FI56537C - Foerfarande foer omvandlande av glukos till fruktos med tillhjaelp av glukosisomeras - Google Patents

Description

γβΊ kuulutusjulka.su c Ή$Γφ LBJ (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 56537 C (45v Patentti sySrtn.'tty 11 C2 1930 Patent medcielat ^ ^ (51) Kv.ik.»/int.ci.» C 07 H 3/02, C 12 D 13/00 SUOMI—FINLAND (21) p»tenttlh*ke,T'ul-p«*nt»n*öi«ing 761757 (22) Htkemlipilvi — An*<Sknlng*dag 17.06.76 (23) Alkupilvi — Giltighctsdag 17.06.76 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offentllg -^g 76

Patentti, ja rekiitarihallitus Nih«v*k,«panon |. kuuLjuikauun Pvm.-

Patent· och registerstyrelten Aniökan utlagd och uti.skrlften publleerad 31 . iQ . jg (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus —Begird prlorltet 17.06.75

Englanti-England(GB) 25757/75 (71) Imperial Chemical Industries Limited, Imperial Chemical House,

Millbank, London SW1, Englanti-England(GB) (72) Sidney Alan Barker, Birmingham, Peter John Somers, Birmingham,

Robin Ross Woodbury, Birmingham, Geoffrey Harry Stafford, Stockton-on-Tees, Cleveland, Englanti-England(GB) (7*0 Oy Kolster Ab (5^) Menetelmä glukoosin muuttamiseksi fruktoosiksi glukoosi-isomeraasin avulla - Förfarande för omvandlande av glukos tili fruktos med till-hjälp av glukosisomeras Tämä keksintö koskee menetelmää elukoosin muuttamiseksi fruktoosiksi glukoosi-isemeraasin avulla pH:ssa 6,5-9,0 lämpötilassa 50-100°C kompleksoivan reagenssin läsnäollessa, joka muodostaa voimakkaamman kompleksin fruktoosin kuin glukoosin kanssa, ja ottamalla fruktoosia sisältävä tuote talteen.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista,että kompleksoiva reagenssi on germaniumin happipitoinen anioni.

Kun glukoosia isomeroidaan fruktoosiksi glukoosi-isomeraasin läsnäollessa, tasapaino saavutetaan hyvin usein, kun 50-55 % reaktioväliaineessa olevasta glukoosista on muuttunut fruktoosiksi. Tähän saakka ei ole ollut mahdollista muuttaa glukoosia fruktoosiksi ei-entsymaattisella reaktiolla ilman sivutuotteiden muodostumista. On olemassa lukuisia julkaisuja, esim. amerikkalaiset patentit 2 k87 121, 3 ^32 3^5, 3 558 355 ja 3 51^ 327 ja saksalainen patentti 1 163 307, jotka koskevat ei-entsymaattista glukoosin muuttamista fruktoosiksi, jotka kaikki kuvaavat prosesseja, joissa saatua fruktoosia seuraavat alkaaliset hajaan-tumis- ja muut tuotteet, jotka ovat seurausta puhtaasti kemiallisesta ja ei-entsymaattisesta reaktiosta. Tästä johtuen kaikki fruktoosin laajamittainen .55537 tuotanto on tähän saakka perustunut entsyymikatalysoltuiin reaktioon.

Kun entsymaattisessa muutosprosessissa fruktoosin määrä entsyymireaktio-väliaineessa kasvaa, fruktoosin muodostumisreaktion nopeus pienenee. Tämän vuoksi kaupallisessa glukoosin muutosprosessissa fruktoosiksi fruktoosisaanto optimoidaan tasapainottamalla fruktoosituotannon menetys pienenevää reaktionopeutta vastaan, jolloin fruktoosin määrä reaktioväliaineessa voidaan nostaa. Kaupallisesti

; - .··. --r v-t-J

toimiva prosessi voidaan optimoida tuottamaan siirappia, jossa tyypillisesti 1+0 % glukoosista on muuttunut fruktoosiksi. Useimmissa kemiallisissa ei-entsy-maattisissa glukoosin muutoksissa fruktoosiksi läsnäolevan fruktoosin määrä laskee saavutettuaan maksimin.

On selvästi edullista lisätä reaktion aikana sen glukoosin määrää, joka voidaan taloudellisesti muuttaa fruktoosiksi.

Tämä voidaan toteuttaa poistamalla fruktoosi tehokkaasti reaktioväli-aineesta sisällyttämällä väliaineeseen reagenssia, joka muodostaa fruktoosin kanssa vahvemman kompleksin kuin glukoosin kanssa, vaikka kompleksointiaineella voi olla lisäominaisuuksia, jotka suurentavat tai pienentävät reaktionopeutta. Reagensseja, joita on ehdotettu tähän tarkoitukseen, ovat boraattiyhdisteet -kts. Y. Takasaki, Agr. Biol. Chem. 1971» 35 (9)» 1371“5 ja US-patentti 3 689 362 (entsyymireaktio) ja J.F. Mendicino, J.Am.Chem.Soc. 82, I960, 1+975 (kemiallinen reaktio). Myös areeniboraatteja (areenilla substituoituja boorihappojohdannaisia) ovat ehdottaneet S.A. Barker, P.J. Somers ja B.W.Hatt englantilaisessa patentissa 1 369 185 sekä kemiallisille että entsyymireaktioille. Areeniboraatit ovat myrkyllisiä ja voivat muodostaa vaaran terveydelle tuotteessa, joka on tarkoitettu käytettäväksi makeutusaineena ihmisen käyttöön tulevissa ravintoaineissa; lisäksi esimerkiksi bentseeniboraatilla on haittana rajoitettu liukoisuus: se ei voi muodostaa komplekseja, joissa sokeri/boraattisuhde on 2:1, eikä tuotteeseen voida saavuttaa suuria fruktoosiväkevyyksiä suurilla sokeriväkevyyksillä (S.A. Barker, B.W. Hatt ja P.J. Somers, Carbohydrates Res., 26 (1973) 1+1-53). Näin ollen nämä kompleksointireaktiot eivät sovellu helposti käytettäväksi kaupallisesti toimivissa muutosprosesseissa. Kaupallisen prosessin kehittämiseksi, jossa fruktoosin määrä tuotetussa siirapissa olisi kasvanut, on välttämätöntä löytää kompleksointireagenssi, jolla ei ole tällaisia sen käyttöön liittyviä haittoja.

Konversion aikana voi läsnä olla entsyymikatalyytti, jolloin tämä tekee mahdolliseksi lievempien reaktio-olosuhteiden käytön. Entsyymi voi olla läsnä liuoksessa tai liikkumattomassa muodossa kiinteällä matriisilla, joka voi olla elävä solu, inaktivoitu solu tai jokin muu sopiva tukiaine. Entsyymi voi myös olla liukoisessa muodossa.

3 56537

Kompleksointireagenssi voidaan syöttää muutosprosessiin millä taliansa sopivalla tavalla, esim. aldoosi-oksianionikompleksina tai glukoosioksianionikomp- leksin johdannaisena tai suolana tai yhdisteenä, kuten oksidina, joka muodostaa oksianioneja muutosprosessin olosuhteissa.

Lindberg'in ja Swan'in artikkelista Acta Chem.Scand., 1U (i960), 101+3-50 tiedetään, että elektroforeesilla erotettuna pH-arvolla 10,7 fruktoosigermanaat- tikompleksit ovat hyvin erilaisia kuin glukoosigermanaattikompleksit ja ensinmai- nituilla on yli kaksinkertainen liikkuvuus viimemainittuihin verrattuna l+0°C:ssa.

V.A. Nazarenko ja G.V. Flyantikova (Zh. Neorgan Khin., 8, (19^3) 2271, 1370)

esittävät ionisointivakiot glukoosille ja fruktoosille germanaatilla arvoina _6 -U

8,3 x 10 ja 1,0h x 10 vastaavassa järjestyksessä. Edelleen he esittävät ha- _2 joamisvakiot glukoosille ja fruktoosille germanaatin arvoilla 3,5^ x 10 ja 1+,21+ x 10_5.

On yllättävää, että germanaatti-ionit ovat hyödyllisiä reagens-seina glukoosin muuttamisessa fruktoosiksi seuraavista syistä: 1. On osoitettu, että germanaatti esiintyy monogermanaatti/pentagermanaatti/ heptagermanaatti-tasapainossa, joka siirtyy oikealle lisättäessä germaniumväke-vyyttä ja vasemmalle nostettaessa pH yli arvon 9 (D.A. Everest ja J.C. Harrison, J.Chem. Soc. 1959, s. 2178-2182). Taloudellisen prosessin kannalta on suositeltavaa käyttää minimipainomäärää germaniumyhdisteitä maksimimuutosnopeuden saavuttamiseksi sekä välttää alkaalisten hajaantumissivutuotteiden muodostumista.

2. Germaniumdioksidilla ja natriumgermanaatilla on hyvin rajoitettu liukoisuus veteen - kts. P.J. Antikainen (Suomen Kemistilehti, 33 B (i960) 38—^0). Gulzian ja Muller, J.Amer.Chem.Soc. 1932, 5^, 311+2 mainitsevat GeO^rn liukoisuudeksi 31-33 mM veteen. D.A.Everest ja J.C. Harrison, J.Chem.Soc. 1959, 2178 mainitsevat natriumgermanaatin liukoisuudeksi 870 mM veteen.

3. Magnesiumioneja on yleensä läsnä reaktioväliaineissa, joita käytetään ent-symaattisissa glukoosin muutoksissa fruktoosiksi. Magnesiumortogermanaatti (Mg GeO^) on erittäin liukenematon veteen ja sitä käytetään germaniumin analyyttiseen määrittämiseen - kts. J.H. Muller, J.Amer.Chem.Soc. 1923, s. 21*93-21+98.

Alla esitetyissä olosuhteissa se ei saostunut liuoksesta.

1*. Glukoosi-isomeraasilla on eteerinen vaatimus oi-D-glukoosin suhteen (K.J.

Schray ja I.A. Rose, Biochemistry 10 (1971) 1058-1062) ja glukoosigermanaatti-kompleksi, jonka tiedetään muodostuviin, saattaisi häiritä entsyymireaktiota inhiboimalla sen osittain tai kokonaan. On totta, että «k-D-glukoosin 1,2-cis-glykoli sopii kompleksoitavaksi germanaatin kanssa paremmin kuin o(.-D-glukoosi.

56537

Mitä tahansa glukoosi-isomeraasientsyymiä voidaan käyttää muutoksessa, mutta nämä entsyymit vaihtelevat mitä tulee niiden optimi-pH-arvoon ja -lämpötilaan. Sopivia isomeraaseja ovat ne, jotka saadaan lajien Aerobacter, Pseudomonas, Lactobacillus (B. Yamanaka, Agr. Biol. Chem., 27, 1963, 265-270), Streptonyces, Curto-bacterium (ks. englantilainen patentti n:o 1 1*51 273) tai erityisesti Arthrobacter (englantilainen patentti n:o 1 328 970) bakteereista. Lajien Thermoactinomyces, Thermopolyspora, Thermomonospora ja Pseudonocardia termofiilisistä mikro-organismeista saadut glukoosi-isomeraasit ovat myös sopivia. Jotkut yllä mainituista glukoosi-isomeraaseista vaativat koboltti-ioneja saavuttaakseen optimiaktiivisuutensa.

Glukoosin isomerointi fruktoosiksi voidaan suorittaa jatkuvasti johtamalla glukoosia sisältävää liuosta kolonnin läpi, joka sisältää liikkumatonta entsyymi-tai muuta katalyyttiä. Entsyymi on mieluummin saatettu liikkumattomaksi sisällyttämällä se höytälöityihin kokonaisiin mikrobisoluihin tavalla, joka on kuvattu englantilaisessa patentissa 1 368 650. Germanaattikompleksointireagenssi voi olla läsnä liuoksessa, joka johdetaan kolonniin tai kolonnissa olevan liikkumattoman entsyymi- tai muun katalyytin yhteydessä. Viimeksi mainitussa tapauksessa kolonni voi olla täytetty liikkumattomalla entsyymikata-lyytillä, johon on sekoitettu reagenssia ja dispergoitu homogeenisesti koko kolonniin, tai vaihtoehtoisesti kolonni voi sisältää vuorotellen liikkumattoman ent-syymikatalyytin ja reagenssin kerroksia erotettuna toisistaan seuloilla tai ristikoilla. Kun reagenssia on läsnä kolonnissa, se on liukenemattomassa muodossa, esimerkiksi geelin muodossa, zeoliittina tai epäorgaanisena tai orgaanisena polymeeri johdannaisena.

Glukoosin isomeroinnin jälkeen fruktoosi voidaan erottaa kompleksointi-reagenssia sisältävästä seoksesta ja poistaa prosessista joko yksin tai seoksena glukoosin kanssa, siis fruktoosina, glukoosi/fruktoosi-siirappina tai sekä fruktoosi- että glukoosi/fruktoosi-siirappina. Kompleksointireagenssi pelkästään, tai yhdessä glukoosin tai yhdessä glukoosin ja kompleksoidun glukoosin kanssa, voidaan kierrättää takaisin. Erottaminen ja takaisinkierrätys voidaan suorittaa millä tahansa sopivalla menetelmällä. Erityisen sopivia menetelmiä ovat seuraavat: 56537 a) Glukoosi/fruktoosi-isomeroinnin reaktioseos johdetaan kolonnin läpi, joka sisältää kationinvaihtohartsia, jossa on jaksollisen järjestelmän ryhmästä II valitun metallin muodostamia kationisia vastaioneja ja vetyioneja. Tämä jakaa reaktioseoksen fruktoosiksi, joka poistetaan prosessin lopputuotteena ja glukoosiksi ynnä kompleksointireagenssiksi, joka palautetaan takaisin. Ryhmän II metalli-ionit ovat mieluummin kalsiumioneja.

b) Glukoosi/fruktoosi-isomeroinnin reaktioseos johdetaan ensin kolonnin läpi, joka sisältää kationinvaihtohartsia, jossa on jaksollisen järjestelmän ryhmien I tai II metallin kationiset vastaionit, mieluummin natriumionit. Tämä jakaa reaktioseoksen kahteen osaan, nimittäin (i) glukoosia ja fruktoosia sisältäväksi siirapiksi ja (ii) fruktoosiksi ynnä kompleksointireagenssiksi. Osa (i) poistetaan kun taas osa (ii) johdetaan kohdassa (a) yllä kuvatun kolonnin läpi fruktoosin erottamiseksi kompleksointlaineesta, joka viimeksimainittu palautetaan takaisin.

Molemmissa tapauksissa a) ja b) hartsina on mieluummin sulfonoitu poly-styreenikationinvaihtohartsi, joka sisältää silloitusainetta.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita menetelmiä, kuten fruktoosia sisältävän kompleksin hajottamista käyttäen "Borasorb"-valmistetta (rekisteröity tavaramerkki), jota myy Calbiochem Ltd, Kalifornia, USA; tämä on polymeeri, joka sisältää cis-hydroksyyliryhmiä, jotka ovat liittyneet tertiäärisen N-atomin välityksellä polystyreenidivinyylibentseeniverkkoon ja jota normaalisti myydään bo-raatin absorboimiseen. Jos reaktio suoritetaan kompleksointireagenssin ollessa liuoksessa reaktioväliaineessa, tämä reagenssi voidaan myös palauttaa takaisin.

Näin ollen "Borasorb"-valmisteelle absorboitu germanaatti voidaan eluoida alkaa-lilla tai hapolla. Kaikki nämä toimenpiteet voidaan välttää, jos kompleksointi-reagenssia (esim. germanaattia) käytetään liikkumattomassa muodossa.

Glukoosin isomerointi on suositeltavaa suorittaa jatkuvasti käyttäen kolonnia, jossa on flokkuloituja kokonaisia soluja. Kun entsyymi on läsnä kolonniin tulevassa reaktioväliaineessa, se on mieluummin läsnä väkevyyksinä välillä 200-800 mM ja erityisesti 500-600 millimol/l. Kolonniin tuleva reaktioväliaine sisältää mieluummin 30-50 paino-# glukoosia vesiliuoksessa ja reaktio suoritetaan siten, että fruktoosin väkevyys kolonnista poistuvassa väliaineessa on välillä i+0—85 %t erityisesti välillä 75~80 %. Reaktioväliaineen pH on mieluummin välillä 6-10 optimiaktiivisuuden esiintyessä pH-alueella 8 ja erityisesti pH-arvolla 7,8, edellä olevien arvojen koskiessa Arthrobacter-organismeistä saatavaa entsyymiä. Toimintalämpötila on mieluummin välillä 50-100°C, erityisesti välillä 1+5_80°C. Eluaatin pH on yleensä alempi kuin syötön, koska tuotteena oleva fruktoosi muodostaa kompleksin oksianionin kanssa.

6 56537

Glukoosin ja eri germanaatti-ionilajien lisäksi reaktioväliaine sisältää . . 2+ .

sopivasti seuraavia aineosia, jotka ovat läsnä seuraavissa suhteissa: Mg -ioneja n. h millimol/l väkevyyksiä yhdessä yhtä suuren Vloridi-ioniväkevyyden kanssa ja NaOH:a pH-arvon säätöön.

Germanaatti-ionien käytöllä kompleksointireagenssina on etuna aikaisemmin ehdotettuihin boraattiyhdisteisiin verrattuna, että germanaatti-ionit muodostavat vahvoja komplekseja fruktoosin kanssa ja ovat selektiivisemniä kuin boraatti ste-reokemiallisesti sokerien kompleksoinnissa. Boraattiyhdisteiden käyttöön liittyvät myrkyllisyysongelmat vältetään. Päinvastoin kuin areeniboorihapot (boorin areenil-la substituoidut oksihapot) germanaatti voi muodostaa 1:2 germanaatti-fruktoosi-kelaatin säästäen täten kampleksointiaineen käytössä.

Entsyymin normaali optimi-pH ei ehkä ole optimi-pH yhdistetylle entsyymi-kompleksointireagenssiprosessille. Näin ollen mikä tahansa toimenpide entsyymin opt imi-pH-arvon alentamiseksi, esim. glukoosi-isomeraasilla pH-arvosta 8,5 arvoon 7, on edullinen pienentäessään entsyymiprosessin aikana muodostuneen värin poisto-kustannuksia. Germannatin lisäys parantaa merkittävästi alkuperäistä glukoosin muutosreaktionopeutta fruktoosiksi niin, että taloudelliset muutokset ovat saavutettavissa lyhyemmillä viipymisajoilla, eikä germanaatti aiheuta mitään destabiloi-vaa vaikutusta Arthrobacter-glukoosin-isomeraasille tutkitussa ajassa edellyttäen, että fruktoosin muodostukseen germanaatin läsnäollessa liittyvä pH-arvon lasku paranee.

Piirrosten kuvio 2 esittää prosentuaalista optisen kiertosuunnan muutosta kompleksinmuodostuksen seurauksena pH-arvon funktiona germanaatin ja glukoosin, fruktoosin ja mannoosin muodostamille komplekseille. Kuten voidaan nähdä fruktoo-sikompleksi muodostuu alemmalla pH-arvolla kuin glukoosin ja mannoosin kompleksit.

Keksintöä kuvataan seurRavilla, esimerkeillä:

Esimerkki 1

Glukoosin entsymaattinen muutos fruktoosiksi

Sarja glukoosin vesiliuoksia, jotka sisältävät eri väkevyyksiä glukoosia yhdessä magnesiumionien ja germanaatti-ionien kanssa, johdettiin kolonnin läpi, jonka pituus oli 32 cm ja sisähalkaisija 0,1+ cm ja joka oli täytetty flokkuloi-duilla kokonaisilla soluilla; tämä glukoosi-isomeraasi valmistettiin Arthobacter-suvun soluista US-patenteissa 3 61+5 81+8 ja 3 821 086 kuvatulla tavalla; sitä käytettiin flokkuloitujen, kokonaisten solujen muodossa. Solut flokkuloitiin poly-elektrolyysin avulla siten kuin US-patentissa 3 821 086 on selitetty. Vastaavia liuoksia, jotka i 7 56537 eivät sisältäneet lainkaan germanaattia, johdettiin myös kolonnin läpi vertailu-tarkoituksessa. Glukoosin muutosprosentti fruktoosiksi kolonnista tulevassa elu-aatissa mitattiin Autoanalyser-laitteella käyttäen resorsinolimenetelmää. Reaktiot suoritettiin alku-pH-arvolla 8,5 ja 60°C:n lämpötilassa glukoosin vesiliuosten sisältäessä 0,00l+ M:n väkevyyden magnesiumkloridia.

Alle 100 millimol/1 germanaatti-ioneja sisältäviä liuoksia lisättiin aina kolonniin tuleviin glukoosiliuoksiin ennen magnesiumkloridia, sillä liuoksissa muodostuva glukoosi-germanaattikompleksi ei saosta magnesiumia. Germanaatti-ioneja sisältävät liuokset valmistettiin suspendoimalla germaniumdioksidia veteen, lisäämällä väkevää alkaliliuosta pH-arvon 10,5 saavuttamiseen saakka ja lisäämällä sen-jälkeen glukoosiliuosta, jota seurasi magnesiumkloridi. Säädettäessä pH lopuksi arvoon 8,5 liuokset tulivat kirkkaiksi.

200 millimol/1 tai enemmän germanaattia sisältäviä alustaliuoksia varten germaniumdioksidia lisättiin 1-m glukoosiliuokseen niin, että lisättäessä alkalia keskeytyksin pH-arvoon 8,5 germanaatti meni hitaasti liuokseen. Saatiin lievästi samea liuos magnesiumkloridilisäyksen jälkeen, mutta kolonnista tuleva eluaatti oli täysin kirkas.

Tulokset esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1

Glukoosin Germanaatti- Glukoosin muutos-?? Eluaatin pH Virtausnopeus väkevyys ioniväkevyys fruktoosiksi (ml/min) (mM) (mM) 0,528 0 59 - 0,12 0,528 25 75 - 0,12 M5 0 57 8,3 0,10 *+,58 25 82 8,1 0,10 122 0 U7,5 · 7,0 0,11 118 25 80,5 6,8 0,11 337 0 1+1+,5 6,8 0,11 270 25 63 6,7 0,11 259 0 l+6+ 6,5 0,11 265 25 53 6,3 0,11 300 50 52 6,0 0,11 281+ 100 59,5 . 6,1+ 0,11 275 200 72,5 * 7,2 0,11 __ 55,5 % tasapainossa 82 % tasapainossa (loppu-pH 6,5) V · 8 56537

Kuten taulukosta 1 voidaan nähdä isomerointiseoksen fruktoosiväkevyys kasvoi germanaatti-ionien läsnäollessa.

Esimerkki 2

Glukoosin entsymaattinen muutos fruktoosiksi

Esimerkin 1 menettely toistettiin käyttäen mitoiltaan samanlaista (so. pituus 30 cm ja sisähalkaisija 0,1+ cm) kolonnia suurempien glukoosiväkevyyksien vaikutuksen tutkimiseksi. Tässä tapauksessa virtausnopeus alennettiin arvoon 0,03 ml/min 125 minuutin maksimiviipymisajan aikaansaamiseksi tasapainon saavuttamiseksi usean tunnin aikana ja tasapainoarvo tälle olosuhteiden sarjalle merkittiin muistiin. Glukoosiväkevyys analysoitiin aina senjälkeen, kun seos oli valmistettu alkalimetalli/magnesiumsuoloilla tapahtuvan laimennuksen korjaamiseksi.

Tulokset esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2

Glukoosiväkevyys Germanaatti-ioniväkevyys Fruktoosi-# Muutos-# alussa (paino/til. #) (millimol/l) (paino/til.)

1+7,1+ 0 25,6 5M

1*5,6 361* 32,0 70,0 1*3,7 52k 35,0 80,0 1+3,5 696 36,5 81+,0 50,0 800 39,T 79,1+

Kuten tuloksista voidaan nähdä, germanaatti-ionien läsnäolo lisäsi suuresti fruktoosikonversiota.

Fruktoosi analysoitiin Chaplin-Kennedy-menetelmällä (Carbohydrate Res.

1975, 1+0, 227-33). Tämä menetelmä pyrkii antamaan suuremmat tulokset kuin resor-sinolimenetelmä, jota käytettiin kaikissa seuraavissa esimerkeissä fruktoosille.

Lisäkokeessa, jossa analyysit suoritettiin resorsinolimenetelmällä (Carbohydrate Res. 26, (1975) 1+1), käyttäen samankokoista kolonnia 60°C:ssa ja pH-ar-volla 8,5 saatiin seuraavat tulokset käyttäen eri virtausnopeuksia kolonnissa:

Virtausnopeus Fruktoosin konversio (#) (ml/min) syötöt kolonniin (joihin lisätty 1+ millimol/l

MgCl ) 51,2c% (paino/til.) 1+7,8 % (paino/til.) glukoosia glukoosia sekä 800 millimol/l germanaattia 0,015 53 7I+ 0,030 1+2,5 69 0,050 36 50 9 56537

Glukoosin alkuväkevyydestä ί+3,5 % saatu tuote taulukossa 2 yllä fraktioitiin Joel Ltd:n anioninvaihtohartsilla (valmistaja Joel (UK) Ltd., Lontoo, Englanti), joka oli boraattimuodossa, käyttäen gradienttieluointia boraattipus-kureilla (0,13_m boraattia/pH 7 —^ 0,35~m boraattia/pH 9,8) glukoosin ja fruktoosin välisen erottumisen aikaansaamiseksi tuotteessa. Sama erottaminen suoritettiin myös germanaatin poiston jälkeen "Borasorb"-kolonnissa (rekisteröity tavaramerkki, kts. sivu 7)· Fruktoosin suhde glukoosiin oli 3,31:1 ilman germanaatin esipoistoa. Fruktoosi ja glukoosi analysoitiin käyttäen kysteiinirikkihappo-menetelmää.

Esimerkki 3

Glukoosin muutos fruktoosiksi käyttäen liukoista glukoosi-isomeraasia Alkureaktionopeuksia tutkittiin 60°C:ssa pH-arvolla 8,5 ja käyttäen glukoosi-isomeraasia liukoisessa muodossa (200 jul) alusta-aineen D-glukoosin väkevyyden (0-5 mi lii mol/1) ja MgCl^n (k millimol/l ja CoCl^in (0,5 millimol/l) väkevyyksien ollessa vakioita sarjassa liuoksia (25 ml), jotka sisälsivät eri-määriä germanaattia. Liuokset analysoitiin automatisoidulla resorsinolimenetel-mällä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 3:

Taulukko 3

Germanaatti- Fruktoosi- Konversio (%) pitoisuus pitoisuus (21 h kuluttua) (mmol/l) (mmol/l) 0,0 6,25 1+3 0,5 8,75 51 25 15,0 62

Esimerkki 1+

Glukoosin entsymaattinen isomerointi fruktoosiksi -reaktioajan ja/tai lämpötilan vaikutus konversioon

Syöttöliuosta, joka sisälsi 1+1,2 % glukoosia, 600 mM germanaattia ja 1+ mM magnesiumkloridia alku-pH-arvolla 7,0, johdettiin jatkuvasti samanlaisen entsyymi-kolonnin läpi kuin esimerkissä 1. Loppu-pH ja fruktoosikonversio mitattiin eri ajanjaksojen jälkeen. Koe jaettiin kolmeen jaksoon.

Ensimmäisen 1+3 tunnin jakson jälkeen syöttöliuos kirkastettiin sintteri-suodatuksella lievän sakan poistamiseksi, joka pyrkii muodostumaan glukoosi/germa-naattiliuoksiin pitkähköjen aikojen kuluttua. Tämä johti aktiivisuuden kasvuun, joka oli laskenut lievästi. Toisen jakson kuluttua, joka kesti 1+3 tunnista 102 tuntiin, syötön pH nostettiin arvoon 7,8 edullisin tuloksin. Eluaatin pH pyrkii laskemaan merkittävästi kuljettuaan pitkään kolonnin läpi. Osoittautuu, että yli 70-$ konversio voidaan ylläpitää pitkän aikaa, jos kolonnin eluaatin pH-arvon ei anneta lasketa huomattavasti alle 7,0. Tulokset esitetään taulukossa 1+A.

Taulukko kA

10 56637

Aika Alku-pH Loppu-pH Fruktoosi-konversio (SS) 2 h 7,0 6,6 67,2 17 h 7,0 5,6 61,5 h3 h 7,0 5,5 60,8x 5k h 7,0 5,8 6k,9 102 h 7,0 5,7 65,5xx 126 h 7,8 6,9 76,5 150 h 7,8 6,9 78,3 17*» h 7,8 6,9 76,5 198 h 7,8 6,8 71,6 ensimmäisen jakson loppu - syöttöliuos kirkastettiin tämän jälkeen toisen jakson loppu - alku-pH nostettiin tämän jälkeen.

Eri lämpötilojen vaikutus reaktion stabiilisuuteen mitattiin käyttäen samaa entsyymikolonnia kuin yllä käytettiin. Tulokset esitetään taulukoissa Ub ja kC. Reaktio-olosuhteet annetaan taulukoiden otsikoissa. Taulukossa kB muutos on se, joka saavutetaan tasapainossa, kun taas taulukossa ke muutos on se, joka saadaan alussa. Sekä taulukossa kB että ke tulokset osoittavat kumulatiivisen vaikutuksen.

Taulukko k-B

kk % (paino/til.) glukoosia + k millimol/l MgCl + 600 millimol/1 germa- naattia pH 7,1 ja virtanopeus 0,05 ml/min.

Lämpötila Fruktoosikonversio {%) oc (entsyymi pesty 2 vrk aikaisemmin) 55 69,2 60 73,k 65 75,1 70 71,5 75 72,1 80 75,0 85 60,5

Taulukko Uc 11 S 6 S 3 7 1+1* % (paino/til.) glukoosia + U millimol/1 MgCl,, + 600 millimol/1 eerma-naattia pH 7,1 .ia virtausnopeus 0,l6 ml/min Lämpötila Fruktoosikonversio {%) Aika kolonnin läpi ko. Kumulatiivinen o^ (entsyymi pesty lU vrk lämpötilassa (h) aika, jona liuos aikaisemmin) on kulkenut kolonnin läpi (h) 55 22,7 1 1/2 1 1/2 60 30,1 1 1/2 3 65 31,8 1 1/2 1+ 1/2 70 U,1 1 1/2 6 75 35,8 2 1/2 8 1/2 80 32,1 2 10 1/2 85 25,6 1 1/2 12

Esimerkki 5

Glukoosin entsymaattinen isomerointi fruktoosiksi-pH-arvon ja germanaatti- määrien vaikutus a) Suoritettiin kaksi koesarjaa käyttäen glukoosi-isomeraasikolonnia (pituus 31 cm - halkaisija 1 cm), joka oli samanlainen kuin edellisissä esimerkeissä käytetty. Kummassakin sarjassa verrattiin tuloksia, jotka saatiin käyttäen syöttöliuoksia, jotka sisälsivät glukoosia ja 1 millimol/1 MgClg sekä 600 millimol/1 germanaattia ja ilman sitä. Virtausnopeus kolonnin läpi oli 0,05 ml/min. ja entsyymin lämpötila oli 60°C. Syöttöliuosten alku-pH-arvoa vaihdeltiin eri kokeiden välillä kummassakin sarjassa ja eluaatin loppu-pH mitattiin. Tulokset on esitetty taulukossa 5A.

Taulukko 5A

56537

Sarja Syötön Analyysi- Glukoosin Germanaatti- Fruktoosi- Eluaatin alku-pH järjestys alkuväk. väkevyys konversio loppu-pH

% (paino/til) millimol/l (%) 17 3 1+8 0 1+8,2 - 1 6,9 8 1+7 0 2+9,6 7,2 1 8,5 1 1+9,2 0 1+9,2 1 8,5 2 1+9,3 0 1+9,2 1 7 5 1+0,2 600 76,5 7,0 1 7 6 1+0,0 600 70,3 6,9 1 8,5 1+ 38,2 600 71+,6 7,2 1 8,3 7 1+0,0 600 72,5 6,6 1 8,3 9 73,0 600 71,2 7,0 2 7,0 2 1+2,0 0 5l+,0 6,8 2 8,1+ 1 1+1,6 0 1+9,3 7,1 2 8,5 1+ 1+1+,6 0 51+,9 7,0 2 7,1 5 53,1+ 600 67,1+ 6,8 2 8,6 3 50,0 600 66,7 6,8 b) Suoritettiin kaksi koesarjaa käyttäen samanlaista glukoosi-isomeraasi-kolonnia kuin edellisissä esimerkeissä käytettiin. Syöttöliuokset sisälsivät 50 % (paino/til.) glukoosia, 1+ millimol/l MgCl^ia ja 200 vast. 600 millimol/l germanaattia eri sarjoissa. Kokeet suoritettiin useilla eri pH-arvoilla. Vertailu-koesarja suoritettiin käyttäen liuoksia, jotka eivät sisältäneet lainkaan germanaattia. Kaikissa kokeissa liuoksia pumpattiin liikkumattoman entsyymikolonnin läpi virtausnopeudella 0,05 ml/min. (75 minuutin nimellisellä viipymisajalla). Tulokset on esitetty taulukossa 5B.

Taulukko 5B

Eluaatin koostumus fruktoosipitoisuus-% pH Ei germanaattia 200 millimol/l 600 millimol/l germa- germanaattia naattia 9.0 51 68 8.5 51 61+ 69 8.0 2+9 59 70 7.5 50 60 70 7.0 50 60 70 6.5 39 59 69 6.0 58 13 56537

Esimerkki 6

Glukoosin entsymaattinen muutos fruktoosiksi - palautuvuus

Valmistettiin glukoosi- ja fruktoosiliuokset, joilla oli taulukossa 6 esitetyt hiilihydraattipitoisuudet. Ne liuokset, joiden oli määrä sisältää germanaattia, valmistettiin liuottamalla punnitut määrät GeO^ra näiden liuosten jakeisiin sekoittamalla mukaan pieniä määriä 50-% NaOH-liuosta. MgCl^-liuoksen jakeita lisättiin kaikkiin näihin liuoksiin h millimol/1 lopnuväkevyyteen ja kaikkien liuosten pH säädettiin arvoon 8,5 25°C:ssa.

Liuoksia pumpattiin sitten esitetyillä virtausnopeuksilla entsyymikolonnin (30 x 0,1+ cm) läpi 60°C:ssa. Käytetty entsyymi oli Arthobacter-glukoosi-isomeraa-sia, joka oli valmistettu siten kuin GB-patentissa 1 328 970 on selitetty, viljelemällä Arthobacter-mikro-organismia hiilihydraattia sisältävässä väliaineessa. Fruktoosin määrää kolonnin eluaatissa tarkkailtiin laimennuksen jälkeen. Kalibrointia varten valmistettiin 0,55 (paino/til.) siirapit ja johdettiin koko analyyttisen systeemin läpi. Glukoosin alkuperäisen määrän tarkistamiseksi syöttösiira-peissa näytteet ja kalibrointistandardisiirapit laimennettiin (2 x 10^) ja analysoitiin kysteiini/rikkihappomenetelmällä. Tulokset on esitetty taulukossa 6 ja kuvattu graafisesti kuviossa 1, joka osoittaa selvästi, että kun germanaattia ei ole lainkaan läsnä, tasapainoasema on välillä 52-53 % fruktoosia, aloitetaanpa glukoosi- vaiko fruktoosisyöttösiirapeilla, ja on välillä 7^~79 %, kun läsnä on 600 millimol/1 germanaattia.

Taulukko 6

Virtaus- Syötön hiili- Hiili- Nimellinen Eluaatin koost. Syötön nopeus hydraattikoostu- hydraatti- viipymisaika Ei ger- 6θΟ mil- tyyppi mus % (paino/til.)·, koostumus manaat- limol/1 ilman germanaatt. % (paino/til.) tia germa- germanaatin naat.

läsnäollessa 0,1 51+,6 50,5 38 22,5 31,0 Glukoosi 0,05 51,2 1+7,8 75 36,0 1+9,5 0,03 51,2 1+7,8 125 1+2,5 68,5

0,015 51,2 1+7,8 251 53,0 7M

0,1 55,0 1+8,2 38 71,0 79,0 Fruktoosi 0,05 55,0 1+8,2 75 55,5 77,5 0,03 55,0 1+8,2 125 53,5 77,0 0,015 55,0 1+8,2 251 52,0 77,0

Ik 66537

Esimerkki 7

Glukoosin entsymaattinen muutos fruktoosiksi - konsent^aat.ion vaikutus Sarja liuoksia, jotka sisälsivät 600 millimol/1 germanaattia ja k milli-mol/l MgC^ia, ja joissa oli vaihtelevat väkevyydet glukoosia, johdettiin samanlaisen glukoosi-isomeraasikolonnin läpi kuin edellisissä esimerkeissä on käytetty, 60°C:n lämpötilassa. Tulokset on esitetty taulukossa 7·

Taulukko 7

Glukoosin väkevyys Fruktoosikonversio Loppu pH

syötössä % (paino/til. ) 20,6 92,7 7,8 30.0 80,0 7,8 k0,0 72,5 7,5 53,k 67,^ 6,8* 60.0 65,0 7,5 * Aikaisemmasta kokeesta.