DE2627111A1

DE2627111A1 - Verfahren zur umsetzung von aldose oder aldosederivaten zu ketose oder ketosederivaten

Info

Publication number: DE2627111A1
Application number: DE19762627111
Authority: DE
Inventors: Sidney Alan Barker; Peter John Somers; Geoffrey Harry Stafford; Robin Ross Woodbury
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1975-06-17
Filing date: 1976-06-16
Publication date: 1976-12-30
Also published as: LU75174A1; US4069104A; PT65240A; FI56537B; JPS6125038B2; PL101098B1; JPS525706A; IE43011L; NL7606563A; CS226164B2; PT65240B; IE43011B1; DE2627111C2; NO142527C; NO762098L; ZA763610B; ES448945A1; CA1067437A; FI761757A; ATA447876A

Description

T.EDTKE - BüHLING - K₁NNE - GrUPE

Dipl.-Chom. Bühling Dipl.-lng. Kinne R 9 7 ¹ 1 1 Dip'-'ng. Grupe

8000 München2, Postfach202403

Bavariaring 4

Tel.: (0 89)53 96 53-56

Telex: 5 24845 tipat

cable. Germaniapatent München

16.Juni 1976

B 7442

ICl case E..27973

IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LIMITEL
London, Großbritannien

Verfahren zur Umsetzung von Aldose oder Aldost derivaten zu Ketose öder Ketosederivaten

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Umsetzung einer Aldose oder eines Aldosederivates zu Ketose oder Ketosederivaten in Gegenwart eires Oxyanion." unc! insbesondere d:'s Umsetzung von Glucose zu Fructose, Mannose zu Fructose, Glucose-6-phosphafc zu Fructose-6-phosphat, Maltose zu Maltulose, Galactose zu Tagatose und Lactose zu Lactulose bzw. analogen Reaktionen, wie die Umsetzung von Xylose zu Xyiulcse.

Das Verfahren kann in Gegenwart oder Abwesenheit eines die Umsetzung katalysierenden Enzyms durchgeführt werden.

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11/13

Dresdner Bank (München) Kto. 3939 844 Postscheck (München) Kto. 670-43-804

Wenn die Umsetzung von Glucose zu Fructose in Gegenwart eines Enzyms durchgeführt wird, wie Glucoseisomerase, stellt sich das Gleichgewicht häufig ein, wenn 50 bis 55 % der Glucose in dem Peaktionsmedium zu Fructose umgesetzt sind.

Es war bisher nicht möglich, durch eine nicht-enzymische Reaktion Glucose in Fructose ohne die Erzeugung von Nebenprodukten umzusetzen. Es gibt zahlreiche Veröffentlichungen, beispielsweise US-Patentschriften 2 487 121, 3 432 345, 3 558 355 und 3 514 327 eowie deutsche Patentschrift 1 163 307, die sich auf eine nichteiiZymische Umsetzung von Glucose zu Fructose beziehen und die alle Verfahren beschreiben, in denen die Erzeugung von Fructose begleitet ist durch eine alkalische Zersetzung und die Erzeugung von anderen Produkten, welche aus der rein chemischen und nicht-enzymischen Reaktion entstehen. Demzufolge basieren bisher alle groi3technischen V-arfahren zur Herstellung von Fructose auf Enzym-katalysierten Reaktionen.

Eei dem enzymischen Umsetzungsverfahren fällt die Geschwindigkeit der Reaktion, durch welche Fructose erzeugt wird, mit dem Anstieg des Anteils an Fructose in dem enzymischen Reaktionsmedium ab. Daher wird bei einem technischen Verfahren zur Umsetzung von Glucose zu Fructose die Fructoseausbeute durch Ausbalancieren eines Verlustes der Fructoseproduktion gegenüber dem Abfall der Reaktionsgeschwindigkeit, durch welche der Anteil an Fructose in dem Reaktionsmedium erhöht werden kann, optimiert. Ein technisch durchgeführtes Verfahren kann zur Herstellung eines Sirups, in welchem

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typischerweise 4O % Glucose zu Fructose umgesetzt werden, optimiert werden. In den meisten chemischen nicht-enzymischen Umsetzungen von Glucose zu Fructose fällt die Menge an vorhandener Fructose nach Erreichen eines Maximums ab.

Demgemäß ist es vorteilhaft, den Anteil an Glucose, welcher während der Reaktion wirtschaftlich zu Fructose umgesetzt werden kann, zu erhöhen.

Dies kann durch effektive Entfernung von Fructose aus dem Reaktionsmedium erreicht werden, indem man in das Medium ein Reagenz einverleibt, welches mit der Fructose einen stärkeren Komplex bildet als mit Glucose, wenn auch das komplexbildende Mittel zusätzliche Eigenschaften haben kann, durch welche die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht oder erniedrigt wird. Reagenzien, welche zu diesem Zweck vorgeschlagen wurden sind Boratverbindungen, nämlich in Y Takasaki, Agr Biol.Chem. 1971, 35 (9), 1371-5 und US-Patentschrift 3 689 362 (Enzymische Reaktion) sowie J.F. Medicino, J.Amer. Chem.Soc. 82,19 60, 4975 (chemische Reaktion).

Ferner wurden Ärenboronate in der britischen. Patentschrift 1 369 185 sowohl für chemische als auch für enzymische Reaktionen vorgeschlagen.

Nachteile dieser bekannten Verfahren sind im Falle von Boratverbindungen, daß diese toxisch sind und eine Gefahr für die Gesund- · heit in einem Produkt darstellen, das zur Verwendung als Süßungs-' mittel in Lebensmitteln für Konsum durch Menschen vorgesehen ist, und

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im Falle von Benzolboronaten, daß diese eine begrenzte Löslichkeit haben, keine Komplexe mit einem Verhältnis von 2:1 von Zucker:Boronat bilden und hohe Konzentrationen an Fructose in dem Produkt bei hohen Zuckerkonzentrationen nicht erhältlich sind (Carbohydrates Res. , 26 (1973), 41-53). Daher können diese komplexbildende Reaktionen praktisch nicht für technisch durchzuführende Umsetzungsverfahren angewendet werden .

Um ein technisches Verfahren zu entwickeln, in welchem der Anteil an Fructose im erzeugten Sirup gesteigert wird, ist es erforderlich, ein komplexbildendes Reagenz zu finden, welches die mit seiner Verwendung einhergehenden Nachteile nicht aufweist.

Gemäß der Erfindung wird nun ein Verfahren zur Umsetzung einer Aldose oder eines Aldosederivates zu einer Ketose oder einem Ketosederivat zur Verfügung gestellt, wobei die Umsetzung in Anwesenheit eines komplexbildenden Reagenzes stattfindet, das ein Oxyanion oder ein gemischtes, komplexes Oxyanion von Germanium oder Zinn ist, welches einen stärkeren Komplex mit der Ketose oder dem Ketosederivat bildet als mit der Aldose oder dem Aldosederivat.

Ferner wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Umsetzung einer Aldose oder eines Aldosederivates zu einer Ketose oder einem Eetosederivat zur Verfügung gestellt, bei dem die Umsetzung in Anwesenheit eines komplexbildenden Mittels stattfindet, welches ein Oxyanion oder ein gemischtes, komplexes Oxyanion von Germanium ist, welches einen stärkeren Komplex mit der Ketose oder dem Ketosederivat als mit der Aldose oder dem Aldosederivat bildet.

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— Γ> -

Sehr zweckmäßig ist das Aldosederjvat ein Aldosephosphat oder Glykosylderivat einer Aldose.

Während die Erfindimg auf einen weiten Bereich von Umsetzungen und insbesondere auf die hier spezifizierten Umsetzungen anwendbar ist, kann es äußerst nützlich auch auf die Umsetzung von Glucose zu Mannose und zu Fructose angewendet werden. Während der Umsetzung kann ein Enzymkatalysator vorhanden sein, wenn dadurch die Anwendung milderer Reaktionsbedingungen ermöglicht wird oder andere Vorteile erzielt werden, wie selektive Wirkung des angewendeten Enzyms auf nur ein Isomeres (D oder L) der Aldose oder des Aldosederivates. Wenn eine enzym-katalysierte Umsetzung durchgeführt wird, kann das Enzym in Lösung oder in irgendeiner inm'obilisierten Form auf einer festen Matrix vorliegen, welche eine lebende Zelle, eine inaktivierte Zelle oder irgendein anderer geeigneter Träger sein kann. Das Enzym kann ebenfalls in löslicher Form vorliegen. Das Enzym vom Isomerase-Typ, welches für die Umsetzungen des Typs (gemäß in Tabelle A aufgeführten Beispielen) geeignet ist, auf welchen die Erfindung anwendbar ist, kann aus einem oder mehreren Enzymen einer Reihe bestehen, welche in aufeinanderfolgenden Reaktionen zur Wirkung kommen.

6 0 9 ί ^u" S / 1 0 8 6

Tabelle A

Umsetzung

1 D-Galactose ^p^ D-Tagatose Enzym

L-^rabinose»Isomer
(D-Galactose ~

Isomerase)

Literatur

J Biol Chem, 1971, 246, 5102-6

2 LA rabinose :=i IrR ibulose wie in 1

wie in 1

3 L-Ricos e

L-Fuculose L-Fupose Isomerase
(D-Ärabinose -

Isomerase)

J Biol Chem, 1958, , 457

4 InFhamnose

L-Rhamulose L-Rhamnose- Isomerase

Methods Enzymol, 597-82, (1966)

5 L-Mannose

L-Fructose LM annoae-Isomerase

Carb Res, 1968, 3444

6 D-Mannose

ructose D-Ljncose- isomerase
(D-Mannose-i somerase)

J Biol Chem, 218 (1956) 535

7 D-Glucose

D-F ructose D-Qlucose-I'somerase
(I-^rloserlsomerase)

Biochem Biophys Acta, (1969) 178, 376-9

8 B-Gljrcero- :=£ D-Sesdohept-D-annoulose
heptose

•;ie in 6

J Biol Chem, 218, (1956) 535

9 D-k.ycose ==" D-Xylulose ■/ie in 6

in 6

0 D-Xyiose

D-X.ylulose wie in 7

?ie in 7

1 L-Xylose —^· L-Xylulose L-Xylose-Isomerase

Fed Proc, 19 (i960)

2 D-Ärabinose =± D-Pibulose ■/ie in. 3

wLe in . 3

3 D-Fibose-5-phosphat

D-I^^bulose 5- >hosphat J Biol Chem, 1957, 65

4 D-Arabinose
5-phosphat

D-Rj.bulose 5- hosphat D-/4rabinose 5-.somerase

Methods Enzymel, 585-8 (1966)

5 D-G^lyceralde
hyd -3-phosphat

'Dihydroxy aceton 3-phosphat Biochem J, 1968, 107, 775

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Tabelle A (Forts.)

Umsetzung	Enzym Literatur
l6 D-G.alactose— D-Tagotose — 6-phosphat 6-phosphat	Biochem Biophys Res Comm, I973, ^2f 64I-7
17 D-G.lu.cose ·" D-Enictose — 6-phosphat 6-phosphat	J Biol Cihem, 1975, 248, 2219
18 D-Mannose "" D-Fructose — 6-phosphat 6-phosphat·	J Biol Chem, I968, 245., 5410-19
19 D-Glucosamin *■ D-Fructose ; 6-phosphat 6-phosphat	Adv Enzymol, _/£, 49I, (1975)

In der vorliegenden Beschreibung wird unter dem Ausdruck Ketose eine Ketulose verstanden (siehe die Diskussion der Nomenklatur von Ketosen in "The Editorial Report on Nomenclature", Journal of the Chemical Society, 5110, (1952).

Das komplexbildende Reagenz kann in das Umsetzungsverfahren in irgendeiner geeigneten Weise eingeführt werden, z.B. als Aldose-Oxyanion-Komplex oder als Derivat eines Aldose-Oxyanion-Komplexes oder als Salz oder als Verbindung, wie Oxid, welches Oxyanionen oder gemischte komplexe Oxyanionen unter den Bedingungen des Umsetzungsverfahrens bilden. Das komplexbildende Reagenz kann ebenfalls als Oxyanion eingeführt werden, welches zuvor auf einem Polyol - oder einem Ionenaustauschharz-oder einem anderen unlöslichen Träger, wie Chelaten mit dem komplexbildenden Reagenz festgehalten wurde oder welches das komplexbildende Reagenz als Gegenion aufweist.

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Geeigneterweise ist das gemische komplexe Oxyanion ein solches, welches durch Einwirkung eines Oxyanions von Germanium oder Zinn auf ein Ion eines anderen Elementes der Gruppe IV oder eines Elementes der Gruppen V oder VI gebildet wurde. Vorzugsweise enthält das Oxyanion oder das gemischte komplexe Oxysnion Germanium. Besonders geeignete komplexbildende Reagenzien sind Germanat-oder Polygermanat-Ionen, welche in das Verfahren beispielsweise als Natriumgermanat oder Germaniumdioxyd eingeführt werden und in Lösung als immobilisierte Chelate oder als Gegenionen von Ionenaustauscher-

ti 2 — Ge 0„ (SO.)yj

Γ HGe Ο» (PO^)J - oder Lactat-Germanium-Arten können in einigen Fällen vorteilhaft angewendet werden.

Aus Lindberg und Swan, Acta Chem. Scand, 14, (1960),1043-50, ist es bekannt, daß Fruktosegermanat-Komplexe sehr unterschiedlich von Glucose-Germanat-Komplexen sind, wenn sie durch Elektrophorese bei pH 10,7 separiert wurden, wobei ersteres mehr als die zweifache Mobilität gegenüber dem letzteren bei 40 C besitzt. V.A. Nazarenko und G.V. Flyantikova (Zh Neogan Khim, 8 (1963), 2271, 1370) zeigt Ionisierungskonstanten f\ir Glucose und Fructose mit Germanat von

-6 -4

8,3 χ 10 bzw. 1,04-χ 10 . Ferner sind dort Instabilitätskon-

_2 istfirit f>n für GIuCf)HO und Fructose mit Germanat von 3,54 χ 10 bzw. 4,24 χ 10 genannt.

Aus folgenden Gründen ist es überraschend, daß Germanationen brauchbar als Reagenzien bei der Umsetzung von Glucose zu Fructose sind:

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1. Es wurde cjezeigt, daß Germanat sich im Gleichgewicht: Honogerinanat Pcntagermanat j;==^ Heptagermanat befindet, welches durch Erhöhung der Germaniumkonzentration nach rechts und durch Er! llung des pH über pH 9 nach links Verschobenwerden kann (D.A.Lverest J.C.Harrison, J.Chem. Soc.1959, 2178-2182). Für ein wirtschaftliches Verfahren ist es bevorzugt, daß für die maximale Unisetzungsgeschwindigkeit das kleinste Gewicht von Germanat-Arten vbrliegt und daß die Herstellung von alkalischen Zersetzungs-Nebenprodukten vermieden wird.

2. Germaniumdioxid und Natriumgermanat haben eine sehr begrenzte Löslichkeit in Wasser - siehe P.J. Antikainen (Suomen KenUsLilohti, 33B (1960), 38,40). Gulzian und Muller, J.Amer Chem. Soc, 1932, 5_4_, 3142 führen 31 bis 33 mM für GeO„ in Wasser auf. D.A. E'verest und J.C. Harrison, J-Chem. Soc.1959, 2 178, nennen 870 mM für Natriumgermanat.

3. Magnesiumionen sind im allgemeinen in bei enzymischen Umsetzungen von Glucose zu Fructose verwendeten Medien vorhanden. Magnesiumorthogermanat (Mg„GeO,) ist äußerst unlöslich im Wasser und wird bei der analytischen Bestimmung von Germanium verwendet - siehe J.H. Müller, J. Amer Chem. Soc. 1923, ρ 2493-2498. Unter den vorstehend zitierten Bedingungen schied es nicht aus Lösung aus.

4. Glucoseisomerare hatte eine sterische Grundvoraussetzung

B ü 8 ,- '.-■' 1 0 8 6

- ίο - 2627ΊΊ 1

für -D-Glucose (K.J. Schray und I.A. Rpse, Biochemistry 10 (1971) 1058-1062), und der Glucose-Germanat-Komplex, der bekanntlich gebildet wird, könnte durch die Enzymreaktion gestört werden, indem er teilweise oder vollständig inhibiert wird. Tatsächlich ist das 1,2-cis-Glycol von ou -D-Glucose eher zur Komplexbildung mit Germanat geeignet als ^ -D-Glucose.

5. Mannose bildet mit Germanat stärker Komplexe als Glucose (P.J.Antikainen, Acta Chem. Scand., 13 (1959) 312).

Die Umsetzung von Glucose zu Fructose kann durch eine rein chemische Reaktion unter Verwendung von Germanat-Arten oder von Stannat-Komplex durchgeführt werden, um die Pseudo-Gleichgewichte, die von S.A. Barker, B.W. Hatt und P.J. Somers (Carb Res., 26 (1973) 41-53) beschrieben sind, zu verschieben. Vorzugsweise wird die Umsetzung jedoch als Enzym-katalysierte Reaktion in Anwesenheit von Glucose-Isomerase durchgeführt. Es kann irgendeine Glucose-Isomerase bei der Umsetzung angewendet werden, jedoch variieren diese Enzyme hinsichtlich ihres optimalen pH und der Temperatur.

Zu geeigneten Isomerasen gehören solche, die von Bakterien der Genes Aerobactor, Pseudomonas, Lactobacillus ( K.Yamanaka, Agr Biol. Chem. 2/7_, 1963, 265-270) Streptomyces, Curtocacterium (beschrieben in der britischen Patentanmeldung 13 994/74) oder insbesondere Arthrobacter (beschrieben in britischer Patentschrift 1 32 970) abgeleitet sind. Glucose-Isomerasen aus thermofilen Mikroorganismen der Genes Thermoactinomyces, Thermopolyspora, Thermoir.onospora und Pseudonocardia wie in der japanischen Patentveröffentlichung

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74/30588 beschrieben, sind ebenfalls geeignet. Einige der vorstehenden Glucose-Isomerasen benötigen für optimale Aktivität Kobaltionen.

Die Umsetzungen von Glucose zu Fructose können kontinuierlich durchgeführt werden, indem man eine Lösung, enthaltend Glucose, durch eine Säule leitet, welche das immobilisierte Enzym oder einen anderen Katalysator enthält. Vorzugsweise ist das Enzym dadurch immobilisiert, daß es in ausgeflockten ganzen Mikroben-Zellen in der Art enthalten ist, wie in der britischen Patentschrift 1 30c' 650 beschrieben. Das komplexbildende Reagenz, z.B. Germanat- oder Stanafe-Arten kann in der Lösung, welche in die Kolonne geleitet wird, oder zusammen mit dem immobilisierten Enzym oder dem anderen Katalysator in der Kolonne vorliegen. Im letzteren Fall kann die Kolonne mit immobilisiertem Enzym oder einem anderen Katalysator gepackt sein, mit dem das Reagenz vermischt ist und homogen innerhalb der Kolonne dispergiert sein oder alternativ kann die Kolonne abwechselnde Schichten von immobilisiertem Enzym oder dem anderen Katalysator oder Reagenz, welche durch Faschen oder Gitter getrennt sind, enthalten. Wenn das Reagenz in der Kolonne vorhanden iet, liegt es in unlöslicher Form vor, beispielsweise in Gelform, als Zec-lit oder als anorganisches oder organisches polymeres Derivat.

Nach der Umsetzung von Glucose zu Fructose kann die Fructose aus dem Gemisch, welches das komplexbildende Reagenz enthält, abgetrennt und aus dem Verfahren entweder allein oder in Vermischung mit Glucose entfernt werden. Das Produkt des Verfahrens ist Fructose, ein Glucose/Fructose-Sirup oder sowohl Fructose-als auch Glucose/ Fructose-Sirup. Das komplexbildende Mittel kann allein, zusammen mit

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Glucose oder zusammen mit Glucose und Glucose-Fomplex rezyklisiert werden. Die Abtrennung und Pezyklisierung kann durch irgendeine geeignete Methode durchgeführt werden. Zwei besonders geeignete Methoden zur Separierung und Rezyklisierung sind folgende:

a) Ein Verfahren, bei dem das Ausgangsprodukt der Glucose/ Fructose-ümsetzung durch eine Kolonne geleitet wird, welche ein Kation-Austauscherharz mit kationischen Gegenionen eines Metalls aus der Gruppe II des Periodensystems und Wasserstoffionen enthält. Dieses teilt das Ausgangsprodukt in Fructose, welche als Endprodukt aus dem Verfahren entfernt wird und Glucose + komplexbildendes Reagenz, welches rezyklisiert wird, auf. Vorzugsweise sind die Metallionen der Gruppe II Calziumionen.

b) Ein Verfahren, bei dem das Ausgangsprodukt der Glucose/ Fructose-Umsetzung zunächst durch eine Kolonne geleitet wird, welche ein Kationenaustauscherharz mit kationischen Gegenionen eines Metalls der Gruppen I oder II des Periodensystems, vorzugsweise Natriumionen, enthält. Dieses Verfahren teilt das Ausgangsprodukt in zwei Teile auf, nämlich (i) einen Sirup, enthaltend Glucose und Fructose und (ii) Fructose + komplexbildendes Reagenz. Teil (i) wird entfernt, während Teil (ii) durch eine Kolonne, wie vorstehend unter (a) beschrieben ist, geleitet wird, um Fructose von dem komplexbildenden Mittel, welches rezyklisiert wird, abzutrennen.

Bei beiden Methoden a) und b) ist das Harz vorzugsweise ein * im Kern sulfoniertes Polystyrol-Kationenaustauscherharz, welches ein Vernetzungsmittel enthält.

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Alternativ können andere Methoden angewendet werden, z.B. durch Aufbrechen des Fructose-haltigen Komplexes unter Verwendung von "Borasorb" (Warenzeichen) zu beziehen von Calbiochem Ltd. einem Polymeren mit einer langen Kette von cis-hydroxyl-Gruppen, die über ein tertiäres N-Ätom an ein Folystyrol-Divinylbenzol-Netz gebunden sind und normalerweise zur Absorption von Borat fü " die Erzeugung von Fructose und komplexbildendem Reagenz gehandelt wird. Wenn die Umsetzung mit den komplexbildenden Reagenz in Lösung in dem Reaktionsmedium durchgeführt wird, kann dieses Reagenz ^benfalsl rezyklisiert werden. Eo kann das aus "Borasorb" adsorbierte *4ramanat mit Alkali oder Säure eluiert werden. Alle diese Manipulationen können vermieden werden, wenn das koipplexbildende Reagenz (z.B. Gevmanat) in einer immobilisierten Form verwendet wird.

Die Umsetzung von Glucose zu Fructose wird vorzugsweise enzymatisch und kontinuierlich unter Verwendung ein^r Kolonne von ausgeflockten ganzen Zellen, welche das Enzym enthalten, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Wenn das Reagenz in dem Reaktionsmedium, welches in die Kolonne eintritt, vorliegt, ist es vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 200 HiM und 8OD mM insbesondere zwischen 500 mM und 600 mM vorhanden. Das Bteaktionsmedium, welches in die Kolonne eintritt, enthält vorzugsweise 30 % Gew/Gew.bis 50 % (Gew/Gew Glucose in wässriger Lösung, und die Reaktion ^T/ird auf solche Weise durchgeführt, daß die Konzentration an Fructose in dem die Kolonne verlassendem Medium zwischen 40 % und 85 %, insbesondere zwischen 75 % und 80 ° liegt. Der pH des Reaktionsrediums liegt vorzugsweise im Bereich von 6 bis 10, wobei optimale Aktivität im Bereich von 6 bis 10, wobei optimale Aktivität im Bereich von pH 8,

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insbesondere bei pH 7,8 auftritt, jedoch etwas variiert mit der jeweiligen Enzym-Species, wobei sich die genannten Werte auf ein
Enzym beziehen, welches von Arthrobacter - Organismen abgeleitet 1st. Die Arbeitstemperatur liegt vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 50 bis 100 C, insbesondere innerhalb des Bereiches
von 45 bis 80 C. Der pH des Eluats ist im allgemeinen niedriger
als der des Zustromes wegen des mit dem Oxyanion komplexbildenden Fructoseproduktes.

Außer Glucose und verschiedenen Arten von Germanationen enthält das Reaktionsmedium geeigneterweise die folgenden Bestandteile, welche in folgenden Anteilen vorhanden sind:

2+
Mg , Ionen bei Konzentrationen von etwa 4 mM mit Chlorid-

icnen, einer äquivalenten Konzentration und NaOH zur Einstellung von

Für andere Enzymreaktionen (z.B. Phosphorglucoisomerase, weiche Giucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat umsetzt, und wobei erhöhte Ausbeuten des Produktes bei 25°C in Anwesenheit von Arten des Germanats gefunden wurden) sind die Reaktionsbedingungen sehr unterschiedlich und müssen für jedes Enzym optimiert werden. Qlucose -Isomerase kann ebenfalls verwendet werden, um D-Xylose zu D-Xylulose umzusetzen, wobei Glucose-Isomerase ein geeignetes Ausgangsprodukt für diese Technologie ist und Germanat das Gleichgewicht zugunsten einer erhöhten Xylulose-Ausbeute verschiebt.

Die Verwendung von Germanat-Ionen als komplexbildendes

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— 1 D —

Reagenz besitzt Vorteile gegenüber der Verwendung von Boratverbindungen, welche nach dem Stand der Technik vorgeschlagen wurden, da Germanat-Arten starke Komplexe mit Fructose bilden und stereochemisch bei der Zuckerkomplexbildung selektiver sind als Borat. Die mit der Verwendung von Boratverbindungen verbundenen Toxizitätsprobleme werden vermieden. Im Unterschied zu Arenborsäuren kann Germanat ein 1:2 Germanat-Fructose-Chelat bilden und macht somit die Verwendung eines komplexbildenden Mittels wirtschaftlicher.

Der normale optimale pH des Enzyms allein kann nicht der optimale pH für das kombinierte Verfahren mit Enzym und komplexbildendem Mittel sein. Daher ist jede Fähigkeit , den optimalen pH eines Enzyms, z.B. Herabsetzung des pH von Glucose-Isomerase von 8,5 auf 7 vorteilhaft zur Herabsetzung der Kosten für die Entfernung von Farbe, welche während des Enzymsverfahrens gebildet wird. Dies trifft in unerwarteter Weise im Falle von Arthrobacter-Glucose-Isomerase zu und kann mit anderen wichtigen Enzymen ebenfalls zutreffen. In gleicher Weise ist die Fähigkeit zur Herabsetzung der Arbeitstemperatur, wobei noch die gleiche prozentuale Umsetzung in der gleichen Arbeitszeit erzielt wird, vorteilhaft. Während dies nicht der Fall bei Arthorbacter-Glucose-Isomerase ist, ist es möglich, an Arbeitszeit einzusparen, infolge eines weiteren unerwarteten Vorteils. Zugabe von Germanat erhöht merklich die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit der Umsetzung von Glucose zu Fructose, so daß eine wirtschaftliche Umsetzung bei kürzerer Verweilzeit erhältlich ist. Weiter ist es vorteilhaft, daß Germanat keine äestabilisierenden Effekte auf die Arthrobacter-Glucose-Isomerase im Verlaufe der beobachteten Zeit bewirkt, vorausgesetzt, daß der pH-Alfall, welcher mit

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— Ίο —

der Fructoseproduktion in Gegenwart von Germanat verbunden ist, verbessert wird.

Fig. 2 der Zeichnung zeigt die prozentuale Veränderung optischer Drehung als Ergebnis einer Komplexbildung, aufgetragen gegen pH für Germanat-Komplexe mit Glucose, Fructose und Mannose. Es ist zu ersehen, daß der Fructose-Komplex einen niedrigeren pH - Wert bildet, als die Komplexe von Glucose und Mannose.

Die Erfindung wird nachstehend durch folgende Beispiele näher erläutert.

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Beispiel 1 Enzymatische Umsetzung von Glucose zu Fructose

Eine Reihe von wässrigen Glucoselösungen mit einem Gehalt von verschiedenen Glucosekonzentrationen wurden zusammen mit Magnesiumionen und Germanationen durch eine Säule mit 32 cm in der Länge und 0,4 cm Innendurchmesser geschickt, die mit geflockten ganzen Zellen mit einem Gehalt an Glucoseisomerase gepackt war. Entsprechende Lösungen mit keinem Germanatgehalt wurden ebenso durch die Säule für Vergleichszwecke geschickt. Die prozentuale Umsetzung von Glucose zu Fructose in dem Eluat aus der Säule wurde in dem Autoanalyser unter Verwendung der Resorcinolmethode gemessen. Die Reaktionen wurden bei einem Anfangs-pH von 8,5 und bei einer Temperatur von 60 C durchgeführt, wobei eine Konzentration von 0,004 Mol Magnesiumchlorid in den wässrigen Glucoselösungen vorhanden war.

Um zu verhindern, daß die Germanationen eine Abscheidung von Magnesium aus den Lösungen verursachen, wurden für die Herstellung von Glucoselösungen bis zu 100 mM Germanationen-haltige Lösungen immer zu den Glucoselösungen hinzugegeben, die in die Säule vor dem Magnesiumchlorid eintreten, da Magnesium durch den Glucose-Germanatkomplex, der sich in den Lösungen bildet, nicht abgeschieden wird. Die Germanationen-haltigen Lösungen wurden hergestellt, indem man Germaniumdioxid in Wasser suspendiert, eine konzentrierte alkalische Lösung hinzusetzt, bis pH 10,5 erreicht wird und danach eine Glucoselösung und anschließend Magnesiumchlorid hinzugibt. Bei der Endeinstellung auf pH 8,5 wurden die Lösungen klar.

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Für Substratlösungen mit einem Gehalt von 200 mM Germanat oder mehr wurde das Germaniumdioxid zu einer 1 M Glucoselösung hinzugesetzt, so daß bei intermittierender Alkalizugabe bis zu einem pH 8,5 das Germanat langsam in Lösung ging. Eine leicht trübe Lösung wurde nach Zugabe von Magnesiumchlorid erhalten, jedoch war das Eluat aus der Säule vollständig klar.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Glucose - toncentration CmM)	Germanationen k concentration (mM)	- %Urnsetzunq von Glucose zu Fructose	pH des Eluats	Durchfluß rate (ml/min)
0,528	0	59		0,12
0,528	25	75	n. z.	0,12
4,65	0	57	8,3	0,10
4,58	25	82	8,1	0,10
122	0	47; 5	7,o	OjIl
118	25	80,5 -	6,8	0,11
337	0	44,5	6,8	0.11
270	25	63	6,7	0,11
259	0	46⁺	6,5	OjIl
265	25	53	6,3	OjIl
300	50	52	6_;0	0,11
284	100	59,5	6,4	0,11
275	200	72,5*	7,2	0,11

603353/1086

55,5 % beim Gleichgewicht

* 82% beim Gleichgewicht (End-pH-Wert 6,5)

Wie aus Tabelle 1 in jedem Fall entnommen werden kann, wo Vergleichslösungen, die keine Germanationen enthielten getestet wurden, wurde die Fructosekonzentration in Gegenwart von Germanationen erhöht.

Beispiel 2
Enzymatische Umsetzung von Glucose zu Fructose

Die Verfahrensweise von Beispiel 1 wurde unter Verwendung einer Säule mit ähnlichen Ausdehnungen (d.h. 30 cm in der Länge und 0,4 cm Innendurchmesser) wiederholt, um den Einfluß von höheren Glucosekonzentrationen zu studieren. In diesem Fall wurde die Durchflußgeschwindigkeit auf 0,03 ml/Min. reduziert, um eine maximale Verweilzeit von 125 Min. zuergeben, so daß Gleichgewicht über mehrere Stunden erreicht wird. Der unter diesen Bedingungen erhaltene Gleichgewicht swert wurde aufgezeichnet. Die Glueosekonzentration wurde jeweils geprüft, nachdem die Mischung entsprechend der · Verdünnung mit Alkali-/Magnesiumsalzen korrigiert worden war.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

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Tabelle 2

.Änfangsglucose- koncentration (% Gew/Vol	Germanationen- - koncentration	% Fructose (Gew. /VoI)	% Umsetzung
47,4	0	25,6	54; 0
45,6	364	32,0	70,0
43,7	524	35,0	80,0
43,5	696	36,5	84,0
50,0	800	39 τ 7	79,4

Wie aus den Ergebnissen ersichtlich wird, erhöhte die Gegenwart von Germanationen die prozentuale Umsetzung zu Fructose stark.

Die Fructose wurde durch die Chaplin-Kennedy-Methode analysiert (Carbohydrate Res., _4O, 227-33 (1975)). Dieses Verfahren ergibt leicht höhere Werte als die Resorcinol-Methode, welche bei allen späteren Beispielen für Fructose verwendet wurde.

In einem weiteren Versuch, der durch die Resorcinol-Methode geprüft wurde (Carbohydrate Res., 26^, 41 (1975)) wurden unter Verwendung einer Säule mit den gleichen Ausdehnungen bei 6G°C und pH 8,5 die folgenden Ergebnisse unter Verwendung von-verschiedenen Durchflußraten auf der Säule erhalten.

609853/1086

Durchflußrate	Säule	Zustrom
(ml/min)		(mit zugefügten
	51,2% Gew/Vcl	47,8% Gew/Völ
	nur Glucose	Glucose + 800 mM
		Germanat
0,015	53	74
0,030	42,5	69
0,050	36	50

% Umsetzung zu Fructose

Das Produkt mit der anfänglichen Glucosekonzentration von 4 3,5 % in vorstehender Tabelle 2 wurde auf einem Anionenaustauscherharz (Jeol Ltd) in der Boratform unter Verwendung einer stufenweise Elution mit Boratpuffern fraktioniert (o,13 molares Borat pH 7 bis 0,35 molares Borat pH 9,8), um eine Trennung zwischen der Glucose und der Fructose in dem Produkt zu bewirken. Die gleiche Trennung wurde ferner nach Entfernung des Germanats auf einer Säule von "Borasorb" durchgeführt. Das Verhältnis von Fructose zu Glucose betrug 3,31:1 ohne vorherige Germanatentfernung. Fructose und Glucose wurden unter Verwendung der Cystein-Schwefelsäure-Methode analysiert.

Beispiel 3
Chemische Umsetzuna von Glucose zu Fructose

Die rein chemische Umsetzung von Glucose zu Fructose in Gegenwart von Germanationen wurde durchgeführt, indem man eine Lösung mit einem Gehalt von 50._;Gew/Vol. Glucose, 4 mM Magnesiumsalz und

609853/1 086

600 mM Germanationen auf 60 C bei pH 8,5 erhitzt. Die gefundenen Fructosekonzentrationen nach verschiedenen Zeiten waren wie folgt:

Zeit (Min)	% Fructose
90	3,3
135	4,6
180	5,7

Der Versuch wurde bei 90 C mit einer Glucosekonzentration von 48,4 - 50 % Gew/Vol. und einer Germanatkonzentration von 600 mM -5 82 mM wiederholt. Die prozentualen Umsetzungen zu Fructose, die nach verschiedenen Zeiten erhalten wurden, sind in Tabelle 3 aufgeführt. Fructose wurde durch die Resorcinol-Metnode analysiert. Stickstoff war in dem erhitzten Sirup während des Versuchsverlaufs vorhanden. In allen Fällen fiel der anfängliche pH, welcher bei 31⁰C gemessen worden war, und wurde auf den ursprünglichen pH bei der angeführten Zeit wieder eingestellt.

609 8 5 3/1086

Tabelle 3

4ß$ Gew/Völ Glucose ftnfangs-pH 7,0 : kein.zugesetztes JBgCl? 5&2n$C GeTmansÄ	o/. Umsetzung 70 ZU Fructose	50% Gew/Völ Glucose Anfangs-pH 7,5 kein zugesetztes MgCl₂ 60OnM Germanat	50% Gew/Völ Glucose Anfangs-- pH 8.0 kein zugesetztes MgCl₂ 60OmM Germanat	Umsetzung %z u F met ob θ
Zelt. (h)	2,0	Zeit ., Umsetzung (h ) Fructose	Zeit (h )'	9_rl
0,5	3,8	0_;·5 4,3	0,5	12,5
1,0	4,7	1,0 8,2	1,0	14,4
	6,8	1,5 9,7.		15,2
²,5	7,4		2,0	15,45
3,0	7,8 8,3	3,0 12,0	3,0	_x ^χ5ί4 »74) 18_;3
3,5 4,0	8,7	3; 5 12,6	3,5 (pH 6 4,0	18^3
Ap 5	6,0 12.2 ( End-pH 6,37)	4,5

Ähnliche Versuche wurden in Gegenwart von zugesetztem-MgCl₉
durchgeführt. Die durch die Resorcinol-Methode erhaltenen Ergebnisse

sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Die folgenden Ergebnisse wurden mit 1,245 M©1 Glucose, 600
mM Germanat und 4 mMi . MgCl₂ bei pH 8,5 und 90°C erhalten. Sie verdeutlichen die Wichtigkeit des Verhältnisses von Glucose zu Germanat.

609853/1086

Zeit (h)

% Umsetzung zu Fructose

Zeit (h)

% Umsetzung zur Fructose

0,5 1,0

19,8 31,6

3,66 4,33

1,5 2,0

46,1 48,5 48

6,5

2,5 (pH 7,48)

36,2 38,6 38,6

Das wenige Stunden später erzielte Produkt wurde (mit und ohne vorherige Germanat-Entfernung) auf einer Boratsäule .getrennt, Praktisch identische Werte von 3 9,7 % Fructose wurden bei Elution an der calibrierten Stelle für Fructose erhalten.

Tabelle 4

5O90Gew/Vbl Glucose anfangs-pH 8 0,004 M MgCl₂ 600mM Germanat	o/ Umsetzung zu F ructosei	50%Gew/Vol Glucose Anfangs- pH 8,5 • 0_;004 M MgCl 600mM Germanat	₀/ Umsetzung zu Fructose	50% Gew./VoI Glucose Anfangs- pH 9_r0 0,004 M MgCl 60OmM Geimanat	n/Umsetzung Fructose	36,2
Zeit (h )		Zeit (h )	19_f5	Zeit (h)	30,3
		0,5	28,5	0,5	35,2
	16,9	l_;0		V⁰	35,7
2,17	19₇O		29 ;8	2,0	36,7
2,83	18,8 18,0 •37)	2,83	27,2 42) '	2_;33	2_r67 (pH 6_;98) 3,33 35,8
3,33 4,0 (pH 6	22jl	3; 33 (pH 6_r	34,3	3_;67
4f5	23	⁴/⁵	35,5
4_r83	22j7
5,33

609853/1086

Eine Lösung aus 55 % Gew/Vol Glucose, 600 mM. Germanat, 0,004 MgCl„ , die auf 90°C erhitzt wurde und einen anfänglichen pH von 7,5 besaß, zeigte nach 6 Stunden eine 13,7 %ige Umsetzung zu Fructose, wie durch die Resorcinol-Methode analysiert wurde.

Die chemische Umsetzung von Glucose zu niedrigen Germanatkonzentratxonen bei 90°C und setztes Magnesiumchlorid sehr langsam ab.

Fructose lief bei pH 8,5 ohne züge-

10OmM Glucose 1OmM Genn&ncft Zeit % Umsetzung	3; 5	2OmM 1OmM Zeit	Glucose Germanat /° Umsetzung	20 M Glucose 2OmM Germanat Zeit 9° Umsetzung	4,3
0,5	7,6	0,5	4,3	0,5	8_f5
1	10,7	1	8,5	1	15,5
¹Z 5	18,. 2	^Xf5	11,7	2
2,67	18,8	²f5	18,7
3⁺ (pH 8_fl6)	21,5	3⁺ (pH	7,78) 19,8		·■ 19,8 .22)
3,5	24,2	3,5	25,3	3⁺ (pH 8	20,4
4		4	29,1	5/5	25,6
	25,6			4
	27,5				29,7
5	29,i :	5⁺ (pH 7,8)	. 33,4	5	32,2 /0)
5/5	30,3			(pH 8	33,5
ζ* O	31,8	6	36,8	6	37,3
7	31,9			7
7; 5+ (pH 7,82)	33r4	7/5	39,7		39,4
8,5	9 34,6 eingestellt _R _ ⁺pH auf '"	8	4O_;6	8	38,9
9 ΐ	40,6	9

3/1086

Beispiel 4

Umsetzung von Glucose zu Fructose unter Verwendung von lösliche r Glucoseisomera se

Die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten unter Verwendung von Glucosexsomerase in einer löslichen Form (200 ^1) wurden bei 60 C und pH 8_f5 mit 0,5 mM . D-Glucose als Substrat untersucht, wobei 4 mM MgCl₉ und 0,5 mM CoCl₉ konstant in einer Reihe von Lösungen (25 ml) mit einem Göhalt von verschiedenen Mengen des zugesetzten Germanate hinzugegeben wurden. Die Lösungen wurden mit der automatisierten Resorcinol-Methode analysiert.

Kein Germanat 6,25 ^ig Fructose/Min/ml Enzym 0,5 mM . Germanat, 8,75 ps% Fructose/Min/ml Enzym 25 mMi Germanat, 15 ^ig Fructose/Min/ml Enzym

Die Umsetzung zu Fructose nach 21 Stunden wurde ebenso bestimmt.

Keine Germanat zugabe, 43 % Umsetzung, 0,5 mM' ".51% Umsetzung; 25 mM 62 % Umsetzung.

Beispiel 5 Umsetzung von Mannose zu Fructose

Eine Lösung mit einem Gehalt von 50% Gew/Vol Mannose, 4 mM. . 21-.TCI₂ und 600 mM Germanat wurden bei 90°C und pH 8,5 erhitzt. Die

Fructosekonzentrationen, die durch die Resorcinol-Methode analysiert wurden, sind in Tabelle V aufgeführt.

Tabelle 5

Zeit (min) ' Umsetzung zu

% Fructose

30 3,44

60 6,42

120 13,4

150 15,4

170 (pH 7,25 wiedereingestellt 15,9 auf pH 8,5)

260 20,4

280 20,6

Beispiel 6 Umsetzung von Glucose-6-phosphat zu Fructose-6-phosphat

Unter Verwendung der Technik von Beispiel 1 wurde eine Reihe von Versuchen unter Verwendung einer 0,5 mMol Lösung von Glucose-6-phosphat durchgeführt, zu welcher verschiedene Mengen von Germanationen zugesetzt wurden. Die Versuche wurden bei 25°C durchgeführt und bei einer Reihe von verschiedenen pH-Werten. Das verwendete Enzym war Sigma-Grad- -III aus Hefe (kristalline Suspension) und wurde 20Ofach verdünnt und gegenüber destilliertem Wasser dialysiert, um Puffersalze vor der Verwendung zu entfernen. Das erzeugte Fructose-

609853/10ae

6-phosphat wurde durch die Resorcinol-M[ethode analysiert.

Die erzielten prozentualen Umsetzungen sind in Tabelle 6 aufgeführt.

Tabelle 6

Geunanat- ionenkon-	% Umsetzung	pH 10,5	-	pH 10,0	pH 9,5	pH 9,0	pH 8,5	pH 8,0	pH 7,5	pH 7,0
zentration	84	86	. 84	65	56	48	36	30
200	81	81	- 77	68	48	40	36	32
100	82	81	77	62	48	40	33	29
50	89	81	78	60	50	39	29	23
25	76	69	64	56	40	29	25	22
12,5	62	55	48	40	32	25	23	22
6,25				23			22
0

Wie aus der Tabelle ersichtlich wird, stieg die prozentuale Umsetzung in Gegenwart von Germanationen an.

809853/1086

Beispiel 7 Enzymatische Umsetzung von Glucose zu Fructose-Stabilität

Eine Zufuhrlösung mit einem Gehalt von 41,2 % Glucose,

600 mM Germanat- und 4 mM Magnesiumchlorid bei einem anfänglichen pH von 7,0 wurde kontinuierlich durch eine Enzymsäule, ähnlich wie diejenige von Beispiel 1 geschickt. Der End-pH und die prozentuale Umsetzung zu Fructose wurden nach verschiedenen Zeitintervallen gemessen. Der Versuch wurde in drei Perioden eingeteilt.

Nach einer ersten Periode von 4 3 Stunden wurde die

Zufuhrlösung durch gesinterte Filtration zur Entfernung des geringen Niederschlags gereinigt, welche sich in Glucose/Germanat-Lösungen nach sehr langen Zeitspannen leicht bilden. Dies führt zu einer Erhöhung in der Aktivität, welche leicht gefallen war. Nach einer zweiten Zeitspanne, die sich von 4 3 bis 102 Stunden ausdehnte, wurde der pH der Zufuhr auf 7,8 mit vorteilhaften Ergebnissen erhöht. Der pH des Eluats hat die Neigung nach längerem Durchgang durch die Säule merklich zu fallen. Es scheint, daß Umsetzungen von mehr als 70 % über eine verlängerte Zeitspanne beibehalten werden können, falls der pH des Säuleneluats nicht merklich unter 7,0 fällt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7A aufgeführt.

809853/10

- 3O -

	Tabelle 7A	End-pH nach Durchgang durch den Enzymreaktor	% Itesetzung zu Fructose
		*6_f6*	67,2
Zeit (h)	Anfangs- pH	^e	61,5
2	. ⁷f°	. 5,5	6O_f8*
17	7_fo	Y	64_r9
43	T₁O		65,5**
54	7_ro	6,9	76,5
102	7,0	6,9	78_r3
126	7\|8		76i5
150	7,8	6,8	71,6
174	7_f8
198	7_f8

* Ende der ersten Zeltspanne - die Zufuhrlösung wurde danach gereinigt.

** Ende der zweiten Periode - der Anfangs-pH wurde erhöht.

Die Effekte von verschiedenen Temperaturen auf die Stabilität wurden unter Verwendung einer wie vorstehend verwendeten Enzymsäule aeinessen. Die Ergebnisse sind in Tabellen 7B und 7C aufgeführt. Die Reakticnsbsdingungen sind bei den Tabellenköpfen der Tabellen angegeben. In Tabelle 7 B ist die Umsetzung diejenige, die beim Gleichgewicht erreicht ist_r während in Tabelle 7C die Umsetzung die-

jenige ist, die anfänglich erreicht wird. In beiden Tabellen. 7B und 7C zeigen die Ergebnisse den kumulativen Effekt.

Tabelle 7 B

Gew/Vol Glucose +4mM MgCL, + 600 πΜ Germanat pH 7,1-beil einer Durchflußrate von 0,05 ml/min durch das Enzym

• _A _ . % Umsetzung zu

Team C Datum .

"^ Fructose (Enzym - -2 Tage später gewaschen) 55 26.11.75 69_;2

60 26.11.75, 73_?4

65 ' 26.11.75 75,1

70 27.11.75 71_;5

7 5 27.ll.75 · · 72_fl

80 27.II.75 ' . 75_fO

85 27.ll.75 6O|5

60985 3 / 1

Tabelle 7 C

4496Gew/Vol Glucose +4itiM MgCl^QOmM Germanat pH. 7^1

bei einer Durchflußrate von 0,16 ml/min durch das Enzym

T*np°C Datum % Umsetzung frchflußrate S^gs de?

zu Fructose durch die Säule ^ ^

(Enzym, 14 Tage bei einer emzel- cy ι

später ge- ; nen Temperatur ,,.

waschen) " . (h)

1* 3

ii 4i

ii 6

55	8/12/75	22,7
60	9/12/75	30,1
65	11	31,8
70	ti	34,1
75	Il	55,8
80	It	52,4
85	It	25,6

ii 12

Beispiel 8

Chemische Umsetzungen von Zuckern a) Glucose zu Fructose

Glucoselosungen (55-60 Gew/VoI)wurden sowohl mit als auch ohne Einschluß von 600 mM Germanat bei pH 12 bei 20°C hergestellt. Unmittelbar nach Herstellung wurden 50 ml aliquote Anteile genommen, auf 5 ml verdünnt und danach bei einer Temperatur von -20°C aufbewahrt, bis sie analysiert wurden. Die Sirups wurden dann in gestöpselte Flaschen in einem Kühlschrank bei 4,5°C gelegt. Die Flaschen wurden täglich geschüttelt und aliquote Anteile wurden bei den in Tabelle 8 A gezeigten Zeitintervallen entfernt. Alle Proben wurden

609853/1Ö90

durch Trennung auf einem Ionenaustauscherharz ir.it Borat analysiert und die Peaks wurden durch die automatisierte Cystein/Schwefelsäureanalyse überwacht (Anal.Biochem. £j5, 219) 1968j.Es wurde bemerkt, daß die germanathaltige Lösung nur eine leicht matt weiße Farbe über die gesamte, durch die Tabelle 8 A auf geführte Periode entwickelte, während die ^ermanatfreie Lösung rasch eine grüne Farbe annahm , welche sich während der Inkubation vertiefte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 A aufgeführt.

Tabelle 8 A

jagerung£ zeit (Tage)	- Germanat-haltige Lösungen	verbliebene Glu» cose Cew/Vol ;	Lösungen ohne Germanat	verbliebene Glu cose Gew/Vol
0 14 25 27 51	Erzeugte Fruc tose Gew/Vol	51,8 40,5 54,2 26_r9	erzeugte ' Fructose . - Gew/Vo	48_f7 44,6 55,2 55,6
²I¹ 17,8 25_rO 51r9*	2,2 8,9 11,1

Äquivalent zu einer 54 % igen Umsetzung. Nur 3,1 % Mannose vorhanden. 5 % Mannose vorhanden.

609853/1086

b) Der Inkubationseffekt bei pH12 und 5°C in Gegenwart und Abwesenheit von Germanationen wurde mit einer Reihe von Zuckern untersucht. Die erzielten Ergebnisse und die Grundbedingungen im Hinblick auf die Fructose-, Mannose-, Maltose- und 3-O-Methyl-D-Glucose— Lösungen sind in Tabellen 8B, 8C, 8D bzw. 8E aufgeführt. In allen Fällen hat die Germanatanwesenheit zwei Effekte a) sie verzögert die Zerstörung von Zuckern und b) sie ändert die Konstitution der Gleichgewichtsmischung. In den Tabellen addieren sich die Ziffern nicht zu 100 % wegen der Zersetzung«

Anfängliche D-Fructose-

konzentration

Gennanat

52,1% Gew./Vol.

keines

50,5% Gew./Vol.

600 mM

gefundene Komponenten (%) D-Glucose D-Mannose D-Fructose unbekannt a unbekannt b

17 Tage 30 Tage

36,4 . 42,3

22,8 24,3

27,8 21,2

17 Tage 18,1 26,7 51,2

/ 1 1Ί ö fl

- 35 Tabelle 8C

Anfängliche D-Mannose- konzentration Germanat	51,14 Gew. keines	/Vol.	53,3% Gew. 600 mM	/Vol.
gefundene Verbindungen	17 Tage	30 Tage	17 Tage 3O	Tage
D-Mannose	79,3	53,4	60,2	27,45
D-Fructose	13,65	18,3	32	44,4
unbekannt ι	+		-	-
unbekannt 2	+	₊₊₊	—	-
D-Glucose	7,2	18,8	7,1	13,36

Tabelle 8D

Anfängliche Maltose- 'konzentration Germanat	59% Gew./Vol. keines	27	Tage	58,7% 358	Gew./Vol. mM	Tage	9,3
gefundene Verbin dungen (%)	15 Tage	26,	5	15 Tage	27	,9
Maltose	38,3	21,	5	48,5	13,	r9
Maltulose	24,5	4,	39	51,9	67,	h
Fructose	2,4	22	,8	-	+h
Glucose	22,1		Spuren

Berechnet als Molekulargewicht mit 0,5 molarer Glucoseempfindlichkeit +0,5 molarer Fructoseempfindlichkeit

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Tabelle 8E

Anfängliche 3-0-Methyl D-glucose- konzentration Germanat	41,8% Gew./Vol. keines	58,7% Gew./Vol. 464 mM
gefundene Komponenten (%) 3-O-Methylfructose ** 3-0-Methy!glucose	15 Tage 1,8,5 36,1	15 Tage 29,7 46

Diese Verbindung ist als sehr alkalilabil bekannt. Berechnet unter Berücksichtigung der Fructoseempfindlichkeit

Beispiel 9 Enzymatische Umsetzung von Xylose zu Xylulose

Eine Xyloselösung mit einem Gehalt von 44 % Gew./Vol. Xylose und 4 mM MgCl₂ bei pH 7,0 wurde hergestellt und durch die Glucoseisomerasenzymsäule , die in den früheren Beispielen für die emzymatische Umsetzung von Glucose zu Fructose verwendet wurde, geschickt. (Säulentemperatur 60°C und Durchflußgeschwindigkeit 0,05 ml/Mini, In ähnlicher Weise wurde eine Lösung mit einem Gehalt von 44 % Xylose, 4 mM MgCl₂ und 600 mM Germanationen durch die Säule bei pH 7,0 geschickt.

Nach zwei Stunden wurden die Fraktionen gesammelt und auf einem Ionenaustauscherharz in der Boratform getrennt. Ein Xylosekontroll-

609853/1ÖSS

standard wurde ebenso durch die Säule als Vergleich geschickt. Eine automatisierte Cystein /Schwefelsäure-Analyse für Pentosen wurde verwendet, um die Peaks in der Reihe,wie sie aus der Säule herauskamen^zu analysieren. Die Probe reagiert ferner mit Pentulosen und das Xyluloseprodukt aus den Xyluloselösungen, die durch die Enzymsäule geschickt worden waren, war deutlich sichtbar.

Weil eine. Standardxylulose für Eichungszwecke noch nicht verfügbar war, wurde das Ausmaß der Reaktion durch Vergleich der Flächen unter den Peak bestimmt. Dieses Verhältnis von Xylulose, das durch die Gesamtxylose gebildet wurde und Xylulose betrug 41:100. In Gegenwart von Germantionen betrug dieses Verhältnis 5Ö:1OO.

Beispiel 10 Umsetzung von Glucose zu Fructose unter Verwendung von Stannationen

Zwei Speiselösungen mit einem Gehalt von 44,6 % Glucose und 4 mM MgCl₂ bei pH 8, 5 wurden durch die Glucoseisomeraseenzymsäule geschickt, die in den vorhergehenden Beispielen verwendet wurde. Eine Lösung enthielt keine Stannationen, während die andere 600 mM Stannationen enthielt, die aus kristallinem Ua₂SnO₃.3H₂O erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.

6 0 9 Z -^:. ?. / i Ü 8 δ

Tabelle 9

Zeit (h)	% Umsetzung zu Fructose kein Stannat	% Umsetzung zu Fructose (600 mM Stannat) (a) (b)	53,3	56,1
1	-	59,4
2	-	56,6
3	42,6
4	—

Die Proben des Reaktorsäuleneluats erzeugten bei Vermischung mit zusätzlicher Glucose keine weitere Fructose. Dies zeigt, daß die aktive Glucoseisomerase aus der Reaktorsäule nicht herausgelöst worden war.

Beispiel 11

Enzymatische Umsetzung von Glucose zu Fructose: Einfluß von pH und Germanatgehalten

a) Zwei Versuchsserien wurden unter Verwendung einer Glucoseisomerasesäule {Länge 31 cm, Durchmesser 4 cm) durchgeführt, die ähnlich wie die in den früheren Beispielen verwendete Säule war. Jede Serie wurde mit den erzielten Ergebnissen unter Verwendung von Speiselösungen, mit einem Gehalt an Glucose und 4 mM MgCIj mit und ohne 600 mM Germanat verglichen. Die Durchflußrate durch die Säule betrug 0,05 ml/Min, und die Temperatur des Enzyms be-

609853/1086

trug 60 C. Der anfängliche pH der Speiselösungen wurde zwischen verschiedenen Versuchen in jeder Serie variiert und der End-pH des Eluats wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt.

Tabelle 10

Serie	pH der fifiis- zufuhr	7	Ana- ? Iy s en- ■ zahl ^	tafänglicheGerma- >rozent _na^- iucose- _Konzn> (Gew./Vol.) nM	0	%Umsetzung zu Fructose	End-pH des Eluats
1	7	7	3	48	0	48,2	-
1	6,9	8,5	8	47	0	4916	7,2
1	β_?5	8,3	1	49,2	0	49,2 -	-
1	t	8,3	2	49; 3	600	49; 2	-
1	7,0	5	40; 2	600	76; 5	7;0
1	8^4	6	40_;0	600	7O_;3	6,9
1	8_Γ5	4	38_;2	600	74,6	7;2
1 ·	7,1	7	40,0	600	72,5	6,6
1	8,6	9	37,0	0	71)2	7;0
2	2	42; 0	0	54_;O	!Μ'
2	1	41; 6	0	49,3	7;¹
2	4	44,6	600	54,9	7,0
2	5	53,4	600	.67,4	6,8
2	3	50,0	66,7	6,8

b) Zwei Versuchsserien wurden unter Verwendung einer Glucoseisomerasesäule durchgeführt, die ähnlich wie die in früheren Beispielen verwendete Säule war. Die Speiselösungen enthielten 50 Gew./Vol. Glucosekonzentration, 4 inM MgCl₃ und 200 bzw. 600 mM Germanat in den verschiedenen Serien. Die Versuche wurden bei einer Vielzahl von pH-Werten durchgeführt. Eine Vergleichsserie von Versuchen wurde unter Verwendung von Lösungen ohne Germanat durchgeführt. In allen Versuchen wurden die Lösungen durch die Säule mit immobilisierten Enzylm bei einer Durchflußrate von 0,05 ml/Min. (75 Min. Verweilzeit) gepumpt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.

Tabelle 11

	Eluatzusainnensetzung (% Fructose)	20OmIi Germanat	600 mM Germanat
pH	kein Germanat		68
9,0	51	64	69
8,5	51	59	70
8,0	49	60	70
7f5	50	60	70
TfO	50	59	69
6,5	59	58
6jO		50

60 9 8 53/1086

Beispiel 12

Enzymatische Umsetzung von Glucose zu Fructose - Reversibilität

Lösungen von Glucose zu Fructose mit den in Tabelle 12 gezeigten Kohlenhydratkonzentrationen wurden hergestellt. Diese Lösungen mit einem Gehalt an Germanat wurden hergestellt, indem man abgewogene Mengen GeCL in aliquoten Anteilen von diesen Lösungen unter Rühren in kleinen Mengen von 50 %-iger Natriumhydroxydlösung auslöst. Aliquote Anteile einer MgCl^-Lösung wurden zu all diesen Lösungen hinzugefügt, bis eine Endkonzentration von 4 mM erreicht war und der pH von allen Lösungen wurde auf 8,5 bei 25°C eingestellt.

Die Lösungen wurden danach bei den aufgeführten Durchflußgeschwindigkeiten durch die Enzymsäule (30 χ 0,4 cm) bei 6C» C gepumpt. Der Fructosegehalt in dem Säuleneluat wurde nach Verdünnung überwacht. Für die Eichung wurden Syrups mit 0,55 % Gew./Vol. hergestellt und durch das gesamte analytische System geschickt. Um den Anfangsglucosegehalt in den SpeisesYrups zu kontrollieren, wurden die Proben und die Eichstandardsyrups auf 2 xio manuell verdünnt und durch die Cystein-Schwefelsäuremethode analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 aufgeführt und sind graphisch in Fig. 1 der Zeichnungen gezeigt. Diese Zeichnungen zeigen deutlich, daß ohne vorhandenes Germanat die Gleichgewichtslage zwischen 52 und 53 % Fructose liegt, ob man mit einem Glucose- oder einem Fructosespeisesirup beginnt. Die Gleichgewichtslage liegt zwischen 74 und 79 % in Gegenwart

o Pi ° ö:; / ■-: ο ti

von 600 mM Germanat, wobei man wieder entweder von Glucose oder Fructose ala Speisesirup ausgeht.

Tabelle 12

'Durch fluß rate	Kohlenhydrat [speisezusam. % Gew./Vol. ohne Ger- nanat	fehlenhydrat Zusam. % Gew./Vol. [tiit Germanat Ln der Zufuhr	Nomi nelle Verwsil- zeit	Eluatzusai kein ■Germanat	tnensetzun ' 600 πΜ * Germanat	r Speise typ
0,1	54,6	5O_f5	58	22_/5	3I₇O
0,05	51_r2	47 ₇B	75	36_;O	49 f 5	Glucose
0,03	51; 2	47; B	125	42,5	68_;5
0,015	51; 2	47,8	251 '	53/0	74,0
o₇i	55,0	48,2	38	71,0	79,0
0;05	55,0	48_;2	75	55,5	77,5
o₇o3	55,0 "	48,2	125	53,5	77;O	Fructose
0,015	55;O	48_;2	251	52,0	77,0

Beispiel 13

Enzymatisch^ Umsetzung von Glucose zu Fructose - Konzentrationsabhängigkeit

Eine Reihe von Lösungen mit einem Gehalt von 600 mM Germanat und 4 mM MgC^» jedoch mit verschiedenen Glucosekonzentrationen wurde durch eine Glucoseisomerasesäule bei einer Temperatur von 60°C geschickt. Die verwendete Säule war ähnlich wie diejenige in früheren Beispielen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 gezeigt.

Tabelle 13

Glucosezufuhr- konzentration (% Gew./Vol.)	% Umsetzung zu Fructose	End-pH
20,5	92,7	7,8
30,0	8,0,0	7,8
40,0	72,5
53,4	67; 4	6,8*
60,0	65,0	7,5

Aus einem früheren Versuch

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Beispiel 14

Chemische Umsetzung von Melibiose

Die chemische Umsetzung von Melibiose (6 - 0 - D-Galactopyranosyl-D-glucose) wurde in Gegenwart und Abwesenheit von 324 mM Germanat bei pH 12,0 und 4°C untersucht. Die Melibiosekonzentration in der Ausgangslösung betrug 51,6 % Gew./Vol. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 gezeigt.

Tabelle 14

' Verbin dung	% des angeg .nach der ino !ührten Anzc 0	ebenen Zucke L Tabellenkoi: hl von Tag* 15	»rs im Gasam )f der Spalte 5n 29	[tzucker η aufqe- 42	Germanat
Melibiose I	92₇2	55;5	57,5	49,6
!6-O-ok-D Galacto- .;pyranosyl- D-fructose		9,8	12,β	11,0	Abwesend
Galactose	-	9,9	11,9	12,5
!Gewinnung der.identi rizierten Produkte	. 95,4	75,2	82_;2	72_;9
Melibiose	-	4*,7	35,0	25,2
6-0- ^L -D 9a.lacto- pyranosyl- D-fructose	-	37,8	*,>		Vorhanden
Galactose	-	-	7,9	12,8
'Gewinnung der iienti fizierten liTDdukte	-	80,5	85; 4	69.1

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Claims

Patentansprüche

(TX

Verfahren zur Umsetzung einer Aldose oder eines Aldosederivates zu einer Ketose oder eines Ketosederivates, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart eines komplexbildenden Reagenzes durchgeführt wird, wobei als komplexbildendes Peagenz ein Oxyanion oder ein gemischtes komplexes Oxyanion mit Germanium oder Zinn oder ein gemischtes komplexes Oxyanion von Germanium einge setzt wird, welches einen stärkeren Komplex mit der Ketose oder dem Ketosederivat als mit der Aldose oder dem Aldosederivat bildet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Mannose oder Glucose zu Fructose umgesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Umsetzung einen Enzymkatalysator verwendet.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mannose oder Glucose zu Fructose in Gegenwart von Glucose-Isomerase umsetzt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da·* durch gekennzeichnet, daß man das Enzym in immobilisierter Form auf einer festen Matrix einsetzt, wobei die Matrix eine lebende Seile, eine inaktivierte Zelle oder irgendein anderer geeigneter Träger ist.

⁶ 0 3 i. . '.. / j G Ö 6
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das komplexbildende Reagenz in das Verfahren als Aldose-Oxyanion-Komplex oder als Derivat eines Aldose-

Oxyanion-Komplex oder als Salz oder Oxid oder einer anderen Verbindung einsetzt, welche Oxyanionen oder gemischte, komplexe Oxyanionen

unter den Verfahrensbedingungen bilden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als gemischtes komplexes Oxyanion ein solches einsetzt, welches durch Einwirkung eines Oxyanions von Germanium oder Zinn auf ein Ion eines anderen Elementes aus der Gruppe IV des Periodensystems oder eines Elementes aus Gruppen V oder VI des Periodensystems gebildet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Umsetzung von Mannose oder Glucose zu Fructose als Glucose-Isomerase eine solche einsetzt, welche aus einem Stamm von Arthrobacter abgeleitet ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das komplexbildende Mittel in einer lösung enthaltend die Aldose, durch eine das Enzym enthaltende Masse durchleitet.

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10 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die erzeugte Ketose und/oder das erzeugte Gemisch aus der Ketose mit restlicher Aldose. von dem komplexbildenden Reagenz abtrennt und das komplexbildende Reagenz entweder allein oder zusammen mit restlicher Aldose rezyklisiert.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Umsetzung von Glucose zu Fructose in Gegenwart von Glucose -isomerase das komplexbildende Reagenz in Lösung in Konzentrationen zwischen 200 mM und 800 mM einsetzt.
12.. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ä.Le Umsetzung von Glucose zu Fructose in Gegenwart von Glucose/Isomerase unter Verwendung eines Zustroms aus einer wässrigen Lösung, enthaltend 30 Gew.-% bis 50 Gew.-% Glucose durchführt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung von Mannose oder Glucose zu Fructose in einem Reaktionsmedium mit einem pH im Bereich von 6 bis 10 durchführt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung von Mannose oder Glucose zu Fructose bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 50 bis 100⁰C durchführt.

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