DE1567323B2

DE1567323B2 - Verfahren zur Herstellung von Fructose durch enzymatische Umwandlung von Glucose

Info

Publication number: DE1567323B2
Application number: DE1567323A
Authority: DE
Inventors: Yoshiyuki Takasaki; Osamu Tanabe
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1965-05-11
Filing date: 1966-03-16
Publication date: 1975-06-12
Also published as: BE678033A; GB1103394A; DE1792748A1; DE1567323A1; SE336992B; CH473221A; DE1792748B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fructose aus Glucose mittels eines Glucose isomerisierenden Enzyms, das von einem Mikroorganismus der Genus Streptomyces stammt.

Die bisher für die Umwandlung von Glucose in Fructose bekanntgewordenen Verfahren umfassen die Alkalimethode und die enzymatische Methode. In der praktischen Anwendung haben jedoch die Verfahren gewisse Nachteile.

Die Alkalimethode hat den Nachteil, daß ein Zuckerverlust durch Zersetzung auftritt, die Umwandlungsgeschwindigkeit gering ist und das Reaktionsprodukt stark gefärbt ist und als Nachbehandlung eine kostspielige Reinigung erfordert. Weiter bedingt die Methode das Auftreten von Nebenprodukten, welche den Geschmack des Hauptproduktes und seine Verwendbarkeit als Süßungsmittel für Nahrungszwecke beeinträchtigen.

Die enzymatische Methode bewirkt die Umwandlung von Glucose in Fructose mittels eines Enzyms. Es wurde gezeigt, daß mehrere Arten von Mikroorganismen das Enzym erzeugen. Zum Beispiel haben S. M i t s u h a s h i et al mitgeteilt, daß ein solches Enzym in Lactobacillus pentosus gefunden wurde (J. Biol. Chem., 204, 1011 [1953]), Marshai et al fanden ein ähnliches Enzym in Pseudomonas hydrophila (Science, 125, S. 648 [1957]), S. Tsumura et al ein weiteres Enzym in Aerobacter cloacae (Agr. Biol. Chem., [Japan], 25, 616 [1961]), M. Na take et al ein weiteres Enzym in Aerobacter aerogenes (Agr. Biol. Chem., [Japan] 27, 342 [1963]), und in Escherichia intermedia (Agr. Biol. Chem., 28, 505 [1964]) und Y. Takasaki ein weiteres Enzym in Bacillus megaterium (Nippon Noeei Kagaku Kaishi), (J. Agr. Biol. Soc, [Japan], 36, 1010 [1962]).

Es war jedoch nicht möglich, die von diesen Mikroorganismen erzeugten Glucose isomerisierenden Enzyme in technischen Maßstab zu erzeugen oder anzuwenden.

1. Die bisher für die Fähigkeit der Erzeugung Enzyme bekannten Mikroorganismen haben geringe Fähigkeit zur Enzymerzeugung, um Massenproduktion des Enzyms technisch dur führbar zu machen;

2. die Isomerisierungsreaktion durch Verwendi solcher Enzyme erfordert das Einbringen \ schädlichem Arsenat oder Mn ⁺⁺ in das Zu tungsmedium. Die Verwendung derartiger S stanzen stellt jedoch ein schwerwiegendes P blem bei Nahrungsmitteln dar;

3. die Enzyme sind nicht so stabil und brauchl wie dies für die industrielle Anwendung erford

lieh ist.

Die Erfindung betrifft nun die Herstellung eir Glucose isomerisierenden Enzyms in hoher Ausbei und demgemäß unter geringen Kosten durch V wendung eines Mikroorganismus der Genus Strep; myces. Es wurde festgestellt, daß das durch die Gen Streptomyces erzeugte Enzym stabil ist und aus; zeichnete Eigenschaften aufweist, die es sehr geeig! für die industrielle Verwendung machen. Es wui nun möglich, dieses Glucose isomerisierende Enz; in technischem Maßstab durch den genannten Miki Organismus herzustellen und die technische Erzeugu von Fructose aus Glucose durch Anwendung die: Enzyms durchzuführen.

Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren ζ Herstellung von Fructose aus Glucose durch Ei wirkung des durch einen Mikroorganismus der Gen Streptomyces erzeugten Glucose isomerisierendi.

■ Enzyms.

Das Glucose isomerisierende Enzym kann beispie, weise gebildet werden, indem der erfindungsgemi verwendete Mikroorganismus in einem Medium g züchtet wird, daß i)-Xylose enthält. Aus wirtscha: liehen Gründen kann es bei der Herstellung des E zyms vorteilhafter sein, die Mikroorganismen in eine Medium zu züchten, daß Xylan oder xylanhalti. Materialien aufweist.

Xylan besteht hauptsächlich aus «-Xyloseeinheite Es ist eine der Hauptkomponenten von Hemicellulos die in praktisch allen Landpflanzen vorliegt. D-Xylo: wird kommerziell durch Säurehydrolyse von XyIa hergestellt.

Das Verfahren zur Herstellung des Glucose isc merisierenden Enzyms, das in der vorliegenden E findung verwendet wird, ist im wesentlichen wie folg Diese Glucoseisomerase wird durch Züchtung ein*

gewissen Art von Mikroorganismus, der die Fähigke zur Assimilierung von Xylan hat und Glucoseisi merase produziert, in einem Medium erhalten, d; Xylan und/oder xylanhaltige Materialien enthält (X; lan oder seine Derivate mit D-Xyloseeinheiten i xylanhaltigen Materialien werden durch Xylana.¹ hydrolysiert, die durch diese Art von Mikroorgani. mus erzeugt wird und als Induktionsmittel für d:

Erzeugung des Glucose isomerisierenden Enzyn durch den Mikroorganismus dient).

Zu den xylanhaltigen Materialien, die für die vo; liegende Erfindung verwendbar sind, gehören al: pflanzlichen Materialien von auf dem Lande wacl senden Pflanzen, die Xylan enthalten, wie Stroi Weizenspreu, Maiskolben, Maisblätter. Reis, KIe; und Holz und ihre Derivate, einschließlich Abfal flüssigkeiten, die aus der Verarbeitung von pflan;

lichem Material stammen, wie die verschiedenen Arten von Zellstoffablauge und Maisquellwasser. Das heißt, alle Materialien, die Substanzen enthalten, die nach Hydrolyse durch die von erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus erzeugte Xylanasesubstanzen, wie die Xylose liefern, was zur Erzeugung bzw. Induktion von Glucose isomerisierenden Enzym führt, sind vom Ausdruck »xylanhaltiges Material« umfaßt. ;..-. . : -■ .-

Das erfindungsgemäß verwendete Glucose isomerisierende Enzym wird durch Züchtung des Mikroorganismus der Genus Streptomyces in irgendeinem wäßrigen Medium, wie sie beispielsweise in den Ausfuhrungsbeispielen gezeigt sind, erzeugt.

Das Glucose isomerisierende Enzym tritt überwiegend in den Mikroorganismenzellen auf. Nach beendeter Züchtung werden daher diese Zellen gesammelt und als Enzymquelle verwendet. Tatsächlich ist natürlich das lösliche Enzym die eigentliche Enzymquelle.

Die Umwandlung von Glucose in Fructose wird bewirkt, indem man dieses Enzym auf die Glucoselösung einwirken läßt. Das durch Einwirkung des Mikroorganismus der Genus Streptomyces gebildete Enzym ist über einen weiten Bereich von pH-Werten, Temperaturen und Glucosekonzentrationen wirksam und zeigt sich daher als besonders vorteilhaft für die technische Glucoseisomerisierung. Die Erfindung bietet den zusätzlichen Vorteil, daß die Isomerisierung ohne Vorliegen von schädlichen Materialien durchgeführt werden kann. Wahlweise kann die Glucoseisomerisierung bis zu einem solchen Ausmaß durchgeführt werden, daß bis zu etwa 50% der anfänglichen Glucose in Fructose überführt werden. Dies führt zur Erzeugung eines Sirups, der praktisch die Süßeigehschaften von Invertzucker hat.

Damit die enzymatische Isomerisierung von Glucose zu Fructose wirtschaftlich ist, ist es wichtig, daß die Zuckerlösung möglichst keine Verfärbung annimmt, der Zuckerverlust so gering wie möglich ist, die Bildung von Nebenreaktionsprodukten durch Alkali verhindert wird und die Umwandlungsgeschwindigkeit erhöht ist. Es wurden daher Untersuchungen durchgeführt, wie die Umwandlung von Glucose in Fructose durch die von Mikroorganismen der Genus Streptomyces gebildete Glucoseisomerase mit technischem Vorteil durchgeführt werden kann.

Es wurde festgestellt, daß die Bedingungen, welche diesen Zweck erfüllen, wie folgt sind:

Die Isomerisierung durch das erfindungsgemäß verwendete Enzym kann bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,5 und etwa 8, vorzugsweise etwa 6,8 und etwa 7,2, durchgeführt werden, wobei pH 7 der Optimalwert ist. Die Reaktionstemperatur kann zweckmäßig im Bereich zwischen etwa 45 und etwa 80° C liegen und beträgt vorzugsweise etwa 60 bis 70° C.

Es ist am besten, die Glucosekonzentration auf den höchst zulässigen Wert einzustellen. Die Umwandlung in Fructose kann nicht nur aus reiner Glucose, sondern ebenso gut aus Glucose bewirkt werden, die in billigen Rohmaterialien, wie Stärkehydrolysat und Hydrolsirup (Restflüssigkeit aus der Stärkehydrolyse nach Auskristallisieren der Glucose) verwendet werden.

Bei der Isomerisierungsreaktion wird im allgemeinen Magnesiumsalz und/oder Kobaltsalz als Mittel zur Aktivierung und Stabilisierung des Enzyms zugesetzt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiell

Ein vorsterilisiertes Medium von 400 ml, das 3% Weizenkleie (mit einem Xylangehalt von 21%), 4% Reismaischwasser, 0,1% MgSO₄ · 7H₂O und 0,3% NaCl enthielt, wurde mit Streptomyces albus, Stamm YT-Nr. 4 geimpft und unter Schütteln 20 bis 30 Stunden bei einer Temperatur von 30° C kultiviert. Aus diesem Ansatz erhaltene Saat wurde in 101 Medium vorstehender Zusammensetzung transplantiert und weiter unter Belüftung mit einem Schüttelfermentiergerät kultiviert (Belüftungswert 7,51/Min.; 200 U/Min.; 30° C). Die Aktivität des Glucose isomerisierenden Enzyms in den Zellen erreicht innerhalb 20 bis 25 Stunden ihr Maximum. Die Aktivität des Glucose isomerisierenden Enzyms wurde mit folgender Reaktionsmischung bestimmt: ..

0,2 m Phosphatpuffer-Lösung

(pH 7,5) 0,5 ml

Im Glucose-Lösung ....:.. 0,2ml

0,1 m MgSO₄ · 7H₂O-Lösung ..... 0,1 ml
Enzym-Lösung 0,2—0,3 ml

Der vorstehende Ansatz wurde auf ein Gesamtvolümen von 2 ml mit Wasser aufgefüllt und bei 70° C 1 Stunde inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 2 ml 0,5 m Perchlorsäure gestoppt. Der Fructosegehalt wurde nach der Cystein-Carbazol-Methode bestimmt. Die Menge Enzym, die aus Glucose Γ mg Fructose pro Stunde bei 70° C und den obigen Versuchsbedingungen erzeugt, wird als eine Enzymeinheit definiert. ■ : . .'^ ^; .·.-.:;·■ .'

Aus 50 ml der obigen Kulturlösung wird die Zellmasse durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen, in Wasser suspendiert und 15 Minuten mit 10 kHz beschallt. Nach der Schallbehandlung werden 30 ml der überstehenden Lösung gewonnen und als Enzymquelle verwendet. Die Enzymaktivität betrug 623 Einheiten.

Zu dieser Enzymlösung wurden dann 50 g Glucose, 5 ml 0,1-m MgSO₄ · 7H₂O, 25 ml 0,2-m Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,5) und Wasser gegeben. Das Gesamtvolumen wurde mit Wasser auf 100 ml eingestellt. Die Mischung wurde bei 65° C 50 Stunden inkubiert, während der pH-Wert während der Reaktion zwischen 6,8 und 7,2 gehalten wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit mit einem Ionenaustauscher-Harz zur Entfernung von anorganischem Salz und Protein behandelt und dann im Vakuum eingedampft.

Es wurde ein süßer Sirup, bestehend aus 54% Glucose und 46% Fructose, erhalten. Aus dieser Mischung wurde nach herkömmlichen Verfahren Zugabe von Kalkmilch Komplexe aus Fructose und Calcium abgetrennt. Die erhaltene Fructose wurde weiter entfärbt und nach Konzentrierung durch Verminderung des Druckes zur Entfernung von Lösungsmittel kristallisiert. Es wurden 11g Fructose erhalten.

Das Produkt wurde papierchromatographisch auf Fructose untersucht, wobei Phenol zu Wasser (4:1) oder Pyridin zu Butanol zu Wasser (4:6:3) als Lösungsmittel verwendet wurden. Ein Resorcin-Reagenz, welches eine rote, für Ketose spezifische Färbung erzeugt, wurde als Mittel zur Identifizierung verwendet.

Hierdurch wurde festgestellt, daß der Rf-Wert genau dem Rf-Wert von Vergleichsfructose entspricht. Die

Drehung einer Lösung des Produktes war ebenfalls genau gleich dem Wert einer Standardfructoselösung.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde reines Xylan als Kohlenstoffquelle des Mediums verwendet sowie Streptomyces flavovirens ATCC Nr. 3320, Streptomyces achromogenus ATCC Nr. 12 767, Streptomyces echinatus (NIHJ 180) und Streptomyces albus (YT-Nr. 4) verwendet.

Diese Mikroorganismen wurden in ein Medium

Tabelle I

von 50 ml bei 30° C kultiviert, welches 1 % Polypeptc 0,3% K₂HPO₄, 0,1% MgSO₄-7H₂O und 0,5 Xylan enthielt. Nach der Impfung wurde das Mediu geschüttelt. Nach der Kultivierung wurden die Zeil, durch Zentrifugieren gesammelt und die gesammelt; Zellen nach dem Waschen mit Wasser in Wass suspendiert und 150 Minuten mit 1OkHz beschal Nach dieser Schallbehandlung wurde 20 ml überst hende Flüssigkeit gewonnen und als Enzymlösur verwendet. Die Aktivitäten der erhaltenen Enzyr lösungen sind in der folgenden Tabelle wiedergegebe

Kulturen	Anfangs-Xylan	Rest-Xylan	Enzymaktivität	Protein der Zelle	Kultivierzeit
	(g/50 ml Medium)	(g/50 ml Medium)	(Einheiten)	(mg)	(Std.)
St. flavovirens ATCC Nr. 3320	0,25	0,20	10,0	66,4	14
St. achromogenus ATCCNr. 12 767	0,25	0,16	41,2	76,8	10
St. echinatus NiHJ 180	0,25	0,19	32,8	82,3	22 ■
St. albus (YT Nr. 4)	0,25	0,07	122,8	86,4	34

Die in Tabelle 1 gezeigte Enzymaktivität gibt die Fructosemenge wieder, die erzeugt wurde, wenn 80 ml der 0,1-m Glucoselösung mit 20 ml Enzymlösung 1 Stunde bei 70° C reagieren gelassen werden. Obwohl Unterschiede in der Enzymaktivität bestehen, ergab jeder xylanassimilierende Stamm Glucose isomerisierendes Enzym.

Beispiel 3

Dieses Beispiel gibt die Ergebnisse der Durchführung der Isomerisationsreaktion bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung einer in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 hergestellten Enzymlösung wieder.

Die Reaktionslösungen enthielten 18 g Glucose, 25 ml 0,1-m Phosphatpuffer-Lösung mit verschiedenen pH-Werten (25 ml einer 0,1-m Glyzin-NaOH-Pufferlösung wurden nur bei einem pH-Wert von 9 ange wandt), 5 ml 0,1-m MgSO₄ · 7H₂O und 260 Einheite; einer Enzymlösung. Nachdem der pH-Wert der Lo sungen auf 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 8,0 bzw. 9,0 eingestell worden war, wurde das Gesamtvolumen jeder Lösum auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt und die Lösunger 50 Stunden bei 65° C gehalten. Der Fructosegehal der Lösungen wurde nach 20 und 50 Stunden ana lysiert. Die pH-Werte der Lösungen wurden konstan gehalten, indem sie alle 6 Stunden mit NaOH nach gestellt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.

Wenn der pH-Wert der Reaktion alkalisch ist, trit eine Isomerisation auf, die nicht auf der Enzym reaktion beruht. Tabelle III gibt die Werte wieder die erhalten werden, wenn die durch nichtenzymatisdu Reaktion gebildete Fructose abgezogen wird.

Tabelle II	Reaktion (pH) 5,0 5,5	6,0	6,5	7,0	8,0	9,0
Reaktionszeit (Std.)	1,9 g 2,7 g	3,5 g 5,4 g	5,1g 7,5 g	6,8 g 10,0 g	7,1g 9,3 g	7,5 g 8,9 g
20 50

Die obengenannten Werte zeigen die aus Glucose gebildeten Fructosemengen. Tabelle III

Reaktionszeit
(Std.)

Reaktion (pH)

5,0 5,5

6,0

7,0

8,0

50 1,9 g 2,7 g 5,4 g 6,8 g 9,0 g 3,9 g

Die obengenannten Werte zeigen die aus Glucose gebildeten Fructosemengen.

9,0

2,1g

Beispiel 4

Dieses Beispiel gibt den Einfluß der Temperatur auf die Reaktion bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 wieder. Die Enzymlösung wurde nach der im Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt.

Die Reaktionslösungen enthielten 18,0 g Glucose, 25 ml 0,2-m Phosphatpufferlösung, 5 ml 0,1-m MgSO₄ · 7H₂O und 433 Einheiten an Enzymlösung. Das Volumen der Lösungen wurde mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Die Reaktion wurde bei Temperatüren von 40, 45, 50, 60, 65, 70 und 80° C durchgeführt. Die pH-Werte der Lösungen wurden im Bereich von 6,8 bis 7,2 gehalten, indem sie alle 12 Stunden mit NaOH nachgestellt wurden. Der Fructosegehalt der Lösungen wurde in Abständen von 20 und 40 Stunden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt.

Die Ergebnisse zeigen, daß das vorliegende Enzym in der Lage ist, bei unerwartet hohen Temperaturen zu reagieren, was bedeutet, daß.-das vorliegende Enzym eine überlegenere Hitzebeständigkeit aufweist: Der bevorzugte Temperaturbereich der Enzymreak-: tion liegt jedoch zwischen 45 und 80° C. Reaktion bei einer Temperatur oberhalb 80°C kann die.Bildung einer Verfärbung in Sirup infolge Wärmezersetzung des Zuckers bewirken.. ■'·.-■;.'■ .: :. ■ .'

Tabelle IV	Reaktionstemperatur (''C) 40 45	50	60	' " " 65■■■■'■■	•'^{; :} /70 ^:	■ ■ ·· ₈₀ :\Y-.C ..'■
Reaktionszeit (Std.)

20	2,2 g	2,8 g	4,0 g	6,0 g	8,5 g	8,6 g
44	4,6 g	5,5 g	7,0 g	8,3 g	8,9 g ■	8,9 g

Die obengenannten Werte zeigen die aus Glucose gebildeten Fructosemengen.

Beispiel 5

Es wurden Versuche durchgeführt, um den Einfluß auf die Reaktion unter Abänderung der Glucosekonzentration zu bestimmen. Der pH-Wert der Reaktion wurde zwischen 6,8 und 7,2 und die Temperatur auf 65° C eingestellt. Die untersuchten Glucoselösungen besaßen Konzentrationen von 18, 36, 50, 60 und

Tabelle V

8,9 g"
8,8 g

70% Glucose. Die Zusammensetzung der Reaktionslösungen geht aus Tabelle V hervor. Die Enzymlösung wurde entsprechend der Arbeitsweise des Beispiels 1 zubereitet. Die Ergebnisse sind in der . Tabelle VI wiedergegeben. :

Aus den in Tabelle VI wiedergegebenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß in die vorliegende Isomerisierungsreaktion zur Herstellung von Fructose auch vor sich geht, wenn die Glucosekonzenträtion in der Lösung hoch ist. ;....■ ·'·.■;·.,..·■·.

	Glucose (g)	Konzentration	36% ,,	von Glucose	50% :	50%	60%	60%	;70% ^;
	0,2-m Phosphat	18%	36%		50	60		70
	puffer-Lösung (ml)	18	36	20	20	20
	0,1-m MgSO₄-7H₂O	20	20
	(ml)			5	5	5
	0,1-m CoCl₂-6H₂O (ml) Enzym-Lösung (Ein	5	5
	heiten)			1	Γ	:^:. ; . 1".
	Reaktionsvolumen	1	1	307	307	307 ..:■;,...
	(ml)	307	307
				100	100	' ; ίόο;" ■:
	100	100

Tabelle VI
Reaktionszeit	Glucosekonzenträtion			70%
(Std.)	18%

8,5 g

9.5 g

9.6 g 9,6 g

53,3%

13,2 g 18,2 g 19,0 g 19,5 g

54,2%

Konversionsverhältnis nach
92stündiger Reaktion*)

*) Prozentverhältnis von erhaltener Fructose zu anfangs vorhandener Glucose.

15,8 g
24,0 g
25,5 g
26,0 g

52,0%

17,8 g
25,6 g
28,2 g
31,2g

52,0%

17,1	g
29,6	g . _:
32,0	g . ■ ·
34,9	g
49,9	%
509 524/402

Die Werte zeigen die aus Glucose gebildeten Fructosemengen.

Beispiele

Ein Saatmedium (50 ml) aus 1 % Xylose, 1 % PoIypepton, 0,3% K₂HPO₄, 0,1% MgSO₄ · 7H₂O wurde in einen Kolben gegeben und sterilisiert. Dann wurde Streptomyces albus (YT-Nr. 4) in das Medium eingeimpft und 3 Tage bei 30° C kultiviert. Diese Kultur wurde dann als Saat für den folgenden Versuch verwendet. . -. . .

Das Medium zur Herstellung des Enzyms enthielt 5% Reiskleie, 3% Maismaischwasser, 0,1% MgSO₄ ■ 7H₂O und wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. 100 ml hiervon wurden in einen 50-ml-Kolben gegeben und sterilisiert. Dann wurden sie mit 4 ml der vorgenannten Saat geimpft und unter Schütteln 30 Stunden bei 30° C kultiviert. Aus 50 ml dieser Kultur hergestellte Enzymlösung besaß eine Enzymaktivität von 700 Einheiten. Die kultivierten Zellen wurden dann durch Zentrifugieren gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden dann in Wasser suspendiert und durch 15minutige Beschallung mit 10 IdHz zerstört. Die zerstörten Zellen wurden zentrifugiert, und die " erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde als Enzymquelle verwendet. Diese Enzymlösung wurde mit 200 g Glucose der gleichen Weise wie im vorangegangenen Beispiel umgesetzt. 49,5% der als Substrat für das Enzym verwendeten Glucose (200 g) wurden zu Fructose umgewandelt. Nach Entfernung des Proteins und Reinigung unter Verwendung von Aktivkohle und Ionenaustauscherharz wuide die obengenannte Reaktionslösung auf einen Wassergehalt von 25% konzentriert. Die Ausbeute betrug 195 g, gemessen als wasserfreie Substanz.

Beispiel 7

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von Maishülsen und Maiskolben als Xylanquellen.

Das Medium (50 ml 7,5), welches 4% Maismaischwasser, 0,1% MgSO₄ · 7H₂O, 0,025% CoCl₂ · 6f und 3% Maishülsen oder 3% Maiskolben enth die auf eine Siebgröße Nr. 50 zerkleinert wurden, v. den in einen 200-ml-Kolben gegeben und sterilis: Dann wurde das Medium mit Streptomyces al ATCC 21 132 (YT-Nr. 5) geimpft und 48 Stunden ui Schütteln bei 30⁰C kultiviert. Die Aktivität der C cose isomerisierenden Enzyme ist wie in Tabelle angegeben.

Tabelle VII	Xylan-Quelle	Enzymaktivität (Einheiten)
Blindprobe Maishülsen Maiskolben	24,5 481,0 320,5

Die Glucose isomerisierenden Enzyme werden

' Verwendung von Maishülsen und Maiskolben

Xylanquelle erzeugt.

Die Enzymlösung, welche 481 Einheiten Enzy aktivität aufweist und die in dem Verfahren un Verwendung von Maishülsen als Xylanquelle erhall wurde, wurde zu 100 g Glucose (wasserfrei), 50

0,2-m Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,5) und 10: 0,1-m MgSO₄ · 7H₂O gegeben. Das Gesamtvolum wurde mit Wasser auf 200 ml aufgefüllt. Die Mischu; wurde bei 70° C geimpft. Während der Reaktion wur< der pH-Wert zwischen 6,8 und 7,2 mit NaOH gehaltt

Nach der Reaktion wurde Protein aus der Reaktior lösung entfernt und die Lösung unter Verwendung vi Aktivkohle und Ionenaustauscherharz gereinigt. E Lösung wurde dann bis auf einen Wassergehalt vi 25% konzentriert. Die nach dem obigen Verfahr

erhaltene Ausbeute betrug 98,0 g wasserfreie Substai

Beispiel 8

In diesem Beispiel wurde die aus der ersten Kristallisation von Dextrose aus Stärkehydrolisat erhaltene Mutterlauge (Hydro!) als Enzymsubstrat ver wendet.

Ein Medium, das 3% Weizenkleie, 4% Maismaischwasser, 0,1% MgSO₄-7H₂O und 0,025% CoCl₂-6H₂O enthielt, wurde mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Hiervon wurden 100 ml in einen 500-ml-Kolben gegeben und sterilisiert. Dann wurden 4 ml Mediumlösung (Streptomyces albus ATCC 21 132 (YT-Nr. 5), die in dem Beispiel 6 beschriebenen Saa medium kultiviert wurden, in das Medium eingeimp und bei 30° C unter Schütteln 48 Stunden kultivie: Die aus 50 ml der Brühe hergestellte Enzymlösui besaß eine Aktivität von 760 Einheiten. Durch Zent: fugieren wurden kultivierte Zellen aus 50 ml Brüi gesammelt. Die Zellen aus diesem Arbeitsschritt widen gewaschen und als Enzymquelle verwendet.

Als Substrat zur Isomerisation wurde Mutterlau: mit einem D. E.-Wert von 87 verwendet.

D. E. = Dextroseeinheit = Menge an als Glucose berechnetem, reduzierendem Zucker Menge an Feststoff

100

Enzym, 0,025-m Mg(OH)₂ und 0,001-m CoCIfI₂ · 6H₂O wurden zu 100 g Mutterlauge gegeben und auf ein Gesamtvolumen von 200 ml mit Wasser aufgefüllt. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. Es wurde dann bei 70" C inkubiert. Während der Reaktion wurde der pH-Wert im Bereich zwischen 6.8 und 7,2 gehalten. Nach 50 Stunden waren 45% der Glucose zu Fructose konvertiert. Nach Entfernung der Zellen aus d Reaktionslösung wurde die Reaktionslösung unt Verwendung von Aktivkohle und Ionenaustausch!. harz gereinigt und dann konzentriert, bis der Wassi gehalt 25% erreichte. Die Zusammensetzung d Produktes betrug 26% Fructose; 31,8% Gluco? 17,2% Oligosaccharide und 25% Wasser.

Beispiel 9

Ein Saatmedium, welches 1% Xylose, 1% PoIypepton, 0,3% K₂HPO₄. und 0,1% MgSO₄ · 7H₂O enthielt, wurde in einen Kolben gegeben und sterilisiert. Dann wurde das Medium mit Streptomyces albus (YT-Nr. 4) geimpft und 48 Stunden bei 3O⁰C kultiviert, um eine Impflösung herzustellen. Um die Zellenproduktion zu steigern, wurde eine Impflösung aus der Saatstufe zur Impfung von 501 Medium zu impfen und dieses wurde kultiviert. Letzteres wurde verwendet, um 5001 Medium zu impfen, und diese wurden kultiviert, und schließlich wurden diese zur Impfung von 50001 Medium verwendet und diese kultiviert. Die Zusammensetzung der bei dieser Behandlung verwendeten Medien (unter Ausschluß des Saatmediums) betrug 3% Weizenkleie, 4% Maismaischwasser, 0,1% MgSO₄-7H₂O und 0,025% CoCl₂ ■ 6H₂O und Wasser. Nach der Sterilisation dieses Mediums wurde der Anfangs-pH-Wert auf 6,5 mit NaOH eingestellt, die Kultivierung wurde bei 30° C bei einer Belüftung in einer Menge von einem Drittel des Volumens der Brühe pro Minute und 200 U/pm Rührgeschwindigkeit durchgeführt. Nach 24 Stunden erreichte die Enzymaktivität ein Maximum. Die aus 50 ml Brühe hergestellte Enzymlösung besaß eine Aktivität von 750 Einheiten.

Nach Abschluß der Reaktion wurde die Weizenkleie in der Brühe unter Verwendung eines Siebes entfernt. Die Zellen wurden unter Verwendung einer Filterpresse gesammelt, wobei 1000 kg Zellen gewonnen wurden. Die gewonnenen Zellen wurden dann in Wasser suspendiert. Die schlammigen Zellen wurden mittels einem Hochdruckhomogenisierer zerstört. Die zerstörten Zellen wurden als Enzymquelle verwendet.

Als Substrat zur Isomerisierung wurde ein konvertierter Stärkesirup von D. E. = 92,5 in einer Konzentration von 50% (bestehend aus 87% Glucose und 13% Disaccharid enthaltendem Oligosaccharid) verwendet. 15 000 kg (berechnet als Feststoff) des obigen konvertierten Stärkesirups wurden in einem Isomerisierungstank von 30 m³ Kapazität gegeben. 0,0025-m Mg(OH)₂ wurden zugegeben und nachdem der Sirup auf 65° C erhitzt worden war, wurde die Enzymquelle zugefügt. Der pH-Wert wurde in der Nähe von 7,0 mittels NaOH gehalten. In der Zeichnung ist das Konversionsverhältnis, der Temperatureinfluß und der pH-Einfluß während des Isomerisierungsvorganges wiedergegeben.

Nach 90 Stunden erreichte das Konversionsverhältnis ungefähr 45%. Die Reaktionslösung wurde dann unter Verwendung von Aktivkohle und Ionenaustauscherharz wie bei dem konventionellen Reinigungsprozeß gereinigt. Die Lösung wurde auf einem Wassergehalt von 25% konzentriert. Die Ausbeute an hergestelltem Produkt betrug 19 600 kg. Eine Analyse dieses Produktes ergab 29,6% Fructose, 36% Glucose, 9,4% Disaccharid enthaltendes Oligosaccharid und 25% Wasser.

Beispiel 10

Unter Anwendung der Arbeitsweise von Beispiel 9 wurden Saatkultivierung, Zwischenkultivierung und Hauptkultivierung aufeinanderfolgend durchgeführt.

Die Mediumzusammensetzung enthielt 3% Weizenkleie, 4% Maismaischwasser, 0,1% MgSO₄ -7H₂O und 0,025% CoCl₂ · 6H₂O. Nach dem das Medium sterilisiert worden war,, wurde der Anfangs-pH-Wert des Mediums mit NaOH auf 6,5 eingestellt und die' Kultivierung bei 30° C, einer Belüftung mit einem Drittel des Volumens der Brühe pro Minute und einem Rühren bei 200 U/Min, durchgeführt. Nach 24 Stunden erreicht die Zellaktivität ein Maximum. Die Zellen wurden mittels einer Filterpresse gesammelt, wobei 900 kg Zellen erhalten wurden. Die.gesammelten Zellen wurden als Enzymquelle verwendet.

Als Substrat zur Isomerisierung wurde ein Stärkesirup in 50%iger Konzentration mit einem D. E.-Wert von 97,0 (bestehend aus 95% Glucose und 5% Disaccharid enthaltendes Oligosaccharid) verwendet. 15 000 kg (berechnet als Feststoffgehalt) des obengenannten, konvertierten Stärkesirups wurde in einem Isomerisierungsbehälter von 30 m³ Fassungsvermögen gegeben. 0,0O25-m MgSO₄ -7H₂O wurden zugefügt, der Sirup auf 65° C erhitzt und die Enzymquelle zugesetzt. Der pH-Wert wurde auf ungefähr 7,0 mit

' NaOH gehalten.

Nach 100 Stunden betrug das Konvertierungsverhältnis etwa 47%. Die Reaktionslösung wurde dann mit Aktivkohle und Ionenaustauscherharz wie bei konventionellen Reinigungsprozessen gereinigt. Das Nachkonzentrieren auf ein Wassergehalt von 25% erhaltene Produkt wog 19 500 kg. Analyse dieses Produktes ergab: 33,4% Fructose, 37,7 Glucose, 3,9% Disaccharid enthaltendes Oligosaccharid und 25% Wasser.

Das enzymatische Verfahren der Erfindung stellt einen neuen und wirtschaftlichen Weg zur Konvertierung von Glucose in Fructose dar, und das Endprodukt ist ein Fructose enthaltender Sirup, welcher eine Invertzucker äquivalente Süßigkeit besitzt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Fructose durch enzymatische Umwandlung von Glucose, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzym verwendet, das von einem Mikroorganismus der Genus Streptomyces stammt, der auf die Erzeugung der Glucoseisomerase eingestellt ist und die Isomerisierung bei einer Temperatur zwischen etwa 45 und etwa 80⁰C und bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und 8,0 durchgeführt wird. . '

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein solcher der Genus Streptomyces verwendet wird, der Xylan und/oder Xylose assimilieren kann.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym von einem Mikroorganismus stammt, der in einem Medium gezüchtet wurde, daß Xylan, xylanhaltiges Material oder D-Xylose enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als glucosehaltige Lösung Stärke-Hydrolysate oder Hydrol verwendet wird.

Einige der Gründe hiervon sind die folgenc