CN113913481B - 甘露糖的生物制备方法 - Google Patents
甘露糖的生物制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113913481B CN113913481B CN202111513425.9A CN202111513425A CN113913481B CN 113913481 B CN113913481 B CN 113913481B CN 202111513425 A CN202111513425 A CN 202111513425A CN 113913481 B CN113913481 B CN 113913481B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mannose
- phosphate
- phosphatase
- amount
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108010045211 mannose-6-phosphate phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 claims abstract description 25
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 22
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 22
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 20
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 claims description 19
- 102000048193 Mannose-6-phosphate isomerases Human genes 0.000 claims description 18
- 108091000115 phosphomannomutase Proteins 0.000 claims description 18
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 17
- 102000009569 Phosphoglucomutase Human genes 0.000 claims description 16
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 claims description 16
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 16
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 claims description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 15
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 15
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 15
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 13
- 108020000161 polyphosphate kinase Proteins 0.000 claims description 13
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 claims description 12
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims description 10
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 108020000005 Sucrose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 9
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 5
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 claims description 4
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 238000005065 mining Methods 0.000 abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 7
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 7
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940045189 glucose-6-phosphate Drugs 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 4
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 3
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 3
- 102100025022 Mannose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 3
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 mannose derivative phosphate Chemical class 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101710137647 Cellobiose 2-epimerase Proteins 0.000 description 1
- DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N Clorprenaline hydrochloride Chemical compound O.Cl.CC(C)NCC(O)C1=CC=CC=C1Cl DBPRUZCKPFOVDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000160715 Sulfolobus tokodaii Species 0.000 description 1
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N beta-D-fructofuranose 6-phosphate Chemical compound OC[C@@]1(O)O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWGXPAPYGQALX-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000010205 computational analysis Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229960002160 maltose Drugs 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002703 mannose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N molybdate Chemical compound [O-][Mo]([O-])(=O)=O MEFBJEMVZONFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLAPMBHFAWRUQP-UHFFFAOYSA-L molybdic acid Chemical compound O[Mo](O)(=O)=O VLAPMBHFAWRUQP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000029584 urinary system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明人通过数据库挖掘筛选Thermotoga菌属的磷酸酶具有较高的活性和特异性的甘露糖6‑磷酸磷酸酶。由此本发明的目的在于筛选得到具有较高的活性和特异性的磷酸酶，通过多酶体系构建，能够高效的用于催化甘露糖6‑磷酸合成甘露糖。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及甘露糖生物制备方法。
背景技术
甘露糖是一种天然存在的六碳单糖，广泛存在水果、蔬菜、植物材料、甚至人体中。甘露糖是唯一用于在临床上的糖质营养素，可以用于治疗糖缺乏性糖蛋白综合征，具有抗尿路感染和抗肿瘤活性，同时甘露糖已被证实可作为益生元，不会提高血糖水平，而且甘露糖也是一种广泛用于皮肤护理产品的辅助保湿剂。因此，甘露糖在制药、化妆品、饮料、食品、乳制品、糖果和畜牧业中具有多种应用。然而，由于甘露糖售价高，限制其日常用品使用。
甘露糖制备方法主要集中在酸水解，化学异构和生物催化方法。酸水解法即酸解富含甘露聚糖的原料如酵母、咖啡渣、红藻、魔芋等，进一步分离获取，该方法收率较低。化学异构法以葡萄糖为原料，采用钼酸或钼酸盐为催化剂，进行差向异构后，再将异构得到的甘露糖与葡萄糖分离出来，转化率30%左右；生物催化法包括采用甘露糖异构酶将果糖转化为甘露糖，转化率为25%-30%之间，然而由于果糖和甘露糖色谱分离困难，且果糖成本较高，因此该方法较难大规模生产；采用纤维二糖2-差向异构酶可催化廉价葡萄糖转化为甘露糖，然而生物法转化率仅为15%。综上所述，上述异构法合成甘露糖，转化平衡是限制因素。也有相关研究报道采用D-甘露醇 ( 海带制碘工业的副产品 ) 在亚铁离子存在下，用过氧化氢氧化合成甘露糖，但是这种方法工艺复杂且收率较低。根据前期研究报道，文献（ABiomimetic Biotechnological Process for Converting Starch to Fructose:Thermodynamic and Evolutionary Considerations in Applied Enzymology.J. Am.Chem. SOC. 1992, 114, 6980-6987）公布了淀粉制备果糖6-磷酸路线，而果糖6-磷酸又可以经甘露糖6-磷酸异构酶合成甘露糖6-磷酸（Molecular characterization of a novelthermostable mannose-6-phosphateisomerase from Thermus thermophilus.Biochimie. 93 (2011) 1659e1667）,同时甘露糖6-磷酸还可以经磷酸酶转化合成甘露糖（Functional Diversity of Haloacid Dehalogenase SuperfamilyPhosphatases fromSaccharomyces cerevisiae. TheJournal of Biological Chemistry. 2015, 290(30):18678–18698）,因此，如果将三个反应过程进行组合，将构筑淀粉制备甘露糖的路线，而且该路线为热力学驱动路线，具有高转化率优势，将具有较强的应用前景。参照该思路，专利WO2018169957A1涉及该路线，同时公布了以淀粉、蔗糖等廉价原料合成甘露糖的方法，然而该专利文本中尚未明确说明所用磷酸酶的酶活性和特异性数据，尽管表述了采用多酶体系合成甘露糖实施例，但是尚未给出体系具体的转化率值，真实性缺乏可参考意义。专利CN201910126884.8公布了一种甘露糖6-磷酸磷酸酶和甘露糖制备方法，同样以淀粉、蔗糖、葡萄糖等廉价原料，通过构建磷酸化和脱磷酸化的体外多酶催化体系，实现转化合成甘露糖，转化率达到67%-93%；对于甘露糖的大规模、低成本制备具有较强的借鉴意义，然而该专利中涉及到的甘露糖6-磷酸磷酸酶存在活性低，仅为1.8 U/mg（Artificially designedroutes for the conversion of starch to value-added mannosyl compounds throughcoupling in vitro and in vivo metabolic engineering strategies. MetabolicEngineering, 2020, 61, 215-224.），导致反应体系中需要添加很多酶，才能实现高转化率；同时尽管CN201910126884.8专利中甘露糖转化率达到67%，但是体系中依然检测到一定量的副产物葡萄糖和果糖，因此，获得具有高催化活性和高底物特异性的甘露糖6-磷酸磷酸酶，对淀粉制备甘露糖至关重要。
发明内容
本发明人通过数据库挖掘比对，筛选了上百条基因，从中选出了Thermotoga菌属的具有较高的活性和特异性的甘露糖6-磷酸磷酸酶，由此本发明的目的在于筛选得到具有较高的活性和特异性的磷酸酶用于催化甘露糖6-磷酸合成甘露糖的方法。
本发明提供用甘露糖6-磷酸合成甘露糖的方法，其采用如下所述的甘露糖6-磷酸磷酸酶M6PP，催化甘露糖6-磷酸合成甘露糖。所述磷酸酶选自下述之一：WP_101513072.1、WP_101510852.1、WP_041843828.1、WP_012644897.1、WP_008192576.1、WP_165304640.1、WP_038054438.1、WP_012895992.1、WP_012310432.1、ABQ46309.1；或者通过选自下述核苷酸序列所示的磷酸酶基因通过重组表达获得的磷酸酶： SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQID NO.19、SEQ ID NO.20。
本发明进一步提供转化淀粉及淀粉衍生物制备甘露糖的方法，构建多级酶联催化反应体系，实现转化淀粉合成甘露糖。所述多级酶联催化反应体系包括葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶PGIMPI酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，异淀粉酶和4-葡聚糖转移酶，葡萄糖激酶，聚磷酸激酶和葡萄糖异构酶的酶组合；其中，所述甘露糖6-磷酸磷酸酶选自下述之一：WP_101513072.1、WP_101510852.1、WP_041843828.1、WP_012644897.1、WP_008192576.1、WP_165304640.1、WP_038054438.1、WP_012895992.1、WP_012310432.1、ABQ46309.1；或者通过选自下述核苷酸序列所示的磷酸酶基因通过重组表达获得的磷酸酶： SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20。
所述反应体系中，淀粉的浓度为1-500 g/L,磷酸盐浓度为1-100 mM,葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶为0.1-1000U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶用量为0.1-1000U/mL。
优选的淀粉浓度为100 g/L,磷酸盐浓度为20 mM, 葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶用量为10U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶10U/mL。
所述酶催化的反应条件为10-80℃，反应时间为1-120小时；优选为50℃，反应48-96小时。
为了进一步提升转化率，淀粉可经异淀粉酶处理或者直接添加至反应体系中，异淀粉酶的添加量为0.1-1000U/mL,优选0.5 U/mL。
进一步提升转化率，反应体系中可添加4-葡聚糖转移酶，4-葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL，优选0.5 U/mL。
为了进一步提升转化率，葡萄糖激酶，聚磷酸激酶和葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶的用量为0.1-1000U/mL,葡萄糖异构酶用量为0.1-1000U/mL,聚磷酸激酶用量为0.1-1000U/mL,优选葡萄糖激酶用量为0.5 U/mL，葡萄糖异构酶用量为0.5 U/mL，葡萄糖异构酶用量为0.5 U/mL。
本发明还提供一种体外多酶级联转化蔗糖合成甘露糖的方法，通过构建多酶级联催化反应体系，实现转化蔗糖合成甘露糖。所述多酶体系包含有蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶，聚磷酸激酶组成的酶组合；所述甘露糖6-磷酸磷酸酶选自下述之一：WP_101513072.1、WP_101510852.1、WP_041843828.1、WP_012644897.1、WP_008192576.1、WP_165304640.1、WP_038054438.1、WP_012895992.1、WP_012310432.1、ABQ46309.1；或者通过选自下述核苷酸序列所示的磷酸酶基因通过重组表达获得的磷酸酶： SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20。
所述反应体系中，蔗糖的浓度为1-500 g/L,磷酸盐浓度为1-100 mM,蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖异构酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖激酶用量为0.1-1000U/mL，聚磷酸激酶用量为0.1-1000U/mL。
优选的蔗糖的浓度为340 g/L,磷酸盐浓度为50 mM,蔗糖磷酸化酶用量为10 U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10 U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶用量为10 U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶10 U/mL，葡萄糖异构酶10 U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL，聚磷酸激酶用量为10 U/mL。
所述酶催化的反应条件为10-80℃，反应时间为1-120小时；优选为37℃，反应24小时。
本发明人通过数据库挖掘筛选Thermotoga菌属具有较高的活性和特异性的甘露糖6-磷酸磷酸酶，并经过实验进行验证表明其效果优异。此外，通过多酶体系的构建实现了能够高效的催化淀粉或蔗糖为底催化合成甘露糖，效果十分显著。
附图说明
图1 淀粉/麦芽糊精/蔗糖合成甘露糖技术路线。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell， David W.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物和基因由江苏金唯智生物技术有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 M6PP基因的获得和载体构建
通过数据库挖掘和功能表征，筛选获得了10个来源于Thermotoga菌属的磷酸酶是甘露糖6-磷酸磷酸酶，其氨基酸序列在NCBI中数据库的编号分别为WP_101513072.1（SEQID NO.1）、WP_101510852.1（SEQ ID NO.2）、WP_041843828.1（SEQ ID NO.3）、WP_012644897.1（SEQ ID NO.4）、WP_008192576.1（SEQ ID NO.5）、WP_165304640.1（SEQ IDNO.6）、WP_038054438.1（SEQ ID NO.7）、WP_012895992.1（SEQ ID NO.8）、WP_012310432.1（SEQ ID NO.9）、ABQ46309.1（SEQ ID NO.10）。
上述各甘露糖6-磷酸磷酸酶的氨基酸序列经密码子优化后，对应基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。基因序列为，送至江苏金唯智生物技术有限公司及基因合成，并构建至表达载体pET-21a中，分别得到表达型重组质粒pET-M6PP072、pET-M6PP852、pET-M6PP828、pET-M6PP897、pET-M6PP576、pET-M6PP640、pET-M6PP438、pET-M6PP992、pET-M6PP432、pET-M6PP309。
实施例2 基因的表达和纯化
将分别含有上述14个甘露糖6-磷酸磷酸酶基因的重组质粒转入大肠杆菌中，进行外源表达及纯化。
以其中数据库标号为WP_101513072.1的磷酸酶为例，
(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-M6PP072转入 E.coli BL21(DE3) 中，获得重组菌。
(2)挑单克隆至5mL LB 液体培养基中，37℃、220r/min 培养至OD600为 0.6-0.8。将 5mL LB 培养基中菌液转接至800mL 2YT 培养基中，37℃、220rpm 培养至OD600为0.6-0.8时，降温至16℃，加 IPTG 至终浓度0.5mM，诱导表达16h。
(3)将上述培养菌液收集到50 mL离心管中，5500r/min 离心15min；
(4)弃上清，用2 mL三乙醇胺缓冲液，pH 7.5，重悬菌体。
(5)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力 1200bar，4℃条件下进行破菌2 次。4℃、20000r/min 离心45min。
(6)纯化：上清在70℃水浴下热处理20分钟，4℃、20000r/min 离心45min，取上清即得纯蛋白。
实施例3 M6PP酶活性测定
针对上述纯化获得的M6PP，分别测定其针对甘露糖6-磷酸的脱磷酸活性，酶活性测定体系包括如下：甘露糖6-磷酸 （20mM），Mg2+（1mM）,磷酸盐缓冲液（pH 7.5,50 mM）,酶（0.5 mg/mL），55℃，反应10min。酶活性定义（1U）：每毫克M6PP每分钟催化生成甘露糖的量为1微摩尔。将样品进行高效液相色谱检测。
经计算分析获得M6PP的酶活性如表1所示，结果发现所筛选的10个磷酸酶WP_165304640.1；WP_041843828.1；ABQ46309.1；WP_012644897.1；WP_012310432.1；WP_038054438.1；WP_101510852.1；WP_008192576.1；WP_012895992.1和WP_101513072.1，其催化活性与专利CN201910126884.8公布的来源于海栖热袍菌Thermotoga maritima的M6PP（TmM6PP）（Q9WZB9）相比，均有不同程度提升。其中数据库编号为WP_165304640.1的磷酸酶催化甘露糖6-磷酸脱磷酸活性最高，达到4.0 U/mg，是TmM6PP酶活性的2.22倍。
表1酶活性测定结果
实施例4 体外多酶催化体系转化淀粉合成甘露糖
建立体外多酶催化体系转化麦芽糊精为甘露糖。体系中葡聚糖磷酸化酶GP，该酶催化麦芽糊精转化为葡萄糖1-磷酸；葡萄糖磷酸变位酶PGM,该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖磷酸异构酶PGI/PMI，可直接催化葡萄糖6-磷酸转化为甘露糖6-磷酸，甘露糖6-磷酸磷酸酶M6PP，催化甘露糖6-磷酸脱磷酸生成甘露糖；在本发明中，葡聚糖磷酸化酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的标号为TM1168，葡萄糖磷酸变位酶来源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的编号为TM0769；双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶PGI/MPI选择来源于Dictyoglomus thermophilum,其在UniProt上的标号为B5YEP3，磷酸酶M6PP选择数据库编号为WP_165304640.1的甘露糖6-磷酸磷酸酶。这些基因组DNA都可以从ATCC的官方网站（www.atcc.org）上获得。这四个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过酶切连接方法克隆到pET21载体中，获得相应的表达载体pET21-GP，pET21-PGM,pET21-PGI/MPI, pET21-M6PP。这五个质粒都转化至大肠杆菌BL21（DE3）（Invitrogen,Carlsbad,CA）中，并进行蛋白质表达和纯化。
为了提升转化率，体系中添加异淀粉酶IA，该酶催化淀粉脱支链生成直链淀粉；和4-葡聚糖转移酶，该酶催化麦芽二糖和麦芽三糖聚合生成长度聚合度更高的糊精，便于葡聚糖磷酸化酶GP进行催化。异淀粉酶来源于Sulfolobus tokodaii,基因在KEGG上的编号为ST0928,葡聚糖转移酶来源于Thermococcus litoralis,基因在KEGG上的编号为OCC_10078,上述两个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR扩增获取，并通过酶切连接方法克隆到表达载体pET21中，获得影响的重组表达载体pET21-IA和pET21-GT。这6个质粒都转化至大肠杆菌BL21（DE3）（Invitrogen,Carlsbad,CA）中，并进行蛋白质表达和纯化。
建立如下反应体系，30 mM磷酸缓冲液（pH 7.0），5 mM氯化镁，所述淀粉的浓度为100g/L,葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶PGIMPI用量为10U/mL，采用数据库编号为WP_165304640.1的甘露糖6-磷酸磷酸酶用量为10U/mL，异淀粉酶IA用量为0.5U/mL,葡聚糖转移酶4GT用量为0.5U/mL,在55℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
反应结束后，最终获得甘露糖58g/L，转化率为58%。
为了进一步提升转化率，反应体系中添加了葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶和聚磷酸激酶。葡萄糖异构酶来源于Thermus thermophilus，基因在Uniprot上的编号为P26997；葡萄糖激酶来源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的标号为Tfu_1811；聚磷酸激酶来源于Thermus thermophilus，基因在KEGG上的编号为TT_C0637；这些基因组DNA都可以从ATCC的官方网站（www.atcc.org）上获得。这三个基因分别用不同的引物从相应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过酶切连接方法克隆到pET21载体中，获得相应的表达载体pET21-GI，pET21-PPK和pET21-PPGK。
将上述三个酶加入到反应体系中，甘露糖产量提升至90±2.5g/L,最终转化率达到90±2.5%。
实施例5 体外多酶催化转化蔗糖合成甘露糖
建立体外多酶催化体系转化蔗糖为甘露糖。这些关键酶包括：（1）蔗糖磷酸化酶SP，该酶催化蔗糖转化为葡萄糖1-磷酸和果糖，（2）葡萄糖磷酸变位酶PGM，该酶催化1-磷酸葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖；（3）双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶PGIMPI，可直接催化葡萄糖6-磷酸转化为甘露糖6-磷酸；（4）甘露糖6-磷酸磷酸酶M6PP，该酶催化甘露糖6-磷酸脱磷酸生成甘露糖；（6）葡萄糖异构酶GI，该酶催化果糖转化为葡萄糖；（7）葡萄糖激酶GK，该酶催化葡萄糖转化为葡萄糖6磷酸；（8）聚磷酸激酶PPK，该酶催化多聚磷酸和ADP反应再生ATP。
在本发明中，蔗糖磷酸化酶来源于Bifidobacterium adolescentis，基因在KEGG上的标号为A0ZZH6，其氨基酸序列经密码子优化后，基因序列具有大肠杆菌偏爱密码子后，送至江苏金唯智生物技术有限公司及基因合成，并构建至表达载体pET-21a中。这个质粒都转化至大肠杆菌BL21（DE3）（Invitrogen,Carlsbad,CA）中，并进行蛋白质表达和纯化，其他的酶同实施例4。
建立如下反应体系，30 mM磷酸缓冲液（pH 7.0），5 mM氯化镁，5mM ATP，250mM聚磷酸，所述蔗糖的浓度为100 g/L, 蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶PGIMPI用量为10U/mL，采用数据库编号为WP_165304640.1的甘露糖6-磷酸磷酸酶用量为10U/mL，葡萄糖异构酶用量为10U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL，聚磷酸激酶用量为10U/mL，在50℃进行催化反应，反应24小时，反应最终样品进行液相色谱检测。
反应结束后，最终获得甘露糖85±1.8g/L，转化率85±1.8%。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 甘露糖的生物制备方法
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 1
MYRVFVFDLDGTLFNDNLEISEKDKAAIEKISKKCHVVFASGRMLVSTLNVEKRYFKRTFPTIAYNGAMVYLPDEGVVLNEKIPPEVAKKVVEYIKSFNVHWQAYIDDVLYSEKDNEEIRSYAKHSSVDYRVEPNLFDLVSKVGTTKILLIDTPERLDELKEILSERFKDVVKVFKSFPTYLEIVPKNVDKGKALRFLRERMNWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIEKVKEASDIVTLTNNDSGVSHVLERISTDCFDE 268
<210> 2
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 2
MYKVFVFDLDGTLLNDNLEISKRDREALEKLSKKCSIVFASGRMLVSTLNVEKKYFNKTFPTIAYNGAMIYIPEEGIVLNKKIPPEIAREIVEYIRSLNVHWQAYIDDVLYSEKDNEEIKGYAKHSSVDYRVEPKLSDLVSKVGTTKLLLIDSPERLDGLKEILSKRFEGSVKVFKSFPTYLEIVPKDVDKGKALNFLREKMGWQKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLKVAMGNAIDKVKEAADIVTLTNNDSGVSHVLERILADCFDE 268
<210> 3
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 3
MYRVFVFDLDGTLLNDNLEISEKDRETIEKLSRKCHVVFASGRMLVSTLNVEKKYFKRTFPTIAYNGAMVYLPEEGVILNEKIPPEVAKDIIEYIKPLNVHWQAYIDDVLYSEKDNEEIKSYARHSNVDYRVEPNLSELVSKMGTTKLLLIDTPERLDELKEILSERFKDVVKVFKSFPTYLEIVPKNVDKGKALKFLRERMNWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMENAIEKVKEASDIVTLTNNDSGVSYVLERISTDCLDE 268
<210> 4
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 4
MYRVFVFDLDGTLLNDSLEISEKDRKVIERLSRNCHVVFASGRMLVSTLNVEKRYFKRTFPTIAYNGAMVYLPEEGVVLNEKIPPEVAKDIIEYIKPLNVHWQAYIDDVLYSEKDNEEIKSYARHSNVDYRVEPNLSELVSKMGTTKLLLIDTPERLDELKEILSERFKDVVKVFKSFPTYLEIVPKNVDKGKALKFLRGRMNWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIDKVKEAADVVTLTNNDSGVSYVLERISTDCLDE 268
<210> 5
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 5
MYRVFVFDLDGTLLNDNLEISEKDRKVIERLSRKCHVVFASGRMLVSTLNVEKKYFGRTFPTIAYNGAMVYIPEEGVILNEKISPEVAKDIVEYIKPFNVHWQAYIDDVLYSERDNEEIRGYAKHSSVEYRVEPNLLELVSKVGTTKILLIDTPEKLDELKKILSEKFNNVVKVFKSFPTYLEIVPKSVDKGKALRFLRERMGWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIEKVKEASDIVTLTNNDSGVSYVLERISTDCLDE 268
<210> 6
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 6
MYRVFVFDLDGTLLNDNLEISEKDRKVIERLSRKCHVVFASGRMLVSTLNVEKKYFGRTFPTIAYNGAMVYIPEEGVILNEKISPEVAKDIVEYIKPFNVHWQAYIDDVLYSERDNEEIRGYAKHSSVEYRVEPNLLELVSKVGTTKILLIDTPERLDELKKILSEKFNDVVKVFKSFPTYLEIVPENVDKGKALRFLRERMGWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIDKVKEAADVVTLTNNDSGVSYVLELISTDCLDG 268
<210> 7
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 7
MYRVFVFDLDGTLLNDNLEISEKDRKVIEKLSRKCHVVFASGRMLVSTLNVEKKYFGRTFPTIAYNGAMVYLPEEGVILNEKIPPEVAKDIVEYVKQFNVHWQAYIDDVLYSKRDSEEIRGYAKHSSVEYRVEPNLLELVSKVGTTKILLIDTPERLDELKKILSEKFNDVVKVFKSFPTYLEIVPENVDKGKALRFLRERMGWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIDKVKEAADVVTLTNNDSGVSYVLELISTDCLDG 268
<210> 8
<211> 267
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 8
MYRVFVFDLDGTLLNDSLEISEKDRRAIERLSRKCRVVFASGRMLVSTLNVEKKYFGRTFPTIAYNGAMVYIPEEGVILNEKIPPEVAKDIVEYVKQFNVHWQAYIDDVLYSEKDNEEIRGYAKHSSVEYRVEPKLLELVSKVGTTKILLIDTPEKLDELKKILLEKFNNVVKVFKSFPTYLEIVPENVDKGKALRFLRERMGWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIDKVKEAADVVTLTNNDSGVSHVLELISTDCLD 267
<210> 9
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 9
MYRVFVFDLDGTLLNDSLEISEKDRKVIERLSRNCHVVFASGRMLVSTLNVEKKYFGRTFPTIAYNGAMVYIPEEGVILNEKIPPEVAKDIVEYVKQFNVHWQAYIDDVLYSEKDNEEIRGYAKHSSVEYRVEPKLLELVSKVGTTKILLIDTPEKLDELKKILLEKFNNVVKVFKSFPTYLEIVPENVDKGKALRFLRERMGWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIDKVKEAADVVTLTNNDSGVSHVLERISTDCLDG 268
<210> 10
<211> 264
<212> PRT
<213> Thermotoga
<400> 10
MFVFDLDGTLLNDSLEISEKDRRAIERLSRKCRVVFASGRMLVSTLNVEKKYFGRTFPTIAYNGAMVYIPEEGVILNEKIPPEVAKDIVEYVKQFNVHWQAYIDDVLYSEKDNEEIRGYAKHSSVEYRVEPKLLELVSKVGTTKILLIDTPEKLDELKKILLEKFNNVVKVFKSFPTYLEIVPENVDKGKALRFLRERMGWKKEEIVVFGDNENDLFMFEEAGLRVAMGNAIDKVKEAADVVTLTNNDSGVSHVLELISTDCLD 264
<210> 11
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 11
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGTTCAACGACAACCTGGAAATCTCTGAAAAAGACAAAGCTGCTATCGAAAAAATCTCTAAAAAATGCCACGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAACGTTACTTCAAACGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACCTGCCGGACGAAGGTGTTGTTCTGAACGAAAAAATCCCGCCGGAAGTTGCTAAAAAAGTTGTTGAATACATCAAATCTTTCAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAAAAAGACAACGAAGAAATCCGTTCTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGACTACCGTGTTGAACCGAACCTGTTCGACCTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAAATCCTGCTGATCGACACCCCGGAACGTCTGGACGAACTGAAAGAAATCCTGTCTGAACGTTTCAAAGACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGAAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGCGTTTCCTGCGTGAACGTATGAACTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGAAAAAGTTAAAGAAGCTTCTGACATCGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTCACGTTCTGGAACGTATCTCTACCGACTGCTTCGACGAATAA 807
<210> 12
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 12
ATGTACAAAGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACAACCTGGAAATCTCTAAACGTGACCGTGAAGCTCTGGAAAAACTGTCTAAAAAATGCTCTATCGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCAACAAAACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGATCTACATCCCGGAAGAAGGTATCGTTCTGAACAAAAAAATCCCGCCGGAAATCGCTCGTGAAATCGTTGAATACATCCGTTCTCTGAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAAAAAGACAACGAAGAAATCAAAGGTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGACTACCGTGTTGAACCGAAACTGTCTGACCTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAACTGCTGCTGATCGACTCTCCGGAACGTCTGGACGGTCTGAAAGAAATCCTGTCTAAACGTTTCGAAGGTTCTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGAAAGACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGAACTTCCTGCGTGAAAAAATGGGTTGGCAGAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGAAAGTTGCTATGGGTAACGCTATCGACAAAGTTAAAGAAGCTGCTGACATCGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTCACGTTCTGGAACGTATCCTGGCTGACTGCTTCGACGAATAA 807
<210> 13
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 13
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACAACCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTGAAACCATCGAAAAACTGTCTCGTAAATGCCACGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCAAACGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACCTGCCGGAAGAAGGTGTTATCCTGAACGAAAAAATCCCGCCGGAAGTTGCTAAAGACATCATCGAATACATCAAACCGCTGAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAAAAAGACAACGAAGAAATCAAATCTTACGCTCGTCACTCTAACGTTGACTACCGTGTTGAACCGAACCTGTCTGAACTGGTTTCTAAAATGGGTACCACCAAACTGCTGCTGATCGACACCCCGGAACGTCTGGACGAACTGAAAGAAATCCTGTCTGAACGTTTCAAAGACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGAAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGAAATTCCTGCGTGAACGTATGAACTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGAAAACGCTATCGAAAAAGTTAAAGAAGCTTCTGACATCGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTTACGTTCTGGAACGTATCTCTACCGACTGCCTGGACGAATAA 807
<210> 14
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 14
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACTCTCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTAAAGTTATCGAACGTCTGTCTCGTAACTGCCACGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAACGTTACTTCAAACGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACCTGCCGGAAGAAGGTGTTGTTCTGAACGAAAAAATCCCGCCGGAAGTTGCTAAAGACATCATCGAATACATCAAACCGCTGAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAAAAAGACAACGAAGAAATCAAATCTTACGCTCGTCACTCTAACGTTGACTACCGTGTTGAACCGAACCTGTCTGAACTGGTTTCTAAAATGGGTACCACCAAACTGCTGCTGATCGACACCCCGGAACGTCTGGACGAACTGAAAGAAATCCTGTCTGAACGTTTCAAAGACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGAAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGAAATTCCTGCGTGGTCGTATGAACTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGACAAAGTTAAAGAAGCTGCTGACGTTGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTTACGTTCTGGAACGTATCTCTACCGACTGCCTGGACGAATAA 807
<210> 15
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 15
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACAACCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTAAAGTTATCGAACGTCTGTCTCGTAAATGCCACGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCGGTCGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACATCCCGGAAGAAGGTGTTATCCTGAACGAAAAAATCTCTCCGGAAGTTGCTAAAGACATCGTTGAATACATCAAACCGTTCAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAACGTGACAACGAAGAAATCCGTGGTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGAATACCGTGTTGAACCGAACCTGCTGGAACTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAAATCCTGCTGATCGACACCCCGGAAAAACTGGACGAACTGAAAAAAATCCTGTCTGAAAAATTCAACAACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGAAATCTGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGCGTTTCCTGCGTGAACGTATGGGTTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGAAAAAGTTAAAGAAGCTTCTGACATCGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTTACGTTCTGGAACGTATCTCTACCGACTGCCTGGACGAATAA 807
<210> 16
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 16
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACAACCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTAAAGTTATCGAACGTCTGTCTCGTAAATGCCACGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCGGTCGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACATCCCGGAAGAAGGTGTTATCCTGAACGAAAAAATCTCTCCGGAAGTTGCTAAAGACATCGTTGAATACATCAAACCGTTCAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAACGTGACAACGAAGAAATCCGTGGTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGAATACCGTGTTGAACCGAACCTGCTGGAACTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAAATCCTGCTGATCGACACCCCGGAACGTCTGGACGAACTGAAAAAAATCCTGTCTGAAAAATTCAACGACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGGAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGCGTTTCCTGCGTGAACGTATGGGTTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGACAAAGTTAAAGAAGCTGCTGACGTTGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTTACGTTCTGGAACTGATCTCTACCGACTGCCTGGACGGTTAA 807
<210> 17
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 17
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACAACCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTAAAGTTATCGAAAAACTGTCTCGTAAATGCCACGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCGGTCGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACCTGCCGGAAGAAGGTGTTATCCTGAACGAAAAAATCCCGCCGGAAGTTGCTAAAGACATCGTTGAATACGTTAAACAGTTCAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTAAACGTGACTCTGAAGAAATCCGTGGTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGAATACCGTGTTGAACCGAACCTGCTGGAACTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAAATCCTGCTGATCGACACCCCGGAACGTCTGGACGAACTGAAAAAAATCCTGTCTGAAAAATTCAACGACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGGAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGCGTTTCCTGCGTGAACGTATGGGTTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGACAAAGTTAAAGAAGCTGCTGACGTTGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTTACGTTCTGGAACTGATCTCTACCGACTGCCTGGACGGTTAA 807
<210> 18
<211> 804
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 18
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACTCTCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTCGTGCTATCGAACGTCTGTCTCGTAAATGCCGTGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCGGTCGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACATCCCGGAAGAAGGTGTTATCCTGAACGAAAAAATCCCGCCGGAAGTTGCTAAAGACATCGTTGAATACGTTAAACAGTTCAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAAAAAGACAACGAAGAAATCCGTGGTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGAATACCGTGTTGAACCGAAACTGCTGGAACTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAAATCCTGCTGATCGACACCCCGGAAAAACTGGACGAACTGAAAAAAATCCTGCTGGAAAAATTCAACAACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGGAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGCGTTTCCTGCGTGAACGTATGGGTTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGACAAAGTTAAAGAAGCTGCTGACGTTGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTCACGTTCTGGAACTGATCTCTACCGACTGCCTGGACTAA 804
<210> 19
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 19
ATGTACCGTGTTTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACTCTCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTAAAGTTATCGAACGTCTGTCTCGTAACTGCCACGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCGGTCGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACATCCCGGAAGAAGGTGTTATCCTGAACGAAAAAATCCCGCCGGAAGTTGCTAAAGACATCGTTGAATACGTTAAACAGTTCAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAAAAAGACAACGAAGAAATCCGTGGTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGAATACCGTGTTGAACCGAAACTGCTGGAACTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAAATCCTGCTGATCGACACCCCGGAAAAACTGGACGAACTGAAAAAAATCCTGCTGGAAAAATTCAACAACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGGAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGCGTTTCCTGCGTGAACGTATGGGTTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGACAAAGTTAAAGAAGCTGCTGACGTTGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTCACGTTCTGGAACGTATCTCTACCGACTGCCTGGACGGTTAA 807
<210> 20
<211> 795
<212> DNA
<213> Thermotoga
<400> 20
ATGTTCGTTTTCGACCTGGACGGTACCCTGCTGAACGACTCTCTGGAAATCTCTGAAAAAGACCGTCGTGCTATCGAACGTCTGTCTCGTAAATGCCGTGTTGTTTTCGCTTCTGGTCGTATGCTGGTTTCTACCCTGAACGTTGAAAAAAAATACTTCGGTCGTACCTTCCCGACCATCGCTTACAACGGTGCTATGGTTTACATCCCGGAAGAAGGTGTTATCCTGAACGAAAAAATCCCGCCGGAAGTTGCTAAAGACATCGTTGAATACGTTAAACAGTTCAACGTTCACTGGCAGGCTTACATCGACGACGTTCTGTACTCTGAAAAAGACAACGAAGAAATCCGTGGTTACGCTAAACACTCTTCTGTTGAATACCGTGTTGAACCGAAACTGCTGGAACTGGTTTCTAAAGTTGGTACCACCAAAATCCTGCTGATCGACACCCCGGAAAAACTGGACGAACTGAAAAAAATCCTGCTGGAAAAATTCAACAACGTTGTTAAAGTTTTCAAATCTTTCCCGACCTACCTGGAAATCGTTCCGGAAAACGTTGACAAAGGTAAAGCTCTGCGTTTCCTGCGTGAACGTATGGGTTGGAAAAAAGAAGAAATCGTTGTTTTCGGTGACAACGAAAACGACCTGTTCATGTTCGAAGAAGCTGGTCTGCGTGTTGCTATGGGTAACGCTATCGACAAAGTTAAAGAAGCTGCTGACGTTGTTACCCTGACCAACAACGACTCTGGTGTTTCTCACGTTCTGGAACTGATCTCTACCGACTGCCTGGACTAA 795
Claims (15)
1.一种来源于Thermotoga菌属的磷酸酶在催化甘露糖6-磷酸合成甘露糖中的应用，其特征在于，所述磷酸酶是 WP_165304640.1；
或者通过SEQ ID NO.16所示的苷酸序列的磷酸酶基因通过重组表达获得的磷酸酶。
2.一种用甘露糖6-磷酸合成甘露糖的方法，其特征在于，以甘露糖6-磷酸为底物，采用下述磷酸酶进行催化反应，获得甘露糖；
所述磷酸酶是WP_165304640.1；
或者通过选自SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的磷酸酶基因通过重组表达获得的磷酸酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，反应体系中含甘露糖6-磷酸、Mg2+,所述磷酸酶，在磷酸盐缓冲液中于50-60℃，反应5-20min。
4.一种用淀粉或淀粉衍生物制备甘露糖的方法，其特征在于，通过构建多级酶联催化反应体系，将淀粉或淀粉衍生物合成甘露糖；其中，所述多级酶联催化反应体系包括葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，异淀粉酶和4-葡聚糖转移酶的组合；其中所述甘露糖6-磷酸磷酸酶是WP_165304640.；
或者通过SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的磷酸酶基因通过重组表达获得的磷酸酶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在反应体系中，淀粉的浓度为1-500 g/L,磷酸盐浓度为1-100 mM,葡聚糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶为0.1-1000U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶用量为0.1-1000U/mL。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在反应体系中，淀粉的浓度为100 g/L,磷酸盐浓度为20 mM, 葡聚糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶用量为10U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶10U/mL。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，反应的条件为10-80℃，反应时间为1-120小时。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，反应的条件为50℃，反应48-96小时。
9.如权利要求5-8任一项所述的方法，淀粉经异淀粉酶处理后添加至反应体系中，异淀粉酶的添加量为0.1-1000U/mL。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，反应体系中还添加4-葡聚糖转移酶，4-葡聚糖转移酶用量为0.1-1000U/mL。
11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，反应体系中还添加葡萄糖激酶，聚磷酸激酶和葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶的用量为0.1-1000U/mL,葡萄糖异构酶用量为0.1-1000U/mL,聚磷酸激酶用量为0.1-1000U/mL。
12.一种用蔗糖制备甘露糖的方法，其特征在于，通过构建多级酶联催化反应体系，将淀粉或淀粉衍生物合成甘露糖；其中，所述多级酶联催化反应体系包括蔗糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖激酶，聚磷酸激酶组成的酶组合的组合；其中所述甘露糖6-磷酸磷酸酶是WP_165304640.1；
或者通过SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的磷酸酶基因通过重组表达获得的磷酸酶。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在反应体系中，蔗糖的浓度为1-500 g/L，磷酸盐浓度为1-100 mM，蔗糖磷酸化酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为0.1-1000U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶用量为0.1-1000U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖异构酶用量为0.1-1000U/mL，葡萄糖激酶用量为0.1-1000U/mL，聚磷酸激酶用量为0.1-1000U/mL。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在反应体系中，蔗糖的浓度为340 g/L，磷酸盐浓度为50 mM，蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，双功能酶葡萄糖磷酸异构酶/甘露糖6-磷酸异构酶用量为10U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶10U/mL，葡萄糖异构酶10U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL，聚磷酸激酶用量为10U/mL。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，反应的条件为10-80℃，反应时间为1-120小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111513425.9A CN113913481B (zh) | 2021-12-13 | 2021-12-13 | 甘露糖的生物制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111513425.9A CN113913481B (zh) | 2021-12-13 | 2021-12-13 | 甘露糖的生物制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113913481A CN113913481A (zh) | 2022-01-11 |
| CN113913481B true CN113913481B (zh) | 2022-03-25 |
Family
ID=79248934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111513425.9A Active CN113913481B (zh) | 2021-12-13 | 2021-12-13 | 甘露糖的生物制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113913481B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114645070B (zh) * | 2022-02-28 | 2022-12-20 | 北京焉支山科技有限公司 | 一种己糖-6-磷酸组合物的制备方法及其在化妆品中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018169957A1 (en) * | 2017-03-13 | 2018-09-20 | Bonumose Llc | Enzymatic production of hexoses |
| CN109750011A (zh) * | 2019-02-20 | 2019-05-14 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种甘露糖6-磷酸磷酸酶及甘露糖生物制备方法 |
| CN113122592A (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-16 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种淀粉或其衍生物的酶法催化利用方法 |
| CN113544264A (zh) * | 2019-02-12 | 2021-10-22 | 博努莫斯股份有限公司 | 甘露糖的酶法生产 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9012723B2 (en) * | 2009-01-16 | 2015-04-21 | Monsanto Technology Llc | Isolated novel acid and protein molecules from soy and methods of using those molecules to generate transgene plants with enhanced agronomic traits |
-
2021
- 2021-12-13 CN CN202111513425.9A patent/CN113913481B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018169957A1 (en) * | 2017-03-13 | 2018-09-20 | Bonumose Llc | Enzymatic production of hexoses |
| CN113544264A (zh) * | 2019-02-12 | 2021-10-22 | 博努莫斯股份有限公司 | 甘露糖的酶法生产 |
| CN109750011A (zh) * | 2019-02-20 | 2019-05-14 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种甘露糖6-磷酸磷酸酶及甘露糖生物制备方法 |
| CN113122592A (zh) * | 2019-12-30 | 2021-07-16 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种淀粉或其衍生物的酶法催化利用方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Cof-type HAD-IIB family hydrolase [Thermotoga sp. SG1];NCBI Reference Sequence: WP_101513072.1;《NCBI》;20210516;1-2 * |
| Phosphate sugar isomerases and their potential for rare sugar bioconversion;Soo-Jung Kim等;《Journal of Microbiology》;20201231;第58卷(第9期);725-733 * |
| 甘蔗基蔗糖高附加值利用的研究进展;田朝玉等;《广西科学》;20200215(第01期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113913481A (zh) | 2022-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109750011B (zh) | 一种甘露糖6-磷酸磷酸酶及甘露糖生物制备方法 | |
| KR101185788B1 (ko) | 락토-ｎ-비오스ｉ 또는 갈락토-ｎ-비오스의 제조방법 | |
| Chen et al. | Wide sugar substrate specificity of galactokinase from Streptococcus pneumoniae TIGR4 | |
| CN110438100B (zh) | 一种生物催化合成甘油葡萄糖苷的方法 | |
| CN112159831B (zh) | 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法 | |
| US9102922B2 (en) | Trehalose phosphorylases and their use in the biocatalytic production of trehalose-analogues and glycosyl phosphates | |
| CN107988286A (zh) | 一种全细胞催化制备塔格糖的方法 | |
| KR20210031678A (ko) | 글루코사민의 효소적 제조 방법 | |
| CN112301012B (zh) | 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法 | |
| CN113604454A (zh) | 一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备果糖中的应用 | |
| CN113913481B (zh) | 甘露糖的生物制备方法 | |
| CN113122519B (zh) | 一种耐热6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶突变体及其应用 | |
| CN112961890A (zh) | 烟酰胺单核苷酸的酶促合成方法 | |
| CN112608910A (zh) | 烟酰胺核糖激酶及其应用 | |
| CN113583997B (zh) | 一种磷酸酶突变体及在催化麦芽糊精制备甘露糖中的应用 | |
| CN111041018A (zh) | 支链酮糖的生物合成方法 | |
| KR100922085B1 (ko) | Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법 | |
| CN106222211B (zh) | 1,6-二磷酸果糖的制备方法 | |
| CN114774379B (zh) | 一种热稳定性提高的羰基还原酶突变体 | |
| CN115109770A (zh) | 苯甲醛裂解酶突变体及在制备1，4-二羟基-2-丁酮中的应用 | |
| Mizanur et al. | Recombinant production and biochemical characterization of a hyperthermostable α-glucan/maltodextrin phosphorylase from Pyrococcus furiosus | |
| CN111549013A (zh) | 一种atp依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用 | |
| CN112921025A (zh) | 一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN111793664A (zh) | 一种生物制备甘露糖甘油酸的方法 | |
| CN112437813A (zh) | 酶法工业化生产nad的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230822 Address after: Building 1-201-A218, Building 8, Huiying Industrial Park, No. 86 Zhonghuan West Road, Tianjin Binhai New Area Pilot Free Trade Zone (Airport Economic Zone), 300000 Patentee after: Tiangong Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd. Address before: No.32, Xiqi Road, Airport Economic Zone, Binhai New Area, Tianjin 300308 Patentee before: TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230907 Address after: Building 1-201-4, Building 8, Huiying Industrial Park, No. 86 Zhonghuan West Road, Tianjin Binhai New Area Pilot Free Trade Zone (Airport Economic Zone), 300000 Patentee after: Tianjin Yihe Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Building 1-201-A218, Building 8, Huiying Industrial Park, No. 86 Zhonghuan West Road, Tianjin Binhai New Area Pilot Free Trade Zone (Airport Economic Zone), 300000 Patentee before: Tiangong Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd. |