CN116162673B - 一种多种功能糖联产的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种多种功能糖联产的方法，具体属于发酵技术领域，制备方法包括制备氨基葡萄糖、色谱分离氨基葡萄糖和葡萄糖混合物、制备果葡糖浆、酶法生产阿洛酮糖、双酶法制备葡萄糖酸钠，最后再通过脱色、离交、色谱分离方法，首次实现同一底物条件下氨基葡萄糖、果糖、阿洛酮糖与葡萄糖酸钠的联产，本发明还具有不需要多次灭酶和多次脱色的有益效果，本发明产物纯度高、副产物少。

Description

一种多种功能糖联产的方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种多种功能糖联产的方法。
背景技术
氨基葡萄糖俗称氨基糖，是一种重要的功能单糖。它是人体内形成软骨细胞的重要营养素，可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细胞的生长。氨基葡萄糖的生产方式一般有3种, 即甲壳素水解法、生物酶转化法与微生物发酵法。甲壳素水解法生产过程以及生产结束后得到的副产物会产量大量的环境污染物, 而且其原料会受到地域和季节的限制；微生物发酵法在实际操作中存在底物转化率低、工业放大困难且操作性不强的缺点；生物酶转化法是通过5个核心酶的级联催化反应将糊精和无机氨一步法转化为氨糖的方法，具有产品产率高、环境友好、体系易于放大等优点。
葡萄糖和果糖是同分异构体，可将葡萄糖液通过异构酶的作用转化成为果糖含量为42%的果葡糖浆；在最适pH条件下，异构酶能够充分发挥催化作用，所得异构糖液颜色浅，容易精制。
D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，具有高甜度、低能量、降血脂、降血糖等诸多优点，是理想的蔗糖替代品，在医药和食品等领域具有巨大的应用价值和市场前景。D-阿洛酮糖3-差向异构酶可以催化D-果糖发生C-3 位置的差向异构化反应，是生物转化制备D-阿洛酮糖的关键酶制剂。
葡萄糖酸钠生产多采用微生物发酵法和酶法，两种方法的原理均为葡萄糖氧化酶（GOD）和过氧化氢酶（CAT）催化葡萄糖和氧气反应生成葡萄糖酸，此过程中伴随着过氧化氢的合成与分解，葡萄糖酸经氢氧化钠中和产生葡萄糖酸钠。其中，酶法生产葡萄糖酸钠较微生物发酵法具有不需要菌种、不受各种辅料浓度影响、节省能源、工艺简化、操作方便、底物浓度高且纯度好、便于提取精制等优点。
以淀粉糊精为底物，通过5种酶的级联反应生成氨基葡萄糖和葡萄糖；葡萄糖通过酶法异构生成果葡糖浆，再以果葡糖浆为底物通过添加D-阿洛酮糖3-差向异构酶、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，实现阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的联产。通过上述方法能够在节约成本的基础上完成4种目标产物的生成。
发明内容
本发明提供一种多种功能糖联产的方法，包括以下具体步骤：
步骤1、制备氨基葡萄糖和葡萄糖混合物，将淀粉糊精和HEPES缓冲液中入反应装置，再依次加入磷酸盐、淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶、铵盐、6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶进行反应从而得到氨基葡萄糖和糊精混合物；在所述氨基葡萄糖和糊精混合物中加入糖化酶进行反应得到氨基葡萄糖和葡萄糖混合物；
步骤2、色谱分离氨基葡萄糖和葡萄糖混合物，制备葡萄糖溶液；
步骤3、制备果葡糖浆：将步骤2得到的葡萄糖溶液通过装填有葡萄糖异构酶的异构装置，制备果糖含量为41-42%的果葡糖浆；
步骤4、酶法生产阿洛酮糖：利用制备的果葡糖浆为底物，加入D-阿洛酮糖-3差向异构酶进行异构化，生成含有阿洛酮糖的产物；
步骤5、双酶法制备葡萄糖酸钠：在上述产物中加入过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，制备葡萄糖酸钠；
步骤6、脱色、离交、色谱分离：活性炭脱色，离子交换系统除盐，色谱分离阿洛酮糖、葡萄糖酸钠、果糖。
进一步的步骤3中所述葡萄糖溶液的DS为45-48%。
进一步的步骤3中所述装置的异构条件为进料温度为56±1℃，进料pH为7.7±0.1，Mg2+添加量为30ppm。
进一步的步骤3中所述的Mg2+来源于MgSO4·7H2O或MgCl2或Mg(NO3)2中的一种。
进一步的步骤4中所述异构化的异构条件为进料温度为59±1℃，进料pH为4.5±0.1，Mn2+加量为20ppm，异构时间为8-10h。
进一步的步骤4中所述的D-阿洛酮糖-3差向异构酶添加比例为6u/g果糖干物。
进一步的步骤4中所述的Mn2+来源于MnSO4·7H2O或MnCl2·4H2O中的一种。
进一步的步骤5中所述的葡萄糖酸钠制备方法为葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的添加比例为1.6kg:1.8kg/t葡萄糖干物，30%液碱控制pH为5.4±0.1,搅拌转速为300rpm，压力0.11-0.12MPa，反应时间为18-20h。
进一步的步骤5中所述的活性炭添加量为1‰。
进一步的所述步骤1制备氨基葡萄糖的制备方法为：将浓度为15g/L的淀粉糊精和浓度为23.83g/L的HEPES缓冲液加入反应装置中，加入浓度为2.72g/L的磷酸盐和浓度为2u/ml的淀粉磷酸化酶，在37℃，pH=7.0条件下反应2h；再依次加入浓度为2u/ml的葡萄糖磷酸变位酶和磷酸葡糖异构酶，相同条件下分别反应2h；加入浓度为2u/ml的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶和浓度为200mM的铵盐，反应2h；加入浓度为2u/ml的6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶，反应2h，得到氨基葡萄糖和糊精混合物；调节混合物温度为60℃，ph为4.2-4.4，按照0.14g/kg比例加入糖化酶反应18-20h，得到氨基葡萄糖和葡萄糖混合物。
进一步的步骤1中所述铵盐为氯化铵，磷酸盐为磷酸二氢钾。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明首次实现了同一底物条件下氨基葡萄糖、果糖、阿洛酮糖与葡萄糖酸钠的联产；
（2）与传统酶法工艺相比，本发明提供的氨基葡萄糖、阿洛酮糖和葡萄糖酸钠联产的方式具有节约时间和经济成本，不需要多次灭酶和多次脱色，产物纯度高、副产物少的优点。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、（1）制备氨基葡萄糖和葡萄糖：将浓度为15g/L的淀粉糊精和浓度为23.83g/L的HEPES缓冲液加入反应装置中，加入浓度为2.72g/L的磷酸二氢钾和浓度为2u/ml的淀粉磷酸化酶，在37℃、pH=7.0条件下反应2h；再依次加入浓度为2u/ml的葡萄糖磷酸变位酶和2u/ml磷酸葡糖异构酶，相同条件下分别反应2h；加入浓度为2u/ml的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶和浓度为200mM的氯化铵，相同条件下反应2h；加入浓度为2u/ml的6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶，相同条件下反应2h，得到氨基葡萄糖和糊精混合物；调节混合物温度为60℃，ph为4.2-4.4，按照0.14g/kg比例加入糖化酶反应18-20h，得到氨基葡萄糖和葡萄糖混合物；
（2）、所述淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶、6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶五种酶购自天津工业生物技术研究所；
（3）、色谱分离氨基葡萄糖和葡萄糖，氨基葡萄糖的浓度为10.5g/L；、葡萄糖的浓度为4.5g/L；
以实施例1得到的葡萄糖为底物进行后续转化，如实施例2-5及对比例1。
实施例2、（1）制备果葡糖浆：以实施例1得到的葡萄糖溶液为底物,添加30ppmMgSO4·7H2O，通过装填有葡萄糖异构酶的异构装置；控制进料温度为56℃，进料pH为7.7，制备果糖含量为41.5%的果葡糖浆；
（2）酶法生产阿洛酮糖：以制备的果葡糖浆为底物，按照6u/g果糖干物的比例加入D-阿洛酮糖-3差向异构酶；进料温度为59℃，进料pH为4.5，MnCl2·4H2O加量为20ppm，异构时间8h；
（3）双酶法制备葡萄糖酸钠：在上述产物中按照1.6kg:1.8kg/t葡萄糖干物的比例加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制备葡萄糖酸钠，30%液碱控制pH为5.4,搅拌转速为300rpm，压力0.11MPa,反应时间18h;
（4）脱色、离交、色谱分离：上述发酵液以1‰活性炭脱色，进离子交换系统除盐，色谱分离阿洛酮糖、葡萄糖酸钠、果糖；出料中阿洛酮糖含量为5.44%、葡萄糖酸钠含量为32.29%、果糖含量为13.65%。
实施例3、（1）制备果葡糖浆：以实施例1得到的葡萄糖溶液为底物,添加30ppmMgCl2，通过装填有葡萄糖异构酶的异构装置；控制进料温度为55℃，进料pH为7.6，制备果糖含量为41.7%的果葡糖浆；
（2）酶法生产阿洛酮糖：以制备的果葡糖浆为底物，按照6u/g果糖干物的比例加入D-阿洛酮糖-3差向异构酶；进料温度为58℃，进料pH为4.4，MnSO4·7H2O加量为20ppm，异构时间9h；
（3）双酶法制备葡萄糖酸钠：在上述产物中按照1.6kg:1.8kg/t葡萄糖干物的比例加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制备葡萄糖酸钠，30%液碱控制pH为5.3,搅拌转速为300rpm，压力0.12MPa,反应时间19h;
（4）脱色、离交、色谱分离：上述发酵液以1‰活性炭脱色，进离子交换系统除盐，色谱分离阿洛酮糖、葡萄糖酸钠、果糖；出料中阿洛酮糖含量为5.38%、葡萄糖酸钠含量为31.35%、果糖含量为13.39%。
实施例4、（1）制备果葡糖浆：以实施例1得到的葡萄糖溶液为底物,添加30ppm Mg(NO3)2，通过装填有葡萄糖异构酶的异构装置；控制进料温度为57℃，进料pH为7.8，制备果糖含量为41.6%的果葡糖浆；
（2）酶法生产阿洛酮糖：以制备的果葡糖浆为底物，按照6u/g果糖干物的比例加入D-阿洛酮糖-3差向异构酶；进料温度为60℃，进料pH为4.6，MnCl2·4H2O加量为20ppm，异构时间10h；
（3）双酶法制备葡萄糖酸钠：在上述产物中按照1.6kg:1.8kg/t葡萄糖干物的比例加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制备葡萄糖酸钠，30%液碱控制pH为5.5,搅拌转速为300rpm，压力0.11MPa,反应时间20h;
（4）脱色、离交、色谱分离：上述发酵液以1‰活性炭脱色，进离子交换系统除盐，色谱分离阿洛酮糖、葡萄糖酸钠、果糖；出料中阿洛酮糖含量为5.63%、葡萄糖酸钠含量为33.07%、果糖含量为13.92%。
实施例5、（1）制备果葡糖浆：以实施例1得到的葡萄糖溶液为底物,添加30ppmMgSO4·7H2O，通过装填有葡萄糖异构酶的异构装置；控制进料温度为56℃，进料pH为7.7，制备果糖含量为41.9%的果葡糖浆；
（2）酶法生产阿洛酮糖：以制备的果葡糖浆为底物，按照6u/g果糖干物的比例加入D-阿洛酮糖-3差向异构酶；进料温度为59℃，进料pH为4.5，MnSO4·7H2O加量为20ppm，异构时间9h；
（3）双酶法制备葡萄糖酸钠：在上述产物中按照1.6kg:1.8kg/t葡萄糖干物的比例加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制备葡萄糖酸钠，30%液碱控制pH为5.4,搅拌转速为300rpm，压力0.12MPa,反应时间19h;
（4）脱色、离交、色谱分离：上述发酵液以1‰活性炭脱色，进离子交换系统除盐，色谱分离阿洛酮糖、葡萄糖酸钠、果糖；出料中阿洛酮糖含量为5.83%、葡萄糖酸钠含量为33.57%、果糖含量为14.28%。
对比例1、（1）制备果葡糖浆：以实施例1得到的葡萄糖溶液为底物,添加30ppmMgSO4·7H2O，通过装填有葡萄糖异构酶的异构装置；控制进料温度为56℃，进料pH为7.7，制备果糖含量为41.9%的果葡糖浆；
（2）灭酶，活性炭脱色，离子交换系统除盐，色谱分离葡萄糖和果糖；
（3）酶法生产阿洛酮糖：以色谱分离的果糖为底物，按照6u/g果糖干物的比例加入D-阿洛酮糖-3差向异构酶；进料温度为59℃，进料pH为4.5，MnSO4·7H2O加量为20ppm，异构时间9h；
（4）灭酶，活性炭脱色，离子交换系统除盐，色谱分离阿洛酮糖和果糖；
（5）双酶法制备葡萄糖酸钠：以步骤（2）分离的葡萄糖为底物，按照1.6kg:1.8kg/t葡萄糖干物的比例加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶制备葡萄糖酸钠，30%液碱控制pH为5.4,搅拌转速为300rpm，压力0.12MPa,反应时间19h；
（6）脱色、离交、色谱分离：葡萄糖酸钠发酵液以1‰活性炭脱色，进离子交换系统除盐，经蒸发器、离心机得到葡萄糖酸钠；最终得到阿洛酮糖含量为5.83%、葡萄糖酸钠含量为33.57%、果糖含量为14.28%。
此对比例1经过多次脱色、多次离交、多次色谱分离程序。
本发明所述异构装置为提供异构反应的装置，所述异构装置购自泰安市乐泰机械制造有限公司，出厂型号LT2008001。
由实施例1-4及对比例1可知：一种阿洛酮糖与葡萄糖酸钠联产的方法能在同一底物的基础上实现多种产物的同时产出，相比传统酶法发酵流程中的多次脱色、多次离交、多次色谱分离程序，本发明仅经过单次的脱色、离交以及色谱分离程序，因此本发明大大节省了时间和经济成本，提高了生产效率。

Claims (5)

1.一种多种功能糖联产的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
步骤1、制备氨基葡萄糖和葡萄糖混合物，将淀粉糊精和HEPES缓冲液加入反应装置，再依次加入磷酸盐、淀粉磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、磷酸葡糖异构酶、6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶、铵盐、6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶进行反应从而得到氨基葡萄糖和糊精混合物；在所述氨基葡萄糖和糊精混合物中加入糖化酶进行反应得到氨基葡萄糖和葡萄糖混合物；
所述氨基葡萄糖的制备方法为：将浓度为15g/L的淀粉糊精和浓度为23.83g/L的HEPES缓冲液加入反应装置中，加入浓度为2.72g/L的磷酸盐和浓度为2u/ml的淀粉磷酸化酶，在37℃，pH=7.0条件下反应2h；再依次加入浓度为2u/ml的葡萄糖磷酸变位酶和磷酸葡糖异构酶，相同条件下分别反应2h；加入浓度为2u/ml的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶和浓度为200mM的铵盐，反应2h，所述铵盐为氯化铵，磷酸盐为磷酸二氢钾；加入浓度为2u/ml的6-磷酸氨基葡萄糖磷酸酶，反应2h，得到氨基葡萄糖和糊精混合物；调节混合物温度为60℃，pH为4.2-4.4，按照0.14g/kg比例加入糖化酶反应18-20h，得到氨基葡萄糖和葡萄糖混合物；
步骤2、色谱分离所述氨基葡萄糖和葡萄糖混合物，制备葡萄糖溶液；
步骤3、制备果葡糖浆：将步骤2得到的葡萄糖溶液通过装填有葡萄糖异构酶的异构装置，所述异构装置的异构条件为进料温度为56±1℃，进料pH为7.7±0.1，Mg2+添加量为30ppm，所述的Mg2+来源于MgSO4·7H2O或MgCl2或Mg(NO3)2中的一种，所述步骤2得到的葡萄糖的浓度为4.5g/L，制备果糖含量为41-42%的果葡糖浆；
步骤4、酶法生产阿洛酮糖：利用制备的果葡糖浆为底物，加入D-阿洛酮糖-3差向异构酶进行异构化，生成含有阿洛酮糖的产物；
步骤5、双酶法制备葡萄糖酸钠：在上述产物中加入过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，制备葡萄糖酸钠，所述葡萄糖酸钠制备方法为葡萄糖氧化酶的添加量为1.6kg/t葡萄糖干物，过氧化氢酶的添加量为1.8kg/t葡萄糖干物，30%液碱控制pH为5.4±0.1,搅拌转速为300rpm，压力0.11-0.12MPa，反应时间为18-20h；
步骤6、脱色、离交、色谱分离：活性炭脱色，离子交换系统除盐，色谱分离阿洛酮糖、葡萄糖酸钠、果糖。
2.根据权利要求1所述的一种多种功能糖联产的方法，其特征在于，步骤4中所述异构化的异构条件为进料温度为59±1℃，进料pH为4.5±0.1，Mn2+加量为20ppm，异构时间为8-10h。
3.根据权利要求1所述的一种多种功能糖联产的方法，其特征在于，步骤4中所述的D-阿洛酮糖-3差向异构酶添加比例为6u/g果糖干物。
4.根据权利要求2所述的一种多种功能糖联产的方法，其特征在于，步骤4中所述的Mn2+来源于MnSO4·7H2O或MnCl2·4H2O中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种多种功能糖联产的方法，其特征在于，步骤6中所述的活性炭添加量为1‰。
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