磷酸化酶外还包含蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)。所述反应体系中，蔗糖磷酸化酶来源于青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis，命名为BaSP，在UniProt上的编号为A0ZZH6，该酶具有催化蔗糖和磷酸合成α-G1P和果糖功能。
上述基因经南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并连接到pET21a载体上，转化大肠杆菌BL21感受态，获得重组菌株，并按实施例2中第一条所述方法制备蔗糖磷酸化酶和甘油葡萄糖苷磷酸化酶。基于酶液建立反应体系。
反应的体系如下：1M蔗糖，1.2M甘油，50mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)，10U/mL蔗糖磷酸化酶，10U/mL甘油葡萄糖苷磷酸化酶，55℃反应12h。反应结束后，100℃沸水浴加热10min终止反应，利用高效液相色谱进行测定。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，色谱柱为Sugar-Pak柱，柱温：80℃，流动相：ddH2O，流速：0.4mL/min，上样量为10μL。
图1所示，MaGGP突变体能够以蔗糖和甘油为底物，催化生成甘油葡萄糖苷，与甘油葡萄糖苷的标准品出峰时间一致。表5列举了部分转化率较高的突变体实验数据。
利用本申请的甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体合成甘油葡萄糖苷，具有较高的转化率。如表5所示，例举了部分将上述稳定性提高且相对活性也得到了显著提升的突变体在转化底物蔗糖合成甘油葡萄糖苷中，其转化率均高达90％以上，最终反应体系中甘油葡萄糖苷浓度超过200g/L。
进一步建立高底物浓度下反应体系，反应的体系如下：2M蔗糖，2.4M甘油，50mMPBS缓冲液(pH＝6.5)，20U/mL蔗糖磷酸化酶，20U/mL甘油葡萄糖苷磷酸化酶，55℃反应24h，甘油葡萄糖苷浓度450g/L。
实施例9.利用甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体以麦芽糊精为底物合成甘油葡萄糖苷
采用本发明的突变体，转化麦芽糊精和甘油生成甘油葡萄糖苷。反应体系除甘油葡萄糖苷磷酸化酶外还包含异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、葡聚糖磷酸化酶(EC 2.4.1.1)、4-α-葡聚糖转移酶(4GT，EC 2.4.1.25)。所述反应体系中，异淀粉酶来源于超嗜热古菌Sulfurisphaera tokodaii，命名为StIA，基因在UniProt上的编号为Q973H3，该酶催化麦芽糊精中以α-1,6糖苷键连接的支链的断裂，形成直链聚糖；葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，命名为TmGP，基因在KEGG上的编号为TM1168，该酶具有催化直链聚糖和磷酸基团(PO4 3-)合成α-G1P功能；4-α-葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis，命名为TlGT，基因在UniProt上的编号为O32462，该酶具有催化麦芽糖、麦芽三糖聚合生成麦芽四糖或更高聚合度的寡糖功能。
上述基因经南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并连接到pET21a载体上，转化大肠杆菌BL21感受态，获得重组菌株，并按实施例2中第一条所述方法制备异淀粉酶、葡聚糖磷酸化酶、4-α-葡聚糖转移酶、甘油葡萄糖苷磷酸化酶，基于酶液建立反应体系。
反应的体系如下：100g/L麦芽糊精，600mM甘油，50mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)，10U/mL异淀粉酶，10U/mL葡聚糖磷酸化酶，10U/mL葡聚糖转移酶，10U/mL甘油葡萄糖苷磷酸化酶，55℃反应12h。反应结束后，100℃沸水浴加热10min终止反应，利用高效液相色谱进行测定。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，色谱柱为Sugar-Pak柱，柱温：80℃，流动相：ddH2O，流速：0.4mL/min，上样量为10μL。图2所示，MaGGP突变体能够以麦芽糊精和甘油为底物，催化生成甘油葡萄糖苷，与甘油葡萄糖苷的标准品出峰时间一致，且转化效率可达到88％-95％。表6例举部分突变体转化麦芽糊精生产甘油葡萄糖苷的转化率，转化率维持在88％-95％之间。
表6转化麦芽糊精生产甘油葡萄糖苷所使用的突变体
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种热稳定性及催化活性提高的甘油葡萄糖苷磷酸化酶突变体及其应用
<130> CPCN21411161
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 480
<212> PRT
<213> 黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens HP15
<400> 1
Met Leu Leu Lys Asn Ala Val Gln Leu Ile Cys Tyr Pro Asp Arg Ile
1 5 10 15
Gly Asn Asn Leu Lys Asp Leu Tyr Thr Val Val Asp Thr His Leu Ser
20 25 30
Glu Ala Ile Gly Gly Leu His Ile Leu Pro Phe Phe Pro Ser Asn Ala
35 40 45
Asp Gly Gly Phe Ser Pro Leu Thr His Lys Glu Val Asp Pro Lys Val
50 55 60
Gly Thr Trp Asp Asp Ile Glu Ala Phe Thr Ala Lys Tyr Asp Leu Cys
65 70 75 80
Val Asp Leu Thr Val Asn His Ile Ser Asp Glu Ser Pro Glu Phe Thr
85 90 95
Asp Phe Ile Ala Asn Gly Phe Asp Ser Glu Tyr Ala Asp Leu Phe Val
100 105 110
His Val Asp Lys Phe Gly Glu Ile Ser Pro Asp Asp Met Ala Lys Ile
115 120 125
His Ile Arg Lys Glu Lys Glu Pro Phe Arg Glu Val Thr Leu Ser Asp
130 135 140
Gly Thr Lys Thr Arg Val Trp Cys Thr Phe Thr Glu Gln Gln Ile Asp
145 150 155 160
Leu Asn Tyr Glu Ser Asp Leu Ala Tyr Gln Leu Met Glu Ser Tyr Ile
165 170 175
Gly Phe Leu Thr Ser Lys Gly Val Asn Leu Leu Arg Leu Asp Ala Phe
180 185 190
Gly Tyr Thr Thr Lys Arg Ile Gly Thr Ser Cys Phe Leu Val Glu Pro
195 200 205
Glu Val Tyr Gln Ile Leu Asp Trp Val Asn Gln Val Ala Leu Lys His
210 215 220
Gly Ala Glu Cys Leu Pro Glu Val His Asp His Thr Ser Tyr Gln Tyr
225 230 235 240
Ala Ile Ser Arg Arg Asn Met His Pro Tyr Gly Phe Ala Leu Pro Pro
245 250 255
Leu Leu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Ala Asn Ser Thr Tyr Leu Lys Asn
260 265 270
Trp Leu Arg Met Cys Pro Arg Asn Met Val Thr Val Leu Asp Thr His
275 280 285
Asp Gly Ile Cys Ile Pro Asp Val Glu Gly Val Leu Pro Asp Glu Lys
290 295 300
Ile Lys Val Leu Ile Asp Asn Ile Asp Ala Arg Ser Ala Asp Pro Ile
305 310 315 320
Met Arg Arg Ser Ala Ala Asn Ile His Ser Val Gly Ala Ile Tyr Gln
325 330 335
Leu Thr Cys Thr Phe Tyr Asp Ala Leu Met Gln Asn Asp Asp Ala Tyr
340 345 350
Ile Ala Ala Arg Ala Ile Gln Phe Phe Thr Pro Gly Ile Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Tyr Val Gly Leu Leu Ala Gly Cys Asn Asp His Glu Leu Met Glu
370 375 380
Gln Ser Gly Glu Leu Arg Asp Ile Asn Arg His Tyr Tyr Thr Leu Glu
385 390 395 400
Glu Val Glu Gln Asp Ile Gln Lys Pro Val Val Gln Arg Leu Leu Ser
405 410 415
Leu Met Lys Phe Arg Ser Asn Tyr Pro Ala Phe Asp Gly His Phe Glu
420 425 430
Leu Asn Tyr Ser Asn Asn Ser Ser Val Ala Met Ala Trp Arg His Gly
435 440 445
Asp Tyr Tyr Cys His Leu Phe Val Asp Leu Asn Phe Lys Thr Val Lys
450 455 460
Val Thr Tyr Thr Asp Val Glu Thr Gly Glu Thr Arg His Leu Glu Cys
465 470 475 480
<210> 2
<211> 1440
<212> DNA
<213> 黏附性海洋杆菌Marinobacter adhaerens
<400> 2
atgctgctga aaaacgctgt tcagctgatc tgctacccgg accgtatcgg taacaacctg 60
aaagacctgt acaccgttgt tgacacccac ctgtctgaag ctatcggtgg tctgcacatc 120
ctgccgttct tcccgtctaa cgctgacggt ggtttctctc cgctgaccca caaagaagtt 180
gacccgaaag ttggtacctg ggacgacatc gaagctttca ccgctaaata cgacctgtgc 240
gttgacctga ccgttaacca catctctgac gaatctccgg aattcaccga cttcatcgct 300
aacggtttcg actctgaata cgctgacctg ttcgttcacg ttgacaaatt cggtgaaatc 360
tctccggacg acatggctaa aatccacatc cgtaaagaaa aagaaccgtt ccgtgaagtt 420
accctgtctg acggtaccaa aacccgtgtt tggtgcacct tcaccgaaca gcagatcgac 480
ctgaactacg aatctgacct ggcttaccag ctgatggaat cttacatcgg tttcctgacc 540
tctaaaggtg ttaacctgct gcgtctggac gctttcggtt acaccaccaa acgtatcggt 600
acctcttgct tcctggttga accggaagtt taccagatcc tggactgggt taaccaggtt 660
gctctgaaac acggtgctga atgcctgccg gaagttcacg accacacctc ttaccagtac 720
gctatctctc gtcgtaacat gcacccgtac ggtttcgctc tgccgccgct gctgctgtac 780
tctctgctgg acgctaactc tacctacctg aaaaactggc tgcgtatgtg cccgcgtaac 840
atggttaccg ttctggacac ccacgacggt atctgcatcc cggacgttga aggtgttctg 900
ccggacgaaa aaatcaaagt tctgatcgac aacatcgacg ctcgttctgc tgacccgatc 960
atgcgtcgtt ctgctgctaa catccactct gttggtgcta tctaccagct gacctgcacc 1020
ttctacgacg ctctgatgca gaacgacgac gcttacatcg ctgctcgtgc tatccagttc 1080
ttcaccccgg gtatcccgca ggtttactac gttggtctgc tggctggttg caacgaccac 1140
gaactgatgg aacagtctgg tgaactgcgt gacatcaacc gtcactacta caccctggaa 1200
gaagttgaac aggacatcca gaaaccggtt gttcagcgtc tgctgtctct gatgaaattc 1260
cgttctaact acccggcttt cgacggtcac ttcgaactga actactctaa caactcttct 1320
gttgctatgg cttggcgtca cggtgactac tactgccacc tgttcgttga cctgaacttc 1380
aaaaccgtta aagttaccta caccgacgtt gaaaccggtg aaacccgtca cctggaatgc 1440
Claims (16)
1.一种突变位点和/或突变体，其特征在于，所述突变位点选自64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的一个或多个位置上突变，其中所述位置通过对应如SEQID NO:1所示的氨基酸序列编号；
优选的，所述突变位点和/或突变体选自64、96、125、127、143、166、217、236、386中的一个或多个位置上突变。
2.根据权利要求1的突变位点和/或突变体，其特征在于，其中所述突变位点和/或突变体选自64突变为F、C、A；96突变为K、M；106突变为S；125突变为I、L、E、P；127突变为A、S、L；143突变为A、P、E、K；166突变为P、A、R；167突变为K；185突变为K；217突变为L、I、V、Y；236突变为L、I、D；386突变为Q、T、G、H；中的一个或多个位置上包含取代；
优选的，所述突变位点和/或突变体选自64突变为F、C、A；96突变为K、M；125突变为I、L、E、P；127突变为A、S、L；143突变为A、P、E、K；166突变为P、A、R；217突变为L、I、V、Y；236突变为L、I、D；386突变为Q、T、G、H中的一个或多个位置上突变。
3.一种突变位点和/或突变体，其特征在于，所述突变位点选自48、50、61、119、321和438中的一个或多个位置上突变，其中所述位置通过对应如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号；
优选的，所述突变位点和/或突变体选自119、321和438中的一个或多个位置上突变。
4.根据权利要求3的突变位点和/或突变体，其特征在于，其中所述突变位点和/或突变体选自48突变为G；50突变为S；61突变为E；119突变为I、P、L、A；321突变为V、Y、I、K、L；438突变为F、D、P；中的一个或多个位置上包含取代；
优选的，所述突变位点和/或突变体选自119突变为I、P、L、A；321突变为V、Y、I、K、L；438突变为F、D、P中的一个或多个位置上突变。
5.一种组合的突变位点和/或突变体，其特征在于，其选自如下任何一种：
(1)权利要求1或2的两个以上的突变位点和/或突变体的组合；
(2)权利要求3或4的两个以上的突变位点和/或突变体的组合；或者
(3)权利要求1或2的至少一个的突变位点和/或突变体和权利要求3或4的至少一个的突变位点和/或突变体；
优选的，选自下列组：
(1)选自64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的两个以上的位置上突变的突变位点和/或突变体的组合，
或者
(2)选自48、50、61、119、321和438中的两个以上的位置上突变的突变位点和/或突变体的组合，
或者
(3)选自64、96、106、125、127、143、166、167、185、217、236、386中的一个或多个的位置上突变的突变位点和/或突变体，与选自48、50、61、119、321和438中的一个或多个的位置上突变的突变位点和/或突变体的组合；
更优选，选自64、96、125、127、143、166、217、236、386中的一个或多个位置上突变，和119、321、438中的一个或多个位置上突变；
最优选的，选自64突变为F、C、A；96突变为K、M；125突变为I、L、E、P；127突变为A、S、L；143突变为A、P、E、K；166突变为P、A、R；217突变为L、I、V、Y；236突变为L、I、D；386突变为Q、T、G、H；中的一个或多个位置上突变，
和
选自119突变为I、P、L、A；321突变为V、Y、I、K、L；438突变为F、D、P中的一个或多个位置上突变组合。
6.一种酶，其特征在于，其氨基酸序列含有权利要求1-4中任一所述的突变位点，和/或权利要求5所述的组合突变位点。
7.如权利要求6所述的酶，其特征在于，含有权利要求1-4中任一所述的突变位点的突变体，和/或权利要求5所述的组合突变位点的突变体。
8.一种催化生成甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，其体系中含有权利要求6或7所述的酶；优选的，在直链淀粉、支链淀粉、蔗糖、麦芽糊精和甘油为底物，制备甘油葡萄糖苷的体系；更有选的，在蔗糖和/或麦芽糊精为底物，制备甘油葡萄糖苷的体系。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的组合突变位点和/或突变体在含蔗糖和/或含麦芽糊精的体系中合成甘油葡萄糖苷。
优选地，当以蔗糖为原料制备甘油葡萄糖苷体系时，反应体系中还包括：蔗糖磷酸化酶，磷酸盐缓冲液，蔗糖和甘油。
优选地，所述蔗糖磷酸化酶来源于青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis，命名为BaSP，在UniProt上的编号为A0ZZH6，其在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选10U/mL；
其中，所述的酶在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选10U/mL；
所述磷酸盐缓冲液浓度1-100mM，优选50mM；蔗糖浓度为0.01-2mol/L，优选1mol/L；
所述甘油浓度为1-2.4mol/L，优选1.2mol/L。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，反应体系的反应温度为30-55℃，优选55℃；反应时间为1-48h，优选12h。
11.根据权利要求8-10中任一所述的方法，其特征在于，当以淀粉或麦芽糊精为原料制备甘油葡萄糖苷体系时，反应体系中还包括：异淀粉酶，葡聚糖磷酸化酶，4-α-葡聚糖转移酶，磷酸盐缓冲液，蔗糖和甘油。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述异淀粉酶(EC 3.2.1.68)，来源于超嗜热古菌Sulfurisphaera tokodaii，命名为StIA，基因在UniProt上的编号为Q973H3，在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选0.5U/mL；
所述葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，命名为TmGP，基因在KEGG上的编号为TM1168，在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选10U/mL；
所述4-α-葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis，命名为TlGT，基因在UniProt上的编号为O32462，在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选0.5U/mL；
其中权利要求6或7所述的酶在反应体系中用量为1-1000U/mL,优选10U/mL；
所述磷酸盐缓冲液浓度1-100mM，优选20mM；
所述淀粉或麦芽糊精浓度为0.01-150g/L，优选100g/L；
所述甘油浓度为0.001-1mol/L，优选0.6mol/L。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述反应体系反应温度为30-55℃，优选55℃；反应时间为1-48h，优选12h。
14.权利要求1-4中任一所述的突变位点和/或突变体和/或权利要求5所述的组合突变位点和/或突变体在制备甘油葡萄糖苷中的应用，优选的，将直链淀粉、支链淀粉、蔗糖、麦芽糊精和甘油为底物。
15.包含权利要求1-4中任一项的突变位点和/或突变体或者权利要求5的组合突变位点和/或突变体的表达载体和/或宿主细胞。
16.产生权利要求1-4中任一项所述的突变位点和/或突变体或者权利要求5的组合突变位点和/或突变体的方法，其特征在于，其包括定点突变和/或在合适的条件下在培养基中培养权利要求15的宿主细胞以产生所述的突变位点和/或突变体。
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| CN110438100A (zh) * | 2019-08-02 | 2019-11-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种生物催化合成甘油葡萄糖苷的方法 |
| CN113383072A (zh) * | 2018-10-29 | 2021-09-10 | 博努莫斯股份有限公司 | 酶法生产己糖 |
-
2021
- 2021-09-24 CN CN202111123160.1A patent/CN115851648A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012080100A1 (en) * | 2010-12-14 | 2012-06-21 | Universiteit Gent | Trehalose phosphorylases and their use in the biocatalytic production of trehalose-analogues and glycosyl phosphates |
| US20180216086A1 (en) * | 2014-09-10 | 2018-08-02 | Pfeifer & Langen GmbH & Co. KG | Cellobiose Phosphorylase |
| CN113383072A (zh) * | 2018-10-29 | 2021-09-10 | 博努莫斯股份有限公司 | 酶法生产己糖 |
| CN109576239A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-04-05 | 清华大学 | 耐热磷酸化酶及其应用 |
| CN110438100A (zh) * | 2019-08-02 | 2019-11-12 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种生物催化合成甘油葡萄糖苷的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YUANYUAN XIA: "Development of thermostable sucrose phosphorylase by semi-rational design for efficient biosynthesis of alpha-D-glucosylglycerol", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 105, 20 September 2021 (2021-09-20), pages 7309, XP037582735, DOI: 10.1007/s00253-021-11551-0 * |
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