KR20210031678A - 글루코사민의 효소적 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 글루코사민의 제조 방법을 제공하고, 특히 체외 효소 촉매화를 통해 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이고, 글루코사민의 효소 촉매화 제조 분야에 속한다. 상기 방법은, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제(glucosamine-6-phosphate deaminase, EC 3.5.99.6, GlmD) 촉매화를 이용하여 프룩토오스-6-포스페이트(F6P) 및 암모늄염을 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)로 전환시키는 단계; 및 탈인산화할 수 있는 효소 촉매화 GlcN6P 탈인산화를 이용하여 글루코사민(GlcN)을 생성하는 단계를 포함한다.
Description
본원 발명은 2018년 7월 13일에 중국 국가지식산권국에 제출한 출원번호가 201810772487.3이고 발명의 명칭이 “글루코사민의 효소적 제조 방법”인 선출원의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 모든 내용은 인용 방식을 통해 본원 발명에 결합된다.
본 발명은 글루코사민의 제조 방법에 관한 것으로, 특히 체외 효소 촉매화를 통해 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이고, 글루코사민의 효소 촉매화 제조 분야에 속한다.
글루코사민은 D-글루코스 분자 중 2 부위의 히드록시기가 아미노기에 의해 치환된 후의 화합물로서, 중요한 기능성 단당류이다. 글루코사민은 세균, 효모, 사상성진균, 식물 및 동물을 포함한 거의 모든 유기체에 존재하는 것으로, 당 단백질과 프로테오글리칸의 주요 조성성분이고, 동시에 키토산과 키딘의 주요 조성성분이기도 하다.
글루코사민 및 이의 유도체는 매우 광범위하게 응용되는데, 의약, 식품, 화장품 등 분야에서 모두 중요한 용도를 가지고 있다. 의약 산업에서, 글루코사민 황산염은 연골 프로테오글리칸의 생물 합성을 자극하여 항-류머티즘성관절염을 치료하는 원료약으로 사용될 수 있고; 식품 산업에서, 글루코사민은 체내에서 생성된 라디칼, 노화방지, 체중감소 촉진, 세균 발육 억제 및 인체 내분비 조절 등 다양한 생리적 기능을 가지므로, 식품 첨가제 및 건강식품의 생산에 사용되며; 화장품 산업에서, 아세틸 글루코사민(GlcNAc)은 히알루론산의 단량체로서, 현재 고급 화장품에서 필수적인 물질이다.
현재, 글루코사민을 생산하는 방법은 주로 2가지이다. (1) 키틴산 가수분해법 및 키티나아제 가수분해법을 포함하는 키틴 가수분해법. 여기서, 키틴산 가수분해법은 가장 흔히 사용되는 글루코사민 생산 방법으로, 상기 방법은 먼저 고농도의 염산으로 키틴질을 가수분해하여 아세틸 글루코사민을 얻고, 다음 아세틸 글루코사민을 탈아셀틸화하여 글루코사민을 얻는다. 상기 생산 방법은 원료 공급의 영향을 받고, 산 처리로 인해 생성되는 폐수는 심각한 환경 오염을 야기할 수 있으며, 이 밖에, 새우와 게 알레르기가 있는 일부 사람들은 상기 방법으로 제조된 글루코사민을 섭취하면 알레르기 반응을 일으킬 수 있다. 키티나아제 가수분해법은 키틴을 원료로 하고, 키티나아제의 작용 하에 가수분해 반응하여 단량체 글루코사민을 생성한다. 상기 방법은 비록 환경에 대한 오염이 비교적 작지만, 마찬가지로 원료 공급, 생산 강도가 낮으며, 알레르기 반응을 일으키는 등 요소의 제한을 받는다. (2) 미생물 발효법, 주로 대장균, 바실러스 서브틸리스 등 엔지니어링 박테리아를 이용하여 글루코스 등 원료를 대사시켜 글루코사민을 생산한다. 상기 방법은 원료 유래 제한을 받지 않고, 발효 시간이 짧으며, 환경 오염이 적고, 인체에 대한 안전성 등 장점을 가지지만, 미생물 엔지니어링 박테리아 대사 개선이 어렵고 대사 부산물이 쉽게 생성되는 등 단점이 존재한다.
따라서, 저비용, 저공해로 글루코사민을 생산하는 신규 방법의 개발이 시급하다.
본 발명은 체외(in vitro) 효소적 제조 방법을 통해 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 체외 효소 반응계 촉매화를 통해 글루코사민을 생성함으로써, 상기 방법은 원료가 저렴하고 원료가 풍부하며 생산 원가가 낮고 친환경적이며 인체에 대해 안전성 등 장점을 가진다.
본 발명은 하기와 같은 기술적 해결수단을 통해 구현된다.
본 발명은, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제(glucosamine-6-phosphate deaminase, EC 3.5.99.6, GlmD) 촉매화를 이용하여 프룩토오스-6-포스페이트(F6P) 및 암모늄염을 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)로 전환시키는 단계; 및 탈인산화할 수 있는 효소 촉매화 GlcN6P 탈인산화를 이용하여 글루코사민(GlcN)을 생성하는 단계를 포함하는 체외 효소 촉매화 반응을 이용하여 글루코사민을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 다양한 암모늄염이 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 암모늄염은 황산암모늄, 염화암모늄, 황산수소암모늄, 질산암모늄, 탄산암모늄, 탄산수소암모늄 중 하나, 둘 또는 둘 이상의 임의의 혼합물로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 상기 방법은 포스포글루코스 이소머라제(phosphoglucose isomerase, EC 5.3.1.9, PGI) 촉매화를 이용하여 글루코스-6-포스페이트(G6P)를 F6P로 전환시키는 반응 단계를 더 포함한다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 상기 방법은 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2, PGM) 촉매화를 이용하여 글루코스-1-포스페이트(G1P)를 G6P로 전환시키는 반응 단계를 더 포함한다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 상기 방법은 기질 및 인산염을 G1P로 전환시킬 수 있는 효소 촉매화를 이용하여 기질 및 인산염을 G1P로 전환시키는 반응 단계를 더 포함하고, 상기 기질은 D-글루코스 유닛을 포함하는 이당류, 다당류 또는 이들의 임의의 혼합물이다.
본 발명에 따르면, 다양한 인산염은 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 인산염은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이인산나트륨, 인산수소이나트륨 중 하나, 둘 또는 둘 이상의 임의의 혼합물로부터 선택된다. 더 바람직하게, 인산염은 인산이수소칼륨 및/또는 인산수소이칼륨으로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 이당류는 수크로스이고, 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7, SP) 촉매화를 이용하여 이와 인산염을 G1P로 전환시킨다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 다당류는 전분, 전분 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물로부터 선택되고, α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase, EC 2.4.1.1, αGP) 촉매화를 이용하여 이와 인산염을 G1P로 전환시킨다. 바람직하게, 상기 전분 또는 전분 유도체는 가용성 전분， 가용성 직쇄 전분， 가용성 분지쇄 전분， 아밀로덱스트린， 말토덱스트린(
), 맥아다당(
)으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 전분은 가용성 전분이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 다당류는 또한 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 셀룰로오스 유도체는 셀로덱스트린, 셀로비오스 또는 이들의 임의의 혼합물로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 셀룰로오스 유도체는 셀룰로오스를 산 또는 효소 전처리하여 얻은 산물이며, 상기 산물은 셀로덱스트린, 셀로비오스 또는 이들의 임의의 혼합물이다. 바람직하게, 상기 셀룰로오스 유도체는 셀로덱스트린이다. 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 다당류가 셀룰로오스 및/또는 셀로덱스트린을 함유할 경우, 예를 들어 셀룰로오스 및/또는 셀로덱스트린일 경우, 셀로덱스트린 포스포릴라아제(cellodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.49, CDP) 촉매화를 이용하여 이와 인산염을 G1P로 전환시키고; 바람직하게, 추가적으로 셀로비오스 포스포릴라아제(cellobiose phosphorylase, EC 2.4.1.20, CBP) 촉매화를 이용하여, 셀룰로오스 및/또는 셀로덱스트린을 분해하여 생성된 셀로비오스 및 인산염을 G1P로 전환시킨다. 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 다당류가 셀로비오스를 함유할 경우, 예를 들어 셀로비오스일 경우, 셀로비오스 포스포릴라아제(cellobiose phosphorylase, EC 2.4.1.20, CBP) 촉매화를 적용하여 이와 인산염을 G1P로 전환시킨다.
본 기술분야의 통상의 기술자는, 본 발명의 방법에 포함되는 상기 단계는 단계적으로 진행될 수 있는데, 예를 들어 하나의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행되거나 직렬되게 배치된 다수의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행될 수 있음을 이해할 수 있다.
본 기술분야의 통상의 기술자는, 본 발명의 방법에 포함되는 상기 단계는 동시에 진행되는데, 예를 들어 하나의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행될 수 있음을 이해할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 방법에 포함되는 상기 단계는 동시에 진행된다.
바람직하게, 본 발명은, D-글루코스 유닛을 포함하는 이당류, 다당류 또는 이들의 임의의 혼합물을 기질로 사용하고, 인산염, 암모늄염, 및 D-글루코스 유닛을 포함하는 이당류, 다당류 또는 이들의 임의의 혼합물 및 인산염을 G1P로 전환시킬 수 있는 효소, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코스 이소머라제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 및 탈인산화할 수 있는 효소를 첨가하여, 촉매화 반응시켜 글루코사민을 얻는 단계를 포함하는 체외 효소 촉매화 반응을 이용하여 글루코사민을 제조하는 방법을 제공한다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 유래의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있다. 바람직하게, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 대장균(UniProt 번호: P0A759), 바실러스 서브틸리스(UniProt 번호: O35000), 람블편모충(UniProt 번호: V6TL01) 또는 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)(UniProt 번호: Q5JDU3) 등으로부터 유래될 수 있다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 유래의 탈인산화할 수 있는 효소는 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 탈인산화할 수 있는 효소는 기질 특이성을 가지는 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제(6-phosphate glucosamine phosphatase, GlmP)이고, 바람직하게, 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제는 대장균(UniProt 번호: P77475, P27848, P0AE22 등), 박테로이드스 테타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron, UniProt 번호: Q8A759) 등으로부터 유래될 수 있다.
써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)로부터 유래되는 써모자임(UniProt 번호: Q5JJ45)은 당 포스파타제(predicted sugar phosphatase, HAD superfamily)로 주석되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NOs: 1로 표시되며, 아미노산 서열은 SEQ ID NOs: 2로 표시된다. 본 발명에서, Q5JJ45의 기질 특이성을 검증한 결과, Q5JJ45는 GlcN6P가 탈인산화 반응을 진행하도록 촉매화할 수 있는 내열성 효소이고 GlcN6P가 글루코사민을 생성하도록 촉매하는 작용을 구비하는 것을 보여준다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 상기 뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 1과 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하며; 바람직하게, 상기 뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 1과 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열이다. 바람직하게, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 SEQ ID NOs: 2와 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 SEQ ID NOs: 2와 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 구비한다. 바람직하게, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)로부터 유래된 당 포스파타제(UniProt 번호: Q5JJ45)이다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 기질을 G1P로 전환시킬 수 있는 다양한 유래의 효소, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코스 이소머라제는 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있다. 바람직하게, α-글루칸 포스포릴라아제는 대장균(UniProt 번호: A0A0A0HB49), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima, UniProt 번호: G4FEH8), 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DCB6) 등으로부터 유래될 수 있고; 수크로스 포스포릴라아제는 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis, UniProt 번호: A0ZZH6), 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) (UniProt 번호: D9TT09) 등으로부터 유래될 수 있으며; 셀로덱스트린 포스포릴라아제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DJQ6), 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium)(UniProt 번호: P77846) 등으로부터 유래될 수 있고; 셀로비오스 포스포릴라아제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DC35), 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)(UniProt 번호: B9K7M6) 등으로부터 유래될 수 있다. 포스포글루코뮤타제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DEW8), 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)(UniProt 번호: Q68BJ6) 등으로부터 유래될 수 있고; 포스포글루코스 이소머라제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DBX9), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus, UniProt 번호: Q5SLL6) 등으로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 촉매화 반응의 온도는 30 ~ 70 ℃이고, 더 바람직하게 30 ~ 50 ℃이며, 가장 바람직하게 37 ℃이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 촉매화 반응의 pH는 5.0 ~ 8.0이고, 더 바람직하게 6.0 ~ 7.5이며, 가장 바람직하게 7.0이다.
본 발명에 따르면, 상기 단계가 동시에 진행될 경우, 바람직하게, 촉매화 반응의 시간은 1 ~ 48시간이고, 더 바람직하게 8 ~ 36시간이며, 보다 더 바람직하게 10 ~ 24시간이고, 가장 바람직하게 20시간이다.
본 발명에 따르면, 상기 단계가 단계적으로 진행될 경우, 바람직하게, 각 단계촉매화 반응의 시간은 서로 독립적으로 0.5 ~ 10시간이고, 더 바람직하게 1 ~ 3시간이며, 가장 바람직하게 2시간이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 반응계 중 기질의 농도는 1 ~ 200 g/L이고, 더 바람직하게 5 ~ 50 g/L이며, 보다 더 바람직하게 8 ~ 20 g/L이고, 가장 바람직하게 10 g/L이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 반응계 중 기질을 G1P로 전환시키는 효소의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이며, 보다 더 바람직하게 1 ~ 3 U/mL이고, 가장 바람직하게 2 U/mL이며; 바람직하게, 포스포글루코뮤타제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이며, 보다 더 바람직하게 1 ~ 3 U/mL이고, 가장 바람직하게 2 U/mL이며; 바람직하게, 포스포글루코스 이소머라제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이고, 더 바람직하게 1 ~ 5 U/mL이며, 가장 바람직하게 3 U/mL이고; 바람직하게, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이며, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이고, 보다 더 바람직하게 1 ~ 3 U/mL이며, 가장 바람직하게 2 U/mL이고; 바람직하게, 탈인산화할 수 있는 효소의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이며, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이고, 보다 더 바람직하게 1 ~ 3 U/mL이며, 가장 바람직하게 2 U/mL이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 반응계 중 암모늄염의 농도는 50 ~ 500 mM이고, 더 바람직하게 100 ~ 300 mM이며, 가장 바람직하게 200 mM이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 반응계 중 인산염의 농도는 1 ~ 150 mM이고, 더 바람직하게 2 ~ 50 mM이며, 더 바람직하게 10 ~ 30 mM이고, 가장 바람직하게 20 mM이다. 본 기술분야의 통상의 기술자는, GlcN6P 탈인산화를 이용하여 글루코사민(GlcN)을 생성하는 과정에서 생성된 인산염은 D-글루코스 유닛을 포함하는 이당류, 다당류 또는 이들의 임의의 혼합물을 G1P로 전환시키는 단계에서의 인 소스로 사용될 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 상기 반응계에는 마그네슘염이 더 함유된다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어 염화마그네슘, 황산마그네슘 등 다양한 마그네슘염은 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있고, 바람직하게, 마그네슘염은 염화마그네슘이다. 바람직하게, 반응계 중 마그네슘염의 농도는 1 ~ 20 mM이고, 더 바람직하게 2 ~ 15 mM이며, 가장 바람직하게 10 mM이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 상기 반응계에는 완충액이 더 함유된다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어 HEPES 완충액, Tris-HCl 완충액, MOPS 완충액, 구연산나트륨과 같은 구연산염 완충액 등 다양한 완충액은 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있다. 바람직하게, 완충액은 HEPES 완충액이다. 바람직하게, 반응계 중 완충액의 농도는 20 ~ 300 mM이고, 바람직하게 50 ~ 200 mM이며, 가장 바람직하게 100 mM이다.
본 발명에 따르면, 상기 촉매화 반응은 무-ATP, 무-NAD(H)의 조건에서 진행된다.
바람직한 실시형태에서, 전분, 전분 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물에 α-1,6 글리코시드 결합(예를 들어, 가용성 전분, 가용성 분지쇄 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린(
), 맥아다당(
)이 함유될 경우, 본 발명의 방법은 이소아밀라아제(isoamylase, EC 3.2.1.68, IA)를 이용하여 기질 중 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 반응 단계를 더 포함한다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 유래의 이소아밀라아제는 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있다. 바람직하게, 이소아밀라아제는 설포로부스 토코다이아이(Sulfolobus tokodaii, UniProt 번호: Q973H3), 플라보박테리움(Flavobacterium sp., UniProt 번호: O32611) 등으로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 반응계 중 이소아밀라아제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.5 ~ 2 U/mL이며, 가장 바람직하게 1 U/mL이다.
본 기술분야의 통상의 기술자는, 이소아밀라아제를 이용하여 기질 중 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 반응 단계는 상기 반응 단계와 단계적으로 진행될 수 있는데, 예를 들어 하나의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행되거나 직렬되게 배치된 다수의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행될 수 있고, 상기 반응 단계와 동시에 진행될 수도 있는데, 예를 들어 하나의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행될 수 있음을 이해할 수 있다.
바람직하게, 이소아밀라아제를 이용하여 기질 중 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 반응 단계는 기질 및 인산염을 G1P로 전환시키는 반응 단계 전에 진행되는데, 즉 먼저 이소아밀라아제를 이용하여 기질 중 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하고, 이소아밀라아제로 처리된 기질을 얻은 후, 다른 반응 단계를 진행하되, 이때, 다른 반응 단계는 단계적으로 진행되거나 동시에 진행될 수 있다. 이때, 바람직하게, 반응계 중 기질의 농도는 1 ~ 300 g/L이고, 더 바람직하게 10 ~ 200 g/L이며, 보다 더 바람직하게 50 ~ 150 g/L이고, 가장 바람직하게 100 g/L이며; 바람직하게, 이소아밀라아제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.5 ~ 2 U/mL이며, 가장 바람직하게 1 U/mL이고; 바람직하게, 촉매화 반응의 pH는 4 ~ 8이며, 더 바람직하게 4.5 ~ 6.5이고, 가장 바람직하게 5.5이며; 바람직하게, 10 ~ 99 ℃에서 0.5 ~ 72시간 동안 반응하고, 더 바람직하게 30 ~ 95 ℃에서 1 ~ 48시간 동안 반응하며, 보다 더 바람직하게 50 ~ 90 ℃에서 6 ~ 24시간 동안 반응하고, 가장 바람직하게 85 ℃에서 12시간 동안 반응한다. 바람직하게, 반응계에는 마그네슘염 및 완충액이 더 함유된다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어 염화마그네슘, 황산마그네슘 등 다양한 마그네슘염은 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있고, 바람직하게, 마그네슘염은 염화마그네슘이다. 바람직하게, 반응계 중 마그네슘염의 농도는 0.01 ~ 10 mM이고, 더 바람직하게 0.1 ~ 5 mM이며, 보다 더 바람직하게 0.2 ~ 1 mM이고, 가장 바람직하게 0.5 mM이다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 예를 들어 아세트산나트륨 완충액, HEPES 완충액, 구연산나트륨 완충액과 같은 구연산염 완충액 등 다양한 완충액은 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있고, 바람직하게, 완충액은 아세트산나트륨 완충액이다. 바람직하게, 반응계 중 완충액의 농도는 1 ~ 50 mM이고, 더 바람직하게 2 ~ 20 mM이며, 보다 더 바람직하게 3 ~ 10 mM이고, 가장 바람직하게 5mM이다.
바람직한 실시형태에서, 기질이 전분, 전분 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물(예를 들어, 가용성 전분, 가용성 직쇄 전분, 가용성 분지쇄 전분, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린(
), 말토덱스트린(
))일 경우, 본 발명의 방법은 4-α-트랜스글루코시다아제(4-α-glucanotransferase, EC 2.4.1.25, 4GT)를 이용하여 촉매화하는 반응 단계를 더 포함한다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 다양한 유래의 4-α-트랜스글루코시다아제는 모두 본 발명에 사용될 수 있음을 이해할 수 있다. 바람직하게, 4-α-트랜스글루코시다아제는 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis, UniProt 번호: O32462), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, UniProt 번호: L8AG91), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum, UniProt 번호: Q59266) 등으로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따르면, 바람직하게, 반응계 중 4-α-트랜스글루코시다아제의 농도는 0.1-10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이며, 보다 더 바람직하게 0.5 ~ 2 U/mL이고, 가장 바람직하게 1 U/mL이다.
본 기술분야의 통상의 기술자는, 4-α-트랜스글루코시다아제를 이용하여 촉매화하는 반응 단계는 상기 반응 단계와 단계적으로 진행될 수 있는데, 예를 들어 하나의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행되거나 직렬되게 배치된 다수의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행될 수 있고, 상기 반응 단계와 동시에 진행될 수도 있는데, 예를 들어 하나의 생물 반응기 또는 반응 용기에서 진행될 수 있음을 이해할 수 있다.
바람직하게, 4-α-트랜스글루코시다아제를 이용하여 촉매화하는 반응 단계는 기질 및 인산염을 G1P로 전환시키는 반응이 일정한 시간 동안 진행된 후 진행된다. 이때, 바람직하게, 기질 및 인산염을 G1P로 전환시키는 반응은 0.5 ~ 30시간, 바람직하게 5 ~ 20시간, 가장 바람직하게 10시간 동안 진행된 후 반응계에 4-α-트랜스글루코시다아제를 첨가한다.
전분은 상이한 사슬 길이의 직쇄 전분 및 분지쇄 전분으로 이루어진 혼합물이다. 직쇄 전분과 글루코스 유닛 사이는 α-1,4 글리코시드 결합에 의해 연결되고, 분지쇄 전분은 α-1,6 글리코시드 결합을 통해 전분의 메인 사슬과 연결되며, α-글루칸 포스포릴라아제는 α-1,6 글리코시드 결합을 가수분해할 수 없으므로, 반응계에 전분 중 α-1,6 글리코시드 결합을 가수분해할 수 있는 탈분지 효소인 이소아밀라아제를 첨가하여 G1P의 수율을 향상시킬 수 있다. 이 밖에, α-글루칸 포스포릴라아제가 전분, 전분 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물을 가수분해하여 G1P를 방출한 후 얻은 최종 산물은 말토오스 및 말토트리오스이다. 전분 중 글루코스 유닛이 최대한 많이 G1P로 전환되도록, 반응계에 4-α-트랜스글루코시다아제를 첨가할 수 있는데, 이는 짧은 사슬의 올리고당을 긴 사슬의 올리고당으로 중합시킬 수 있고, 상기 긴 사슬의 올리고당은 또한 α-글루칸 포스포릴라아제에 의해 재이용될 수 있음으로써, 전분의 이용률을 향상시킨다.
하나의 바람직한 실시형태로서, 본 발명의 효소 촉매화 반응은 하기와 같은 방법을 사용한다.
하나의 반응계에서, 이소아밀라아제로 처리된 가용성 전분을 기질로 사용하고, 염화마그네슘, 인산염, 암모늄염, HEPES 완충액(pH 7.0), α-글루칸 포스포릴라아제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코스 이소머라제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, 탈인산화할 수 있는 효소(바람직하게 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제)를 첨가하여, 촉매화 반응시켜 글루코사민을 얻는다. 바람직하게, 반응이 일정한 시간 동안 진행된 후 반응계에 4-α-트랜스글루코시다아제를 첨가한다.
더 바람직한 실시형태에서, 하나의 반응계에서, 10 g/L의 이소아밀라아제로 처리된 가용성 전분을 기질로 사용하고, 10 mM의 염화마그네슘, 20 mM의 인산이수소칼륨, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 2 U/mL의 α-글루칸 포스포릴라아제, 2 U/mL의 포스포글루코뮤타제, 3 U/mL의 포스포글루코스 이소머라제, 2 U/mL의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, 2 U/mL의 탈인산화할 수 있는 효소(바람직하게 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제)를 첨가하여, 반응 혼합물을 37 ℃에서 30 시간 동안 반응시켜 글루코사민을 얻는다. 바람직하게, 반응이 10시간 진행되었을 시 반응계에 1 U/mL의 4-α-트랜스글루코시다아제를 추가로 첨가한다.
본 발명은, 글루코사민의 제조에서, 바람직하게, F6P를 촉매화하여 글루코사민을 생성하는데 있어서의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 및 탈인산화할 수 있는 효소(바람직하게 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제)의 응용을 더 제공한다.
본 발명은, 글루코사민의 제조에서, 바람직하게, 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)를 촉매화하여 글루코사민(GlcN)을 생성하는데 있어서의 SEQ ID NOs: 1과 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 효소의 응용을 더 제공하고; 바람직하게, 상기 뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 1과 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열이다. 바람직하게, 상기 효소는 SEQ ID NOs: 2와 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 바람직하게, 상기 효소는 SEQ ID NOs: 2와 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 구비한다. 바람직하게, 상기 효소는 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)로부터 유래된 당 포스파타제(UniProt 번호: Q5JJ45)이다.
본 발명은 상기 방법으로 제조되는 글루코사민을 더 제공한다.
본 발명은 처음으로 체외 효소 촉매화 반응을 이용하여 글루코사민을 제조하였고, 특히 처음으로 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 및 탈인산화활 수 있는 효소 촉매화 F6P를 이용하여 글루코사민을 생성하였다. 본 발명의 방법은 비교적 우수한 전환율로 목적 산물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 얻은 산물은 인체에 대해 안전한 등 장점을 가진다. 이 박에, 본 발명의 방법은 예를 들어 D-글루코스 유닛을 함유한 이당류, 다당류 또는 이들의 임의의 혼합물 등 다양한 원료를 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 발명은 원료가 저렴하고 유래가 풍부하며 생산 원가가 낮고 친환경적이며 인체에 대해 안전한 등 장점을 가지므로, 보급하기에 적합하다. 이 밖에, 발명자는 전분, 전분 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물을 기질로 사용하여 촉매화하여 글루코사민을 생성할 경우 이소아밀라아제 및 4-α-트랜스글루코시다아제를 첨가함으로써 목적 산물의 수율을 크게 향상시킬 수 있음을 발견하였다.
도 1은 전분을 기질로 사용하여 글루코사민을 제조하는 체외 효소 촉매화 경로의 모식도이다. 여기서, αGP는 α-글루칸 포스포릴라아제이고, PGM는 포스포글루코뮤타제이며, PGI는 포스포글루코스 이소머라제이고, GlmD는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제이며, GlmP는 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제이다.
도 2는 전분을 기질로 사용하여 글루코사민을 제조하는 체외 효소 촉매화 경로의 중간체 사이의 반응 기브스(Gibbs) 에너지 변화이다.
도 3은 SDS-PAGE를 이용하여 전분을 기질로 사용하여 글루코사민을 제조하는 주요효소를 검출한 것이다. M: 마커(Marker).
도 4는 HPLC를 이용하여 글루코사민을 분석한 것이다. 여기서, 4A는 글루코사민 표준품의 HPLC 피크를 나타낸 도면이고; 여기서, 4B는 HPLC를 이용하여 글루코사민의 농도를 정량 분석한 것이며, 글루코사민 피크의 강도를 통해, 얻은 글루코사민의 농도를 정량할 수 있다.
도 5는 HPLC를 이용하여 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제가 참여한 체외 효소계가 가용성 전분을 촉매화하여 글루코사민을 합성하는 것을 분석한 것이다. 여기서, 5A는 가용성 전분을 체외 효소 촉매화하여 글루코사민을 생성하는 고성능 액체 크로마토그래피 분석 결과이고; 여기서, 5B는 가용성 전분을 체외 효소 촉매화하여 글루코사민을 합성하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 6은 IA로 처리된 가용성 전분을 체외 효소 촉매화하여 글루코사민을 합성하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 7은 효소 농도를 최적화한 후 IA로 처리된 가용성 전분을 체외 효소 촉매화하여 글루코사민을 합성하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 8은 수크로스를 글루코사민으로 전환시키도록 체외 효소 촉매화하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 9는 셀로덱스트린을 글루코사민으로 전환시키도록 체외 효소 촉매화하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 2는 전분을 기질로 사용하여 글루코사민을 제조하는 체외 효소 촉매화 경로의 중간체 사이의 반응 기브스(Gibbs) 에너지 변화이다.
도 3은 SDS-PAGE를 이용하여 전분을 기질로 사용하여 글루코사민을 제조하는 주요효소를 검출한 것이다. M: 마커(Marker).
도 4는 HPLC를 이용하여 글루코사민을 분석한 것이다. 여기서, 4A는 글루코사민 표준품의 HPLC 피크를 나타낸 도면이고; 여기서, 4B는 HPLC를 이용하여 글루코사민의 농도를 정량 분석한 것이며, 글루코사민 피크의 강도를 통해, 얻은 글루코사민의 농도를 정량할 수 있다.
도 5는 HPLC를 이용하여 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제가 참여한 체외 효소계가 가용성 전분을 촉매화하여 글루코사민을 합성하는 것을 분석한 것이다. 여기서, 5A는 가용성 전분을 체외 효소 촉매화하여 글루코사민을 생성하는 고성능 액체 크로마토그래피 분석 결과이고; 여기서, 5B는 가용성 전분을 체외 효소 촉매화하여 글루코사민을 합성하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 6은 IA로 처리된 가용성 전분을 체외 효소 촉매화하여 글루코사민을 합성하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 7은 효소 농도를 최적화한 후 IA로 처리된 가용성 전분을 체외 효소 촉매화하여 글루코사민을 합성하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 8은 수크로스를 글루코사민으로 전환시키도록 체외 효소 촉매화하는 반응 진행 과정 그래프이다.
도 9는 셀로덱스트린을 글루코사민으로 전환시키도록 체외 효소 촉매화하는 반응 진행 과정 그래프이다.
아래 구체적인 실시예와 결부시켜 본 발명의 기술적 해결수단을 더 상세하게 설명한다. 아래 실시예는 단지 예시적으로 본 발명을 설명하고 해석하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하려는 것으로 해석되어서는 아니됨을 이해해야 한다. 본 발명에 따른 내용에 기반하여 구현된 기술은 모두 본 발명의 보호범위 내에 속해야 한다.
달리 설명되지 않은 한, 이하 실시예에서 사용된 원료 및 시약은 모두 시중에 판매중인 상품이거나, 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용된 일부 재료 정보는 하기와 같다.
가용성 전분, ACROS 회사 제품, 제품 번호: 424490020;
pET20b 담체, Novagen, Madison, WI;
대장균 발현균 BL21(DE3), Invitrogen, Carlsbad, CA.
실시예 1. 글루코사민의 효소적 제조 방법의 합성 경로에서의 효소 활성 측정
체외 효소 촉매화 시스템을 통해 전분을 글루코사민으로 전환시키는 촉매화 경로는 도 1에 도시된 바와 같은 바, 여기서, 탈인산화할 수 있는 효소는 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제를 예로 든다. 도 2는 전분을 글루코사민을 전환시키는 효소 촉매화 경로의 중간체 사이의 반응 기브스 에너지 변화를 나타낸다. 본 실시예에서, (1) α-글루칸 포스포릴라아제는 대장균(UniProt 번호: A0A0A0HB49)으로부터 유래되고; (2) 포스포글루코뮤타제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DEW8)으로부터 유래되며; (3) 포스포글루코스 이소머라제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DBX9)으로부터 유래되고; (4) 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 바실러스 서브틸리스(UniProt 번호: O35000)로부터 유래되며; (5) 탈인산화할 수 있는 효소는 박테로이드스 테타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron)으로부터 유래된 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제(UniProt 번호: Q8A759)이다. 상기 게놈 DNA는 모두 ATCC돨공식 웹사이트(www.atcc.org)로부터 얻을 수 있다. Simple Cloning(You C, Zhang XZ, Zhang Y-HP. 2012. Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol. 78(5):1593-5.)의 방법을 통해, 상기 유전자를 pET20b 담체(Novagen, Madison, WI)에 클론하여, 각각 대응되는 발현 담체 pET20b-EcαGP, pET20b-CtPGM, pET20b-CtPGI, pET20b-BsGlmD, pET20b-BtGlmP를 얻는다. 재조합 단백질은 대장균 BL21(DE3)에 발현되고 정제되며, 단백질 정제의 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.
클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)으로부터 유래된 포스포글루코뮤타제의 효소 활성 측정은 10 mM의 염화마그네슘이 함유된 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0)에서 진행된다. 10 mM의 글루코스-1-포스페이트를 기질로 사용하고, 37 ℃에서 10분 동안 반응시켜, 생성된 글루코스-6-포스페이트(G6P)의 양을 측정한다. G6P의 양의 검출 방법은 하기와 같은 바, G6P가 함유된 40 μl의 샘플 용액을 취하여 2 mM의 염화마그네슘, 0.15 mM의 NAD+, 0.5 U/mL의 글루코스6-포스페이트 디히드로제나아제(glucose 6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)가 함유된 200 μl의 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0)을 첨가하고, 37 ℃에서 30분 동안 반응시켜, 340 nm에서의 흡광도를 측정하며, 생성된 NADH의 양을 계산한다. 실험 결과는 클로스트리디움 써모셀럼 유래의 포스포글루코뮤타제의 37 ℃에서의 특정 효소 활성(specific enzymic activity)이 20 U/mg임을 보여준다.
대장균(E. coli)으로부터 유래된 α-글루칸 포스포릴라아제의 효소 활성 측정은 10 mM의 염화마그네슘, 1 U/mL의 포스포글루코뮤타제가 함유된 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0)에서 진행된다. 5 g/L의 가용성 전분을 기질로 사용하고, 37 ℃에서 10분 동안 반응시켜, 생성된 글루코스-6-포스페이트의 양을 측정한다. 실험 결과는 대장균 유래의 α-글루칸 포스포릴라아제의 37 ℃에서의 특정 효소 활성이 5.6 U/mg임을 보여준다.
클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)으로부터 유래된 포스포글루코스 이소머라제의 효소 활성은 10 mM의 염화마그네슘이 함유된 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0)에서 진행된다. 10 mM의 프룩토오스-6-포스페이트를 기질로 사용하고, 37 ℃에서 10분 동안 반응시켜, 생성된 글루코스-6-포스페이트의 양을 측정한다. 실험 결과는 클로스트리디움 써모셀럼 유래의 포스포글루코스 이소머라제의 37 ℃에서의 특정 효소 활성이 396 U/mg임을 보여준다.
바실러스 서브틸리스(B. subtilis)로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 효소 활성은 10 mM의 염화마그네슘이 함유된 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0)에서 진행된다. 10 mM의 프룩토오스-6-포스페이트 및 100 mM의 염화암모늄을 기질로 사용하고, 37 ℃에서 10분 동안 반응시켜, 생성된 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)의 양을 측정한다. GlcN6P의 양의 검출 방법은 하기와 같은 바, GlcN6P가 함유된 50 μl의 샘플을 취하여 100 μl의 아세틸아세톤 시약(1.5 mL의 아세틸아세톤을 취하여 50 mL의 1.25 mol/L의 탄산나트륨 용액에 용해시켜 조제됨)을 첨가하고, 20분 동안 끓이며, 실온까지 냉각시키고, 1 mL의 96 % (v/v)의 에탄올을 천천히 첨가한 다음, 100 μl 의 p-디메틸아미노벤즈알데히드(DMAB) 시약(1.6 g의 DMAB를 취하여 30 mL의 농염산 및 30 mL의 96 %의 에탄올에 용해시켜 조제됨)을 첨가하며, 균일하게 혼합하고, 실온에서 30분 동안 방치하며, 530 nm에서의 흡광도를 측정하고, 표준 곡선에 따라 GlcN6P 함량을 계산한다. 실험 결과는 바실러스 서브틸리스 유래의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 37 ℃에서의 특정 효소 활성이 10 U/mg임을 보여준다.
상기 반응 경로에서, GlcN6P에 대해 특이적 탈인(dephosphorization) 활성을 가지는 탈인산화할 수 있는 효소는 본 발명의 결정적 요소 중 하나이다. 10 mM의 염화마그네슘이 함유된 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0)에서, G1P, G6P, F6P 및 GlcN6P에 대한 상기 탈인산화할 수 있는 효소의 탈인 활성을 측정하였다. 실험 결과는 표 1과 같다. 박테로이드스 테타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron)으로부터 유래된 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제는 GlcN6P에 대해 비교적 높은 특정 효소 활성을 가지고, 특이적인 GlcN6P 탈인 활성을 나타낸다. 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis) 유래의 당 포스파타제(predicted sugar phosphatase, HAD superfamily)의 70 ℃에서의 GlcN6P 기질에 대한 탈인 활성은 0.011 U/mg이다.
표 1. 상이한 기질에 대한 2개의 탈인산화할 수 있는 효소의 탈인 활성
a: 37 ℃에서 측정한 특정 효소 활성; b: 70 ℃에서 측정한 특정 효소 활성.
실시예 2. 가용성 전분을 체외(in vitro) 효소 촉매화하여 글루코사민 합성
본 실시예에서 효소를 이용하여 가용성 전분을 체외 촉매화하여 글루코사민을 합성한다. 먼저, 대장균으로부터 유래된 αGP, 클로스트리디움 써모셀럼으로부터 유래된 PGM, 클로스트리디움 써모셀럼으로부터 유래된 PGI, 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 GlmD, 박테로이드스 테타이오타오마이크론으로부터 유래된 GlmP 등 5가지 효소를 재조합 발현하였다(표 2).
표 2. 글루코사민의 체외 합성에서 사용되는 효소의 정보
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 글루코사민을 정량 분석한다. 사용된 크로마토그래피 칼럼은 아미노기 칼럼이고, 이동상은 80 %의 아세토니트릴 수용액이며, 유속은 1 mL/min이고, 칼럼 온도는 40 ℃이며, 사용된 검출기는 시차 굴절 검출기이다. 표준 샘플 검출은 도 4A에 도시된 바와 같고, 글루코사민 보존 시간은 약 9.6분이다. 글루코사민 농도와 글루코사민의 HPLC 특징 피크의 응답 강도는 정비례되고, 표준 곡선은 도 4B에 도시된 바와 같다.
10 g/L의 가용성 전분, 10 mM의 염화마그네슘, 20 mM의 인산이수소칼륨, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 1 U/mL의 αGP, 1 U/mL의 PGM, 1 U/mL의 PGI, 1 U/mL의 GlmD, 1 U/mL의 GlmP이 함유된 0.5 Ml의 반응 혼합물을 37 ℃에서 30시간 동안 반응시킨다. 반응 종료 후, 반응계에 동일한 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 정지시키고, 12000 rpm로 10분 동안 원심분리하며, 상청액을 취하여 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 반응 용액 중의 글루코사민의 농도를 측정한다(도 5A). 반응이 20시간 진행되었을 시, 글루코사민의 농도는 2.4 g/L이고, 전환율은 24 %이다(도 5B).
산물 전환율의 계산 공식은 하기와 같다.
실시예 3. IA로 처리된 가용성 전분을 체외(in vitro) 효소 촉매화하여 글루코사민 합성
전분은 α-1,4와 α-1,6이 혼합 결합된 다당류이므로, α-글루칸 포스포릴라아제에 의해 완전히 가수분해될 수 없다. 이소아밀라아제(IA, EC 3.2.1.68)는 전분 중 α-1,6 글리코시드 결합을 가수분해할 수 있음으로써, α-글루칸 포스포릴라아제가 기질을 가인산분해(phosphorolysis)하도록 돕고, 글루코사민의 수율을 향상시킨다.
본 실시예에서, 이소아밀라아제는 설포로부스 토코다이아이(Sulfolobus tokodaii, UniProt 번호: Q973H3)로부터 유래된다. 문헌(Cheng, K. et al. Doubling Power Output of Starch Biobattery Treated by the Most Thermostable Isoamylase from an Archaeon Sulfolobus tokodaii. Sci. Rep. 5:13184)에서 보도된 발현 담체 pET20b-StIA를 대장균 BL21(DE3)에 도입시켜 단백질 발현과 정제를 진행한다.
100 g/L의 가용성 전분이 함유된 5 mM의 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5)에 0.5 mM의 염화마그네슘 및 1 U/mL의 이소아밀라아제를 첨가하여, 85 ℃에서 12시간 동안 처리한다.
이소아밀라아제로 처리된 10 g/L의 가용성 전분, 10 mM의 염화마그네슘, 20 mM의 인산이수소칼륨, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 1 U/mL의 αGP, 1 U/mL의 PGM, 1 U/mL의 PGI, 1 U/mL의 GlmD, 1 U/mL의 GlmP가 함유된 0.5 mL의 반응 혼합물을 37 ℃에서 20시간 동안 배양한다. 상이한 시간대에 샘플을 채취, 동일한 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 정지시키며, 12000 rpm로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 글루코사민의 농도를 측정한다. 반응이 10시간 진행되었을 시, 글루코사민의 농도는 3.5 g/L이고, 전환율은 35 %이다(도 6).
실시예 4. 효소 농도를 최적화한 후 IA로 처리된 가용성 전분으로부터 글루코사민을 합성하도록 하는 체외(in vitro) 효소 촉매화
이소아밀라아제로 처리된 10 g/L의 가용성 전분, 10 mM의 염화마그네슘, 20 mM의 인산이수소칼륨, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 2 U/mL의 αGP, 2 U/mL의 PGM, 3 U/mL의 PGI, 2 U/mL의 GlmD, 2 U/mL의 GlmP가 함유된 0.5 mL의 반응 혼합물을 37 ℃에서 30시간 동안 배양한다. 상이한 시간대에 샘플을 채취하고, 동일한 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 정지시키며, 12000 rpm로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 글루코사민의 농도를 측정한다. 반응이 20시간 진행되었을 시, 글루코사민의 농도는 7.12 g/L이고, 전환율은 71.2 %이다(도 7, 실선으로 표시함).
실시예 5. 4-α-트랜스글루코시다아제를 첨가하여 글루코사민의 수율 향상
α-글루칸 포스포릴라아제가 이소아밀라아제로 처리된 가용성 전분을 가인산분해하여 최종적으로 남은 기질은 말토트리오스 및 말토오스이다. 4-α-트랜스글루코시다아제(4GT, EC 2.4.1.25)는 짧은 사슬의 말토 올리고당 사슬을 연장시켜 추가적으로 α-글루칸 포스포릴라아제에 의해 이용되도록 할 수 있음으로써, 글루코사민으로 전환시켜 산물 수율을 향상시킨다.
본 실시예에서, 4-α-트랜스글루코시다아제는 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)로부터 유래되고, 이의 UniProt 번호는 O32462이다. 프라이머 F2: TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATA ATGGAAAGAATAAACTTCATATTTG, R2: CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC TCGAGTCAAAGCTCCCTGAACCTTACCGTG를 이용하여, Simple Cloning의 방법을 통해 pET20b 담체에 클론하여, 대응되는 발현 담체 pET20b-St4GT를 얻는다. 대장균 BL21(DE3)을 통해 단백질 발현과 정제를 진행한다.
이소아밀라아제로 처리된 10 g/L의 가용성 전분, 10 mM의 염화마그네슘, 20 mM의 인산이수소칼륨, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 2 U/mL의 αGP, 2 U/mL의 PGM, 3 U/mL의 PGI, 2 U/mL의 GlmD, 2 U/mL의 GlmP가 함유된 0.5 mL의 반응 혼합물을 37 ℃에서 10시간 동안 배양한다. 다음 최종 농도가 1 U/mL인 4GT를 첨가하여 37 ℃에서 계속하여 30시간까지 반응시킨다. 상이한 시간대에 샘플을 채취하고, 동일한 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 정지시키며, 12000 rpm로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 반응 용액 중의 글루코사민의 농도를 측정한다. 반응이 20시간 진행되었을 시, 글루코사민의 농도는 7.93 g/L이고, 전환율은 79.3 %이다(도 7, 점선으로 표시함).
실시예 6. 수크로스를 글루코사민으로 전환시키도록 하는 체외(in vitro) 효소 촉매화
10 g/L의 수크로스, 10 mM의 염화마그네슘, 20 mM의 인산이수소칼륨, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 2 U/mL의 SP, 2 U/mL의 PGM, 3 U/mL의 PGI, 2 U/mL의 GlmD, 2 U/mL의 GlmP가 함유된 0.5 mL의 반응 혼합물을 37 ℃에서 20시간 동안 배양한다. 상이한 시간대에 샘플을 채취하고, 동일한 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 정지시키며, 12000 rpm로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 반응 용액 중의 글루코사민의 농도를 측정한다. 반응이 10시간 진행되었을 시, 글루코사민의 농도는 4.1 g/L이고, 전환율은 41 %이다(도 8).
실시예 7. 셀로덱스트린을 글루코사민으로 전환시키도록 하는 체외(in vitro) 효소 촉매화
10 g/L의 셀로덱스트린(평균 중합도는4.4임), 10 mM의 염화마그네슘, 20 mM의 인산이수소칼륨, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 1 U/mL의 CDP, 1 U/mL의 CBP, 2 U/mL의 PGM, 3 U/mL의 PGI, 3 U/mL의 GlmD, 2 U/mL의 GlmP가 함유된 0.5 mL의 반응 혼합물을 37 ℃에서 20시간 동안 배양한다. 상이한 시간대에 샘플을 채취하고, 동일한 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 정지시키며, 12000 rpm로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 반응 용액 중의 글루코사민의 농도를 측정한다. 반응이 10시간 진행되었을 시, 글루코사민의 농도는 3.44 g/L이고, 전환율은 34.4 %이다(도 9).
실시예 8. 프룩토오스-6-포스페이트를 글루코사민으로 전환시키도록 하는 체외(in vitro) 효소 촉매화
50 mM의 프룩토오스-6-포스페이트, 10 mM의 염화마그네슘, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 1 U/mL의 GlmD, 1 U/mL의 GlmP가 함유된 0.5 mL의 반응 혼합물을 37 ℃에서 10시간 동안 배양한다. 상이한 시간대에 샘플을 채취하고, 동일한 부피의 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 정지시키며, 12000 rpm로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 취하여 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 반응 용액 중의 글루코사민의 농도를 측정한다. 반응이 4시간 진행되었을 시, 글루코사민의 농도는 43.9 mM이고, 전환율은 87.8 %이다.
이상, 본 발명의 실시형태를 설명하였다. 하지만, 본 발명은 상기 실시형태에 한정되지 않는다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 진행한 임의의 수정, 등가적 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 속해야 한다.
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<130> ORIG2009
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<160> 2
<170> Patent In Version 3.5
<210> 1
<211> 807
<212> DNA
<213> Thermococcus kodakarensis
<400> 1
atgacgagaa aaatcggcat tatcttcgac atggacggcg tcatctacag aggcagcgag 60
ccgataaatg gtgcaaaaga ggtcatcgag ttcctgaaag aaaggaaaat acccttcctg 120
ttcctcacga acaactccac gagagacccc gcaatgtaca gggaaaagct cctctcgatg 180
ggcatagacg tgccggaaga tgttatagtc acgtcgggcc tggccacgag gctctacatg 240
gagaagcact ttgagccagg agaagttttc gttatcggtg gaaaggggct tctcagggag 300
atggagcgcc tcggctgggg agttgttagc cttgaagatg ctaggaaagg cgcctggaag 360
aggatcaagc acgtcgttgt gggccttgac cccgagttaa cctacgagaa gctcaagtac 420
ggaacgctcg ctataaggaa cggggcaagc ttcataggga cgaacccgga cacgacatat 480
ccagcggagg aagggctcta ccccggtgct ggggcaataa tagccgccct cagggcatca 540
acggacagag agccagtgat cataggcaag ccaaacgaac cggcctatga agtcgttaag 600
gacaaacttg gagacgttga agagctctgg atggtcggcg acaggctcga taccgatata 660
gcgttcgcaa agcgcttcgg catgaaggcc ataatggtgc tcacgggtgt aagcacgctc 720
aaggacgttg ccgaaagcgg gataaagccg aacctcgttc tccccgatgt gggggagctg 780
aaaaggtatc tggaggctgc cctttag 807
<210> 2
<211> 268
<212> PRT
<213> Thermococcus kodakarensis
<400> 2
Met Thr Arg Lys Ile Gly Ile Ile Phe Asp Met Asp Gly Val Ile Tyr
5 9 14 19
Arg Gly Ser Glu Pro Ile Asn Gly Ala Lys Glu Val Ile Glu Phe Leu
24 29 34
Lys Glu Arg Lys Ile Pro Phe Leu Phe Leu Thr Asn Asn Ser Thr Arg
39 44 49
Asp Pro Ala Met Tyr Arg Glu Lys Leu Leu Ser Met Gly Ile Asp Val
54 59 64
Pro Glu Asp Val Ile Val Thr Ser Gly Leu Ala Thr Arg Leu Tyr Met
69 74 79 84
Glu Lys His Phe Glu Pro Gly Glu Val Phe Val Ile Gly Gly Lys Gly
89 94 99
Leu Leu Arg Glu Met Glu Arg Leu Gly Trp Gly Val Val Ser Leu Glu
104 109 114
Asp Ala Arg Lys Gly Ala Trp Lys Arg Ile Lys His Val Val Val Gly
119 124 129
Leu Asp Pro Glu Leu Thr Tyr Glu Lys Leu Lys Tyr Gly Thr Leu Ala
134 139 144
Ile Arg Asn Gly Ala Ser Phe Ile Gly Thr Asn Pro Asp Thr Thr Tyr
149 154 159 164
Pro Ala Glu Glu Gly Leu Tyr Pro Gly Ala Gly Ala Ile Ile Ala Ala
169 174 179
Leu Arg Ala Ser Thr Asp Arg Glu Pro Val Ile Ile Gly Lys Pro Asn
184 189 194
Glu Pro Ala Tyr Glu Val Val Lys Asp Lys Leu Gly Asp Val Glu Glu
199 204 209
Leu Trp Met Val Gly Asp Arg Leu Asp Thr Asp Ile Ala Phe Ala Lys
214 219 224
Arg Phe Gly Met Lys Ala Ile Met Val Leu Thr Gly Val Ser Thr Leu
229 234 239 244
Lys Asp Val Ala Glu Ser Gly Ile Lys Pro Asn Leu Val Leu Pro Asp
249 254 259
Val Gly Glu Leu Lys Arg Tyr Leu Glu Ala Ala Leu
264 269
Claims (10)
- 체외 효소 촉매화 반응을 이용하여 글루코사민을 제조하는 방법으로서,
글루코사민-6-포스페이트 데아미나제(glucosamine-6-phosphate deaminase, EC 3.5.99.6, GlmD) 촉매화를 이용하여 프룩토오스-6-포스페이트(F6P) 및 암모늄염을 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)로 전환시키는 단계; 및
탈인산화할 수 있는 효소를 사용하여 GlcN6P 탈인산화를 촉매하여 글루코사민(GlcN)을 생성하는 단계를 포함하고,
바람직하게, 상기 암모늄염은 황산암모늄, 염화암모늄, 황산수소암모늄, 질산암모늄, 탄산암모늄, 탄산수소암모늄 중 하나, 둘 또는 둘 이상의 임의의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 포스포글루코스 이소머라제(phosphoglucose isomerase, EC 5.3.1.9, PGI) 촉매화를 이용하여 글루코스-6-포스페이트(G6P)를 F6P로 전환시키는 반응 단계를 더 포함하고;
바람직하게, 상기 방법은 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2, PGM) 촉매화를 이용하여 글루코스-1-포스페이트(G1P)를 G6P로 전환시키는 반응 단계를 더 포함하며;
바람직하게, 상기 방법은 기질 및 인산염을 G1P로 전환시킬 수 있는 효소 촉매화를 이용하여 기질 및 인산염을 G1P로 전환시키는 반응 단계를 더 포함하되, 상기 기질은 D-글루코스 유닛을 포함하는 이당류, 다당류 또는 이들의 임의의 혼합물이고;
바람직하게, 상기 인산염은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이인산나트륨, 인산수소이나트륨 중 하나, 둘 또는 둘 이상의 임의의 혼합물로부터 선택되며;
바람직하게, 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 이당류는 수크로스이고, 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7, SP) 촉매화를 이용하여 이와 인산염을 G1P로 전환시키며;
바람직하게, 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 다당류는 전분, 전분 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물로부터 선택되고, α-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase, EC 2.4.1.1, αGP) 촉매화를 이용하여 이와 인산염을 G1P로 전환시키며;
바람직하게, 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 다당류는 또한 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물로부터 선택되고; 바람직하게, 상기 셀룰로오스 유도체는 셀룰로오스를 산 또는 효소 전처리하여 얻은 산물이며;
바람직하게, 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 다당류가 셀룰로오스 및/또는 셀로덱스트린을 함유할 경우, 셀로덱스트린 포스포릴라아제(cellodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.49, CDP) 촉매화를 이용하여 이와 인산염을 G1P로 전환시키고; 바람직하게, 추가적으로 셀로비오스 포스포릴라아제(cellobiose phosphorylase, EC 2.4.1.20, CBP) 촉매화를 이용하여, 셀룰로오스 및/또는 셀로덱스트린을 분해하여 생성된 셀로비오스 및 인산염을 G1P로 전환시키며;
바람직하게, 상기 D-글루코스 유닛을 포함하는 다당류가 셀로비오스를 함유할 경우, 셀로비오스 포스포릴라아제(cellobiose phosphorylase, EC 2.4.1.20, CBP) 촉매화를 적용하여 이와 인산염을 G1P로 전환시키는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 대장균(UniProt 번호: P0A759), 바실러스 서브틸리스(UniProt 번호: O35000), 람블편모충(UniProt 번호: V6TL01) 또는 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)(UniProt 번호: Q5JDU3)로부터 유래되고;
바람직하게, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제(6-phosphate glucosamine phosphatase, GlmP)이며; 바람직하게, 상기 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제는 대장균(UniProt 번호: P77475, P27848, P0AE22 등), 박테로이드스 테타이오타오마이크론(Bacteroides thetaiotaomicron, UniProt 번호: Q8A759)으로부터 유래되고;
바람직하게, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 뉴클레오티드에 의해 코딩되며, 상기 뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 1과 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 바람직하게, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 SEQ ID NOs: 2와 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며; 바람직하게, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)로부터 유래된 당 포스파타제(UniProt 번호: Q5JJ45)이고;
바람직하게, 상기 α-글루칸 포스포릴라아제는 대장균(UniProt 번호: A0A0A0HB49), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima, UniProt 번호: G4FEH8), 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DCB6)으로부터 유래되며;
바람직하게; 상기 수크로스 포스포릴라아제는 비피도박테리움 아돌레센티스 (Bifidobacterium adolescentis, UniProt 번호: A0ZZH6), 써모아나에로박테리움 써모사카롤리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)(UniProt 번호: D9TT09)으로부터 유래되고;
바람직하게, 상기 셀로덱스트린 포스포릴라아제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DJQ6), 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium)(UniProt 번호: P77846)으로부터 유래되며;
바람직하게, 상기 셀로비오스 포스포릴라아제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DC35), 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)(UniProt 번호: B9K7M6)로부터 유래되고;
바람직하게, 상기 포스포글루코뮤타제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DEW8), 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)(UniProt 번호: Q68BJ6)로부터 유래되며;
바람직하게, 상기 포스포글루코스 이소머라제는 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum, UniProt 번호: A3DBX9), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus, UniProt 번호: Q5SLL6)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
촉매화 반응의 온도는 30 ~ 70 ℃이고, 더 바람직하게 30 ~ 50 ℃이며, 가장 바람직하게 37 ℃이고;
바람직하게, 촉매화 반응의 pH는 5.0 ~ 8.0이며, 더 바람직하게 6.0 ~ 7.5이고, 가장 바람직하게 7.0이며;
바람직하게, 각 단계는 동시에 진행되고, 촉매화 반응의 시간은 1 ~ 48 시간이며, 더 바람직하게 8 ~ 36시간이고, 보다 더 바람직하게 10 ~ 24시간이며, 가장 바람직하게 20시간이고;
바람직하게, 각 단계는 단계적으로 진행되며, 각 단계의 촉매화 반응의 시간은 서로 독립적으로 0.5 ~ 10시간이고, 더 바람직하게 1 ~ 3시간이며, 가장 바람직하게 2시간이고;
바람직하게, 기질의 농도는 1 ~ 200 g/L이며, 더 바람직하게 5 ~ 50 g/L이고, 보다 더 바람직하게 8 ~ 20 g/L이며, 가장 바람직하게 10 g/L이고;
바람직하게, 기질을 G1P로 전환시키는 효소의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이며, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이고, 보다 더 바람직하게 1 ~ 3 U/mL이며, 가장 바람직하게 2 U/mL이고;
바람직하게, 포스포글루코뮤타제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이며, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이고, 보다 더 바람직하게 1 ~ 3 U/mL이며, 가장 바람직하게 2 U/mL이고;
바람직하게, 포스포글루코스 이소머라제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이며, 더 바람직하게 1 ~ 5 U/mL이고, 가장 바람직하게 3 U/mL이며;
바람직하게, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이며, 보다 더 바람직하게 1 ~ 3 U/mL이고, 가장 바람직하게 2 U/mL이며;
바람직하게, 탈인산화할 수 있는 효소의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이며, 보다 더 바람직하게 1 ~ 3 U/mL이고, 가장 바람직하게 2 U/mL이며;
바람직하게, 암모늄염의 농도는 50 ~ 500 mM이고, 더 바람직하게 100 ~ 300 mM이며, 가장 바람직하게 200 mM이고;
바람직하게, 인산염의 농도는 1 ~ 150 mM이며, 더 바람직하게 2 ~ 50 mM이고, 더 바람직하게 10 ~ 30 mM이며, 가장 바람직하게 20 mM이고;
바람직하게, 반응계에는 마그네슘염이 더 함유되며;
바람직하게, 상기 마그네슘염은 염화마그네슘 및/또는 황산마그네슘이고;
바람직하게, 반응계 중 마그네슘염의 농도는 1 ~ 20 mM이며, 더 바람직하게 2 ~ 15 mM이고, 가장 바람직하게 10 mM이며;
바람직하게, 반응계에는 완충액이 더 함유되고;
바람직하게, 상기 완충액은 HEPES 완충액, Tris ~ HCl 완충액, MOPS 완충액, 구연산염 완충액으로부터 선택되며;
바람직하게, 완충액은 HEPES 완충액이고, 바람직하게, 완충액의 농도는 20 ~ 300 mM이며, 바람직하게 50~200 mM이고, 가장 바람직하게 100 mM인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 전분, 전분 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물에 α-1,6 글리코시드 결합이 함유될 경우, 상기 방법은 이소아밀라아제(isoamylase, EC 3.2.1.68, IA)를 이용하여 기질 중 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 반응 단계를 더 포함하고;
바람직하게, 상기 이소아밀라아제는 설포로부스 토코다이아이(Sulfolobus tokodaii, UniProt 번호: Q973H3), 플라보박테리움(Flavobacterium sp., UniProt 번호: O32611)으로부터 유래되며;
바람직하게, 반응계 중 이소아밀라아제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.5 ~ 2 U/mL이며, 가장 바람직하게 1 U/mL이고;
바람직하게, 이소아밀라아제를 이용하여 기질 중 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해하는 반응 단계는 기질 및 인산염을 G1P로 전환시키는 반응 단계 전에 진행되며;
바람직하게, 반응계 중 기질의 농도는 1 ~ 300 g/L이고, 더 바람직하게 10 ~ 200 g/L이며, 보다 더 바람직하게 50 ~ 150 g/L이고, 가장 바람직하게 100 g/L이며;
바람직하게, 이소아밀라아제의 농도는 0.1 ~ 10 U/mL이며, 더 바람직하게 0.5 ~ 2 U/mL이고, 가장 바람직하게 1 U/mL이며;
바람직하게, 촉매화 반응의 pH는 4 ~ 8이고, 더 바람직하게 4.5 ~ 6.5이며, 가장 바람직하게 5.5이고;
바람직하게, 10 ~ 99 ℃에서 0.5 ~ 72시간 동안 반응하며, 더 바람직하게 30 ~ 95 ℃에서 1 ~ 48시간 동안 반응하고, 보다 더 바람직하게 50 ~ 90 ℃에서 6 ~ 24시간 동안 반응하며, 가장 바람직하게 85 ℃에서 12시간 동안 반응하고;
바람직하게, 반응계에는 마그네슘염이 더 함유되며; 바람직하게, 상기 마그네슘염은 염화마그네슘 및/또는 황산마그네슘이고; 바람직하게, 반응계 중 마그네슘염의 농도는 0.01 ~ 10 mM이며, 더 바람직하게 0.1 ~ 5 mM이고, 보다 더 바람직하게 0.2 ~ 1 mM이며, 가장 바람직하게 0.5 mM이고;
바람직하게, 반응계에는 완충액이 더 함유되고; 바람직하게, 상기 완충액은 아세트산나트륨 완충액, HEPES 완충액, 구연산염 완충액으로부터 선택되며; 바람직하게, 완충액의 농도는 1 ~ 50 mM이고, 더 바람직하게 2 ~ 20 mM이며, 보다 더 바람직하게 3 ~ 10 mM이고, 가장 바람직하게 5mM인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
기질이 전분, 전분 유도체 또는 이들의 임의의 혼합물일 경우, 상기 방법은 4-α-트랜스글루코시다아제(4-α-glucanotransferase, EC 2.4.1.25, 4GT)를 이용하여 촉매화하는 반응 단계를 더 포함하고;
바람직하게, 4-α-트랜스글루코시다아제는 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis, UniProt 번호: O32462), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, UniProt 번호: L8AG91), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum, UniProt 번호: Q59266)으로부터 유래되며;
바람직하게, 반응계 중 4-α-트랜스글루코시다아제의 농도는 0.1-10 U/mL이고, 더 바람직하게 0.2 ~ 5 U/mL이며, 보다 더 바람직하게 0.5 ~ 2 U/mL이고, 가장 바람직하게 1 U/mL이며;
바람직하게, 4-α-트랜스글루코시다아제를 이용하여 촉매화하는 반응 단계는 기질 및 인산염을 G1P로 전환시키는 반응이 일정한 시간 동안 진행된 후 진행되고; 바람직하게, 기질 및 인산염을 G1P로 전환시키는 반응은 0.5 ~ 30시간, 바람직하게 5 ~ 20시간, 가장 바람직하게 10시간 동안 진행된 후 반응계에 4-α-트랜스글루코시다아제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
10 g/L의 이소아밀라아제로 처리된 가용성 전분을 기질로 사용하고, 10 mM의 염화마그네슘, 20 mM의 인산이수소칼륨, 200 mM의 염화암모늄, 100 mM의 HEPES 완충액(pH 7.0), 2 U/mL의 α-글루칸 포스포릴라아제, 2 U/mL의 포스포글루코뮤타제, 3 U/mL의 포스포글루코스 이소머라제, 2 U/mL의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, 2 U/mL의 탈인산화할 수 있는 효소를 첨가하여, 반응 혼합물을 37 ℃에서 30 시간 동안 반응시켜 글루코사민을 얻고;
바람직하게, 탈인산화할 수 있는 효소는 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제이며;
바람직하게, 반응이 10시간 진행되었을 시 반응계에 1 U/mL의 4-α-트랜스글루코시다아제를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법. - 글루코사민의 제조에서, 바람직하게, F6P를 촉매화하여 글루코사민을 생성하는데 있어서의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 및 탈인산화할 수 있는 효소의 응용으로서,
바람직하게, 상기 탈인산화할 수 있는 효소는 6-포스페이트 글루코사민 포스파타제로부터 선택되는 응용. - 글루코사민의 제조에서, 바람직하게, 글루코사민-6-포스페이트(GlcN6P)를 촉매화하여 글루코사민(GlcN)을 생성하는데 있어서의 SEQ ID NOs: 1과 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드에 의해 코딩된 효소의 응용으로서,
바람직하게, 상기 뉴클레오티드는 SEQ ID NOs: 1과 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열이고;
바람직하게, 상기 효소는 SEQ ID NOs: 2와 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며;
바람직하게, 상기 효소는 SEQ ID NOs: 2와 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 99 % 또는 100 %의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 구비하고;
바람직하게, 상기 효소는 써모코쿠스 코다카렌시스(Thermococcus kodakarensis)로부터 유래된 당 포스파타제(UniProt 번호: Q5JJ45)인 것을 특징으로 하는 응용. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조되는 글루코사민.
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