DE1567323A1

DE1567323A1 - Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose

Info

Publication number: DE1567323A1
Application number: DE19661567323
Authority: DE
Inventors: Yoshiyuki Takasaki; Osamu Tanabe
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1965-05-11
Filing date: 1966-03-16
Publication date: 1970-05-27
Also published as: GB1103394A; DE1567323B2; DE1792748A1; SE336992B; DE1792748B2; BE678033A; CH473221A

Description

DK. MOLLEl-IORi DlfL-ING. GIALFS ■

fHYS. Dl. MANITZ Din..CNIM. Dt. DlUFEL »567323

PATENTANWÄLTE

P 15 67 323.1 Lo/th - A 924

München, 20. 11. 1969

AGENCY OF IFDUSiCHIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY 1, 3-choEie, Kasumigaseki, Chiyoda-ku, Tokio,

Japan

Verfahren zur Umwandlung von'Glucose in Fructose

Priorität: Japan vom 11. Mai 1965

Nr. 27525/65

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose, indem Glucose mit einem Glucose isomerisierenden Enzym reagieren gelassen wird, welches aus einem Mikroorganismus stammt, der Xylan unter Bildung eines Glucose isomerisierenden Enzyms zu assimilieren vermag. Das Enzym wird hergestelltj indem der Ausgangs-Mikroorganismuß in einem Medium kultiviert wird, welches aus Xylan oder xylanhaltigen pflanzlichen Materialien besteht.

An Umwandlungsverfahren von Glucose· in Fructose sind bisher alkalische und enzymatische Verfahren in der Technik bekannt, Beide Verfahren sind Jedoch in der Praxis nur mit Schwierigkeiten durchführbar. Bei dem zweitgenannten Verfahren ist es, um'geeignete Mengen an isomerisierendem Enzym aus den

Neu· Ünttriqpn

ι StMfNSCMWfIOt am lomwtu % m. (antj tuv · MONCHtN Ώ. lomr-KOCN-tnAMi i, m. pn ti a ti W

TEUX «1MB MIPAT

Mikroorganismen au erhalten, notwendig, daß die Mikroorganismen in einem Medium wachsen, welches als Kohlenstoff quelle D-Xylose, ein relativ teueres Material, enthalten.

Bestimmte Mikroorganismen vom Stamm Streptomyces, bei spiel sweiee Streptoaycoß echinatus, können in eines Medium gedichtet werden, welches pflanzliche Materialien mit verfügbarem Xylan enthält , beispielsweise Stroh, Weizen, Kleie, Maiskolben, Maishüleen, Eeiskleie und Pulp-At» fäll en etc., wobei Glucose ieomerioierende Easyme gebildet werden. Ss ist wirtschaftlicher, ein xylanhaltiges Medium zur Kultivierung der Streptomyces Mikroorganismen zu verwenden, welche· Glucose isomerisierende Enzyme bildet, anstatt ein Medium au verwenden, welche· als Kohlenetoffguelle D-XyIose enthält.

Die Zeichnung zeigt zwei Diagramme, in welchen der Prosentgehalt der Konversion von Glucose su Fructose gemäß dem Verfahren des Beispiels 9 eisaal gegenüber der Temperatur und das andere Mal gegenüber dem pH-Wert aufgetragen iet.

Xylan besteht hauptsächlich aus Xyloeeeinheiten. Xylan ist ein Hauptbestandteil der Hemicellulose, die in eigentlich allen Laodpflansen vorhanden ist· D-Xyloee wird kommerziell durch saure Hydrolyse von Xylan hergestellt· Bisherig· Arbeitsweisen but Isomerisation von Glucose, welch· ttisyme sar Umwandlung von Glucose in Fructose benutsten, gingen von Enzymen aus Mikroorganismen aus, die in einem xylo sehalt igen Medium gesuchtet wurden*

Gemäß der Erfindung wurde nun gefunden, daß einige Arten von Mikroorganismen, die eich dadurch auszeichnen, dafi sie Xylan assimilieren können, ebenfalls Glucose ieomerislereades Boiym bilden. Die Mikroorganismen mit der Fähigkeit sur Assimilation von Xylan unter Bildung eines Gluoose isomerisierendem &utym*s

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gemäß der Erfindung zeichnen sich dadurch aus, daß sich diene Mikroorganismen von anderen unterscheiden, die ebenfalYa. ein Glucose ieomerieierendee Enzym bilden können, dies jedoch nicht zustande bringen, wenn die Hauptkohlenstoffquelle im Züchtungamedium Xylan let. Glucose Isomerisierendes Enzym kann aus den Mikroorganismen gemäß der Erfindung hergestellt werden, indem diese in einem beispielsweise D-Xylose enthaltenden Medium kultiviert, werden, aus wirtschaftlichen Gründen wird jedoch vorgezogen, daß die Mikroorganismen in einem Xylan pder xylanhaltigen pflanzlichen Materialien enthaltendem Medium kultiviert werden.

Die Glucose icomerisier enden Enzyme werden durch Kultivierung der Streptomyces Mikroorganismen, wie derjenigen in den Beispielen aufgeführten, in einer wässrigen Lösung hergestellt· Am Ende der Kultivierung wird das als Enzymquelle verwendbare, zellenhaltige Material von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt. Die Glucose wird in Fructose umgewandelt, indem eine Glucoselösung sit dem Enzym geimpft wird. Das Enzym weist bei der Anwendung in kommerziellen Prozessen überlegenere Eigenschaften auf, da es über einen weiten pH-Bereich, Temperaturbereich und Glueοwkon» en tration aktiv let. falle gewünscht, kann da« Terfahren so durchgeführt werden, daß bis etwa 50 % der anfänglich vorhandenen Glucose in Fructose umgewandelt werden» Hierbei wird ein Sirup erseugt, der praktisch die gleichen Süaeigkelta-gigengehaften vie Invert-Sirup besitzt·

Die Isomerisation kann in einen pH-Bereich zwischen etwa 5»5 und etwa β durchgeführt werden, vorzugsweise swlschen etwa 6,8 und etwa 7 t2, wobei ein Wert von 7 besonders bevorzugt let. Die Reakt ions tempera tür kann zwischen 4-5° C und 80° 0

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BAD ORIGINAL

liegen, wobei der Bereich zwischen ungefähr 60° J und 70° C bevorzugt ist. Diese Bereiche werden in den Beispielen beschrieben.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie zu beschränken:

Beispiel 1

.Sin vorsteriliaiertes Medium von 4GO ml, das 3 % Weizenkleie (mit einem iXylangebalt von 21 %), 4 % Reismaischwasser, 0,1 % MgSO₄.'/H₂O und 0,3 % NaCl enthielt, wurde mit Streptomyces albus. Stamm YT-No. 44 geimpft und unter Schütteln 20 bis 30 Stunden bei einer Temperatur von 30° C kultiviert. Aus diesem Ansatz erhaltene Saat wurde in 10 Liter Medium vorstehender Zusammensetzung transplantiert und weiter unter Belüftung mit einem Schuttelferaentiergerät kultiviert (Belüftungswert 7,5 Idter/Min_} 200 Ü/Min; 30° C). Die Aktivität des Glucose isomerisierenden Enxjas in den Zellen erreicht innerhalb 20 bie 25 Stunden ihr MaxLaua. Die Aktivität des Glucose ieoaerieierenden Emjub wurde alt folgender fieaktioneaischung beetiaat:

0,2 m Fhoephatpuffer-LSeung (pH 7,5) · 0,5 al

1 m Glucose-Lb'sung . . 0,2 nl

0,1 m MgSO^.7H₂O-Losung 0,1 ml

Enzym-Lösung 0,2-0,3 ml

Der vorstehende Ansatz wurde auf ein Gesamtvolumen voa 2 ml mit Wasser aufgefüllt und bei 70° G 1h inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 2 ml 0,5 m Perchlorsäure gestoppt. Der Fructosegehalt wurde nach der Cystein-Carbazol-Methode bestimmt. Die Menge Enzym, die aus Glucose 1 mg

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Fructose pro Stunde bei 70° C und den obigen Versuchsbedingrungen ei"zeugt, wird als eine Enzymeinheit definiert.

Aus 50 ial der obigen Kulturlösung wird die Zellmasse durch. Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen, in Wasser suspendiert und 15· Kin. mit 10 kHz beschallt. Nach der Schallbehandlung werden 30 ml der überstehenden Lösung gewonnen und als Enzymquelle verwendet. Die Enzymaktivität betrug 623 Einheiten.

Zu dieser Enzymlösung wurden dann 50 g G3jicoee, 5 ml 0,1 m MgSO^.7H^O, 25 ml 0,2 m Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,5) und Wasser gegeben. Das Gesamtvolumen wurde mit Wasser auf 100 »1 eingestellt. Die llischung wurde bei 65° C 50 h inkubiert, während der pH-Wert während der Reaktion zwischen 6,8 - 7»2 gehalten wurde. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Flüssigkeit mit einem Ipnenaustauscher-Harz zur Entfernung von anorganischem Salz und Protein behandelt und dann im Vakuum eingedampft.

Es wurde ein süßer Sirup, bestehend aus 54· % Glucose und 46 % Fructose erhalten. Aus dieser Mischung wurde nach herkömmlichen Verfahren durch Zugabe von Kalkmilch Komplexe aus Fructose und Calcium abgetrennt· Die erhaltene Fructose wurde weiter entfärbt und nach Konzentrierung durch Vermin derung des Druckes zur Entfernung von Lösungsmittels, kristallisiert. Eo wurden 11 g Fructose erhalten.

Dee Produkt wurde papierchromatographisch auf Fructose untersucht, wobei Phenol : Wasser (4:1) oder Pyridin : Butanol t Wasser (4:6:3) als Lösungsmittel verwendet wurden. Ein Besorcin-Beagens, welches eine rote, für Ketose spezifische Färbung erzeugt, wurde als Mittel «ir Identifikation verwendet.

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Hierdurch wurde festgestellt, daß der Hf-Wert genau de» Hf-Wert von tergleichsfructose* entspricht. Die Drehung einer Lösung des Produktes war ebenfalls genau gleich dem Verb einer Standardfructoselb*sung.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde reines Xylan als Kohlenstoffquelle des Mediums verwendet, sowie Strptomyces flavovirens ATCC Nr. 5520, Streptomyces achromogenus ATCC Hr. 12 767, ßtreptomyces echinatus (NIHJ 180) und Streptomyces albus (YT-Hr. 4) verwendet.

Diese Mikroorganismen wurden in ein Medium von 50 ml bei 30° C kultiviert, welches 1 % Polypepton, 0,3 % K₂ ¹¹¹^' °*¹ * MgSO^.7H₂O und 0,5 % Xylan enthielt. Nach der Impfung wurde das Medium geschüttelt. Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und die gesammelten Zellen nach dem Vaschen mit Wasser in Wasser suspendiert \\rv\ 150 Min. mit 10 kHz beschallt. Nach dieser Schal !behandlung wurde 20 ml -überstehende flüssigkeit gewonnen und als Ikusj»- lösung verwendet. Die Aktivitäten der erhaltenen Eneymlösungen sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

Tabelle 1 Anfangs- Etat- Eb«y»ekti- Protein lultivier-

Kulturen Xylan Xylan vitat der seit (h)

(g/50ml (g/50*l (Einhei- Zelle

Medium) Medium) ten) (ag)

flavovirens

ATCC Nr.3520 0,25 0,20 10,0 66,4 14

achromogenus

ATCC Hr.12767 0,25 0,16 41,2 76,8 10

echinatus

NiHJ 180 0,25 0,19 32,8 82,3 22

'(YT Hr. 4) 0,25 σ,07 12#,8 86,4 3*

"fir -

—_t . --

T ' ■ Die in Tabelle 1 gezeigte Eazymaktivitat gibt die Früctoeemenge wieder, die erzeugt wurde, wenn 80 al der 0,1 m Gluco selb* sung mit 20 ml Ehaymlösung 1 h bei 70° C reagieren gelassen'werden. Obwohl Unterschiede in der Enzymaktivität bestehen, ergab Jeder xylanassimilierende Stamm Glucose iBomerißierendee Enzym.

Beispiel %

ΓίβεβΒ Beispiel gibt die Ergebnisse der Durchführung dor Ißomerisationsreaktion bei verschiedenen pH~Werten unter Verwendung einer in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellten Enzymlösnng wieder.

Die Reaktioruslösungen enthielten 18 g Glucose, 25 ml 0,1 m Fhosphatpuffer-Lösung mit verschiedenen pH-Werten (25 ml einer 0,1 α Glysin-NaOH-Pufferlöeung wurden nur bei einem pH-Wert von 9 angewandt), 5 ml 0,1 m KgBO^-TH₂O und 260 Ein- " heiten einer Enaymlösung. Nachdem der pH-Wert der Lösungen auf 5,Oj 5,5i 6,0} 6,5; ?,0;8,Q; bzw. 9,0 eingestellt worden war, wurde das Geearntvolumen jeder Lösung auf 100 nl mit Waeser aufeefüllt und die Lösungen 50 h bei 65⁰C gehalten. Der FruotoBegehalt der Lösungen wurde nach 20 und 50 h analysiert. Die pH-Werte der Lösungen wurden konstant gehalten, indem sie alle 6 h mit VaOH nachgestellt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Venn der pH-Wert der Reaktion alkalisch ist, tritt eine Isomerisation auf, die nicht auf der Emsymreaktion beruht. Tabelle III gibt die Werte wieder, die erhalten werden, wenn die durch nichtenzymatische Reaktion gebildete Fructose abgezogen wird·

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BAD ORtGINAL

3
iüabelle II

Heaktione-	5,	O	5,5	6	,0	Reaktion	5	7	(pH)	8,0	9	»0
₇ flit	-		—	3			1g	6		7i1g	7	,5g
(Btd.)	1,	9k		5		6,	5g	10	,0	9,3g	8	,9g
20					5,		,.88
50					7,	,06

Die oben genannten Werte zeigen die aus Glucoee gebildeten Fructoeemengen.

Tabello_III

Reaktione- Reaktion (pH)

zeit

(Std.) 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 8,0 9,0

50 1,9g 2,7g 5,4« 6,8g 9,O₆ 3,9g 2,1g

Die oben genannten Werte Beigen die aus Glucose gebildeten Fructoseaengen·

Beispiel 4

Dieses Beispiel gibt den Einfluß der Temperatur auf die Reaktion bei einem pH-Wert ran 6,8 - 7,2 wieder. Die Easymlösung wurde nach der in Beispiel 1 beecnriebenen Weise hergestellt.

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BAD

Die ReaktionslöEiinGon enthielten 10,0 g Glucose, 25 ml 0,2 m Phosphatpufferlösung, 5 ml 0,1 m KgßO^«7HgO und 433 Einheiten an Enzymlösung. Das Volumen der Lösungen wurde mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Die Reaktion wurde bei Temperatu- ren von 40° C, 45° C, 50° C, 60° C, 65° 0, 70° C und 80° 0 durchgeführt. Die pH-Werte der Losungen wurden im Bereich von 6,8 - 7j2 gehalten, indem eie alle 12 h mit NaOH nachgestellt wurden. Der Fructosegehalt der Lösungen wurde in Abständen von 20 und 40 h bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt.

Sie Ergebnisse zeigen, daß das vorliegende Eneym in dor Lage ist ι bei unerwartet hohen Temperaturen su reagieren, was bedeutet, daß das vorliegende Enzym eine überlegenere Hitzebeständigkeit aufweist. Der bevorzugte Temperaturbereich der En«jMreaktion liegt jedoch, cwisehen 45°· C und 60° C. Reaktion bei einer Temperatur oberhalb 80° C kann die Bildung einer Verfärbung in Sirup infolge Warmesereetsung dee · Zuckere bewirken·

Tabelle I?

Reaktionszeit (Std.)

40

Heaktiocflteaiperatur ( C)

50 60 65

70

20 44

2,2g 2,8g 4,0g 6,0g 8,5g 8,6g 8,9g 4,6g 5,5g 7,0g 8,3ß 8,9a S,9g 8,

Die oben genannten Werte zeigen die au« Glucose gebildeten Tructoaeaengen.

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BAD

Beispiel 5

Es wurden Versuche durchgeführt, um den Einfluß auf die Reaktion unter Abänderung der Glucosekonzentratibn au bestimmen. Der pH-Wert der Reaktion wurde wischen 6,8 7,2 und die Temperatur auf 65° C eingestellt. Die untersuchten Glucocelösungen besaßen Konzentrationen von 18 #, 36 %, 50 96, 60 % und ?0 % Glucose. Die Zusamneneeteung der Reaktionelösungen geht aus Tabelle V hervor. Die Enzymlösung wurde entsprechend der Arbeitsweise des Öeiepiels zubereitet. Die Ergebnisse oind in der Tabelle VI wiedergegeben.

Aue den in Tabelle VI wiedergegebenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß in die vorliegende Ieoiieri ei erungs reaktion zur Her stellung von Fructose auch vor sich geht, wenn die Glucosekonzentration in der Lösung hoch ist.

	Tabelle V	% 36 %	50 %	60 %	70 %
Konzentration von Glucose	18	36 20 1 307	50 20 5 1	60 20 5 1	70 20 5 1
Glucose (g) 0,2 m PhOBOhatpuffer- Löeung (ml) 0,1 m MgSO^.THgö (ml) 0,1 m GoCl₂.6H₂O (al) Enx^m-Lösung (Einhei ten;	18 20 5 1	100	100	100	100
Reaktionsvoluiaen (ml)	100

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8ÄD ORIQlNAL

1^7323

	18 %	Tabelle VI	.50 %	60 %	7OSIt
Beaktioneseit	ε,5ε		15,ög	17,8g	17,15
h	9,5s		24,Og	25,6g-	29,6g
20	9,6g		25,5g	20,2g	32,Og
46	9,6g	Gluco selcocjsentration	26,Og	31,2g
70	36 #
92	13,2g
	18,2c
	19,Og
19,5g

Konvereioneverhältnis nach 92- 53,35έ stündigex Reaktion

54,2% 52,0% 52,0% 49,9%

·) Prozentverhältniß von erhaltener Fructose zu cnfangß vorhandener Glucoee.

Sie Werte eeigen die aus Glucose gebildeten Pructosemengen.

Beigpjel 6

Ein Saatmedlua (50 vü.) aue 1 % lyloee, 1 % PolsFpepton,

0,3 % K₂HPO₄, 0,1 % MgSO^.THgO wurde in einen Kolben gegeben

₂₄ ^g

und eterilieiert..Bann wurde Streptomycea albuß <TT-No. 4) in dae Medium eingeimpft und 3 d bei JO⁰ C kultiviert. Dieee Kultur wurde dann ala 8aat für den folgenden Versuch verwendet.

Das Medium eut Heretellung des Enzyms enthielt 5 % Reiakleie, 3 % Maiemaischwasser, 0,1 % MgSO^.TH₂O und wurde auf einen

^₂ pH-Wert von 7,0 eingestellt. 100 ml hiervon wurden in einen

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50 ml Kolben gegeben und Bterilisiert. Dann wurden sie mit 4 al der vorgenannten Saat geimpft und unter Schütteln JO h bei 30° C kultiviert. Aue 50 ml dießer Kultur hergestellte Enzymlösung "besaß eine Enzymaktivität von 700 Einheiten. Sie kultivierten Zellen wurden dann durch Zentrifugieren gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden dann in Wasser suspendiert und durch 15~3iiiiütige Beschallung mit 10 kHz zerstört. Die zerstörten Zellen wurden zentrifugiert und die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde als Enzymquelle verwendet. Diese EnzymlÖBung wurde mit 200 g Glucose der gleichen Weise wie im vorangegangenen Beispiel umgesetzt. 49,5 % der als Substrat für das Enzym verwendeten Glucose (200 g) wurden zu Fructose umgewandelt. Nach Entfernung des Proteins und Reinigung unter Verwendung von Aktivkohle und IonenaustauBcherharz wurde die oben genannte Beaktionslösung auf einen Wassergehalt von 25 % konzentriert. Die Ausbeute betrug 195 gi gemessen als wasserfreie Substanz.

Beispiel 7

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von Haiehülsen und Halskolben ale IyIanquellen.

Das Medium (50 ml, pH 7»5)» welches 4 % Maismaiechwaseer, 0,1 % Mg80₄.7H₂0, 0,025 % CoCl₂.6H₂O und 3 % Maiahülsen oder 3 % Maiskolben enthielt, die auf eine Siebgröße Kr. zerkleinert wurden, wurden in einen 200 ml Solben gegeben und sterilisiert. Denn wurde das Medium mit ßtreptomyeee albuB ATCC 21132 (YT-Ho. 5) geiapft und 48 h unter Schütteln bei 30° C kultiviert. Die Aktivität der Glucose ieomerieierenden Eazj*e ist wie in Tabelle VII angegeben.

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PAD ORIGINAL

156752?

?abelle_VII

Xylan-Quelle Enzymaktirität (Einheiten)

Blindprobe 24,5

Maishülsen ■ '* 481,0 Maiskolben 520,5

Die Glucose isomerisierenden Enzyme werden bei Verwendung von MaiahÜleen und Maiskolben als Xylanquelle erzeugt.

Die Enzymlösung, welche 481 Einheiten Enzymaktivität aufweist und die in dem Verfahren unter Verwendung von Maiehülsen als Xylanquelle erhalten -wurde, wurde zu 100 g Glucose (wasserfrei), 50 ml 0,2 η FhospbatpuXfer-Lösung (pH 7,5) und 10 ml 0,1 α MgSO^.7H₂O gegeben« Das Gesamtvolumen wurde sit Wasser auf 200 ml aufgefüllt· Die Mischung wurde bei 70° C geimpft. Während der Reaktion wurde der pH-Wert zwischen 6,8 und 7,2 mit KaOH gehalten· Nach der Reaktion wurde Protein aue der Eeaktionslösung entfernt und die Ι»8 sung" un" tor Verwendung' von Aktivkohle und lonenaustauscherharz gereinigt. Die lösung wurde dann bis auf ein en Wassergehalt von 25 % konzentriert. Die nach dem obigen Verfahren erhaltene Ausbeute betrug 98,0 g waseerfreie ßubstani,

Beispiel Q

In diesem Beispiel wurde die aus der ersten Kristallisation von Dextrose aus Sträkehydrolisat erhaltene Mutterlauge (Hydrol) als Bizymsubstrat verwendet.

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Ein Medium, das 3 % Weisenkleie, 4 % Htismaischwaeser,

0,1 % MgSO^.7H₂O und 0,025 % CoCl₂.6H₃O enthielt, wurde mit NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Hiervon wurden 100 ml in einen 500 ml Kolben gegeben und sterilisiert. Dann wurden 4 ml Mediumlösung (ßtreptomyces albus ATCC 21132 (IT-Nr. 5)_? die in deai Beispiel 6 beschriebenen Saatniediuai kultiviert mir&en, in das Medium eingeimpft und bei 30° C unter Schutt el α 48 h kultiviert. Die aus 50 ml der Brühe hergestellte Enzymlö'sung besaß eine Aktivität von 760 Einheiten. Durch Zentrifugieren wurden kultivierte Zellen aus 50 ml Brühe gesammelt. Die Zellen aus diesem Arbeiteschritt wurden gewaschen und als Enzymquelle verwendet.

Als Substrat zur Isomerisation wurde Mutterlauge mit einem D.E.-Wert von 87 verwendet.

Menge an als Glucose berechne- D.E. « Dextroseeinlieit _x Menge an Feststoff

Enzym, 0,025 n Mg(OH)^ und 0,001 m CoClg.SHgO wurden zu 100 g Kutterlauge gegeben und auf ein Gesamtvolumen von 200 al mit Wasser aufgefüllt. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. Es wurde dann bei 70° C inkubiert. Während -der Reaktion wurde der pH-Wert in Bereich »wischen 6,6 und 7,2 gehalten.

Fach 50 h waren 4-5 % der Glucose zu Fructose konvertiert, !fach Entfernung der Zellen aus der Reaktionslösung wurde die Reaktionslöaung unter Verwendung von Aktivkohle und Ionenaustauecherharz gereinigt und dann konzentriert, bis der Wassergehalt 25 % erreichte. Die Zusammensetzung des Produktes betrug 26 % Fructose; 31,8 % Glucose; 17*2 % Oligosaccharide und 25 % Wasser.

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BAD ORIGINAL Beispiel 9 /

Sin Baatmedium, welches 1 % IyIoae_f 1 % £olyp<§pton, 0,3 % Ϊ2^^?04 UBd Ό_vi % HgSQ^.TH^O enthielt, wurde la einen Kolben gegeben unfl «^trpipierj^ Bqpia, vo?A#_:4gs .Hediiat «it φβ·* *lbue (Τϊ*3ο. ^) g«iapit und 46 ΐ bei JO⁴ O um eine I^pflöeusg hersuetellen« Ua die Etllamprodukiian m ateigern, murd· eine X»pflösusg aus der Soatetuf9 mir Iapfuag von 50 1 MeditiB su impfen usä dieses wurde kultiviert« letzteres wurde verwendet, um 5CX) 1 Medium su impfen und diese wurden kultiviert und schließlich. Mirden diese rur Impfung von 5000 X Medium verwendet und dies© kultiviert. Die Zusammensetzung der bei dieser Behandlung verwendeten Medien {unter Ausaehluß des Saatmediuma) betrug 3 % Weizenkleie, 4 % Haismaischwasser» 0,1 % MgSO₄.7HgO und 0,025 % CoCIg.6E^O und Wasser. Hach der· Sterilisation dieses Mediums wurde der JLnfangs-pH~Vert auf 6,5 mit ITaOH eingestellt, die Kultivierung wurde bei 30° C bei einer Belüftung in einer Menge von einem Drittel des Volumen* der Brühe pro Minute und 200 U/pm Bulirgeecn%indiekeit durchgeführt. Fach 24 h erreichte die ikusymaktivität ein MaxLatum. Die mue 50 ml Brühe hergestellte 2n*;y*löeung besaß eine Aktivität von 750 Einhei ten. .' ■-■-'■; ■ ■ . ■"'■■ ' - : - '■ .-■■■'■

Nach Abechluß der Reaktion wurde die Weizenkleie in der Brühe unter Verwendung eines SiebeB entfernt· Die Zellen wurden unter Verwendung einer FiIterpresse gesammelt, wobei 1000 kg Zellen gewonnen wurden« Die gewonnenen. Zellen wurden dann in Wasser suspendiert. Die schlammigen Zellen wurden mittels einem Bochdruckhomogenisierer zerstört. Die zerstörten.Zellen wurden als I&zymquelle verwendet. , . _; .

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BAD ©

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Als Substrat zur Isomerisierung wurde ein. konvertierter Stärkesirup von D.E. - 92,5 in einer Konzentration von 50 % (bestehend aus 87 % Glucose und 13 # Disaccharid enthaltendem Oligosaccharide verwendet. 15 000 kg (berech-» net ale Feststoff) des obigen konvertierten Stärkesirupβ wurden in einem Isomerisierungstank von 30 nr Kapazität gegeben. 0,0025 m Hg(OH)₂ wurden zugegeben und nachdem der Sirup auf 65° C erhitzt worden war, wurde die Enzymquelle zugefügt. Per pH-Wert wurde in der Nähe von 7,0 mittels KaOH gehalten. I"n der Zeichnung ißt das Konveroionsverhältnis, der Temperatureinfluß und der pH-Einfluß während des iBomerieierungBVorganges wiedergegeben.

Bach 90 h erreichte das Konversionsverhältnis ungefähr 45 %. Die Reaktionslösung wurde dann unter Verwendung von Aktivkohle und Ionenauetauscherharz wie bei dem konventionellen Reinigungeprozeß gereinigt. Die Lösung wurde auf einem Wassergehalt von 25 % konzentriert. Die Ausbeute an hergeeteilte» Produkt betrug 19 600 kg. Eine Analyse dieses Produktes ergab 29,6 % Fructose, 36 % Glucose, 9*4- % Dieaccharid enthal tendes Oligoeaccharid und 25 $ Vaeeer.

Beispiel 10

Unter Anwendung der Arbeitsweise von Beispiel 9 wurden Baatkultivierung, Zwischenkultivierung und Hauptkultivierung aufeinanderfolgend durchgeführt.

Die Mediumzuflammeneetzung enthielt 3 % Weizenkleie, 4 % Haismaiechwaseer, 0,1 % MgSO^.THgO und 0,025 % CoCl₂.6H₂O. Nach dem das Medium sterilisiert worden war, wurde der Anfangß-pH-Wert des Mediums mit NaOH auf 6,5 eingestellt und die Kultivierung bei 30° C, einer Belüftung mit einem Drittel des Volumens der Brühe pro Minute und einem Rühren

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BAD Oi|$#iAli = i

bei 200 TJ/min durchgeführt. Nach 24 h erreicht die Zellaktivität ein Maximum· Die Zellen wurden mittels einer Filterpresse gesammelt, wobei 900 kg Zellen erhalten wurden. Die gesammelten Zellen wurden als Enzymquelle verwendet.

Als Substrat? zur I someri al erdung vnirde· ein Stärkesirup in 50 f^-iger Konzentration mit einem D.E.-Wert von 97 »0 (bestehend aus 95 # Glucose und 5 % Disaecharid enthaltendes Oligosaccharid) verwendet. 15 000 kg (berechnet air. Eeststoffgehalt) des oben .genannten, konvertierten Stärkesirups wurde in einem Isoiüerisierungsbehälter von 30 mr Fassungsvermögen gegeben. 0,0025 m-MgSOy,.-7HoQ vmrden zugefügt,.' der Sirup auf 65° C erhitzt und die Ehaymquelle zugesetzt. Der pH-Wert wurde auf ungefähr 7»O mit 2TaCH gehalten.

Nach 100 h betrug das Konvertierungsverhältnis etwa 47 %. Die HeaktionslöBung wurde dann mit Aktivkohle und Ionenaustauscherharti wie bei konventionellen Eeinigungfiprozeseen gereinigt. Das Ifachkonzentrieren auf ein Wassergehalt von 25 % erhaltene Produkt wog 19 500 kg. Analyse dieses Produktes ergab: 33*4 $ Fructose, 37,7 Glucose, 3>9 Vdisaccharid enthaltendes Oligoeaccharid und 25 % Waeeer·

Das enzymatisch^ Verfahren der Erfindung stellt einen neuen und wirtschaftlichen Weg zur Konvertierung von Glucose in Fructose dar und das Endprodukt ist ein Fructose enthaltender _, Sirup, welcher eine Invertzucker äquivalente besitzt.

Patentansprüche: - 17 -

BAD

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Konvertierung von Glucose in Fructose, dadurch gekennzeichnet» daß ein Glucose isomerisierend.es Enzym, dae aus einem Mikroorganismus stammt, der Xylan assimilieren kann, zur Herstellung von Glucose isomerisierendem Enzym einer glucosehaltig gen Lösung zugesetzt wird und diese glucosehaltige Lösung mit den zugesetztem Enzym bei einer Temperatur zwischen etwa 45° C und etwa 80° C und bei einem pH-Wert zwischen etwa 5*0 und 8,0 gehalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorgani smue ein Streptomyces-Stamm verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch. 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in einem XyIan-haltigen Medium oder in ein«*m Xylan-haltiges Material enthaltendem Medium kultiviert rird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutterlauge (Hydrol) als glucosehaltige Lösung verwendet wird.

5. Verfahren zur Herstellung von Glucose isomerisierendem Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mi ;roOrganismus der Xylan unter Erzeugung des Glucose isomerisierenden Enzymes zu assimilieren vermag in einem Xylan enthaltenden Medium oder in einem xylanhaltiges Material enthalt enden Medium kultiviert wird.

- 18 -009*22/045*

BAD ORIGINAL

6. Verf aliren nach Anspruch 5, dadurch gekennz'eichn e t, daß als Hikroorganisiaus ein Streptomyces-Stamm verwendet wird.

009822/0456

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L- e e r s e Ί t e