CS226164B2

CS226164B2 - Method of converting aldose or monophosphate thereof to ketose or monophosphate thereof

Info

Publication number: CS226164B2
Application number: CS764010A
Authority: CS
Inventors: Sidney A Barker; Peter J Somers; Robin R Woodbury; Geoffrey H Stafford
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1975-06-17
Filing date: 1976-06-17
Publication date: 1984-03-19
Also published as: DK271676A; IE43011L; LU75174A1; GB1497888A; MX3549E; FI761757A; JPS525706A; YU148876A; JPS6125038B2; PL101098B1; PT65240B; FR2316246A1; FR2316246B1; CH621354A5; US4069104A; DE2627111A1; FI56537B; CA1067437A; IT1061088B; NO142527C

Description

Vynález se týká způsobu přeměny aldózy nebo aldózových derivátů na ketózu nebo ketózové deriváty v přítomnosti kyslíkatého aniontu, a to zejména přeměny glukózy na fruktózu. mannózy na fruktózu, glukózo-6-fosfátu na fruktóza-6-fosfát, maltózy na maltulózu, galaktóry na tagatózu a latózy na laktulózu a ostatních analogických reakcí, jako je přeměna xylózy na xylulózu. Způsob může být prováděn v přítomnosti nebo nepřítomnosti enzymů katalyzujících přeměnu.

Provádí-li se přeměna glukózy na fruktózu v přítomnosti enzymu, glukózo!somerázy, dosáhne se velmi často rovnováhy, když 50 až 55 % glukózy v reakčním médiu se přemění na fruktózu. Dosud nebylo možné přeměnit glukózu na fruktózu neenzymatickou reakcí bez vedlejších produktů. Existují četné publikace, například USA patenty č. 2 487 121, 3 432 345, 3 558 355 a 3 514 327 a NSR patent č. 1 163 307, týkající se neenzymatické přeměny glukózy na fruktózu, přičemž všechny popisují způsoby, kde fruktóza je provázena alkalickou degradací vznikajícími produkty a jinými nečistotami vznikajícími při čisté chemické a neenzymatické reakci.

Proto až do nynějška jakákoli velkovýroba fruktózy byla založena na enzymaticky katalyzované reakci.

Při enzymatickém procesu přeměny tak,jak vzrůstá podíl fruktózy v enzymatickém reakčním prostředí, klesá rychlost, kterou je fruktóza produkována. Proto v komerčních způsobech pro přeměnu glukózy na fruktózu je fruktózový výtěžek optimalizován vyrovnáním ztráty v reakčním poměru, přičemž podíl fruktózy v reakčním médiu přibývá. Komerčně řízené způsoby mohou být optimalizovány tak, že vzniká sirup, ve kterém obvykle 40 % glukózy bylo přeměněno na fruktózu. Při většině neenzymatických přeměn glukózy na fruktózu množství přítomné fruktózy po dosažení maxima klesá.

Zřejmě je výhodné zvyšovat podíl glukózy, který může být ekonomicky přeměněn v průběhu reakce na fruktózu.

Toho se může dosáhnout úěimým odstraněním fruktózy z reakčního média vmíšením činidla, které vytváří silnější komplex s fruktózou než s glukózou, ačkoli kompPexační činidlo může mít. přídatné vlastnosti, které zvyšují nebo snižují rychlost reakce. Činidly, jež byla navržena k tomuto účelu, jsou borětové sloučeniny, viz Y· Takasagi: Agr. Biol. Chem. 1971, 35/9 1 371 a 1 375 a USA patent č. 3 689 362 (enzymeaické reakce) a J. F. Meendcino, J. Amer. Chem. Soc. 82, 1960, 4. 975 (chemické reakce).

Také byly navrženy boráty S. A. Barkerem, P. J. Somersem a Β. N. Hattem v brisském patentu č. 1 369 185 jak pro chemické, tak pro enzymaeicSé reakce. Nevýhodami v těchto předchozích návrzích je, že v případě borátových sloučenin se jedná o sloučeniny toxické, které mohou způsobovat zdravotní riziko, je-li výrobek míněn jako sladidlo v potravinách pro spotřebu lidmi. Nadto v případě benzenboronátu má tato látka omezenou rozpustnost, nemůže vytvářet komplexy v poměru 2:1 (cukr:borát) a vysoké koncentrace fruktózy ve výtěžku nemohou být dosaženy při vysokých hladinách glukózy S. A. Baker, B. W. Haat a P. J. Somees, Carbohydrates Res, 26, (1973) 41 až 53.

Tak tyto kommPexační reakce nevedly o sobě ihned k použití-v komerčně vedených způsobech přeměny. - Aby byly vyvinuty kommrční způsoby, ve kterých je zvýšen poddl fruktózy ve vyráběném sirupu, je nezbytné nalézt kommpexační činidlo bez takových nevýhod spojených s jeho použitím. '' ·

Předmětem vynálezu je tedy způsob přeměny aldózy nebo jejího m)n^noc^8s^i^^,tu na kétózu nebo její moonocofát tak, že se připraví vodný roztok aldózy nebo jejího moonocofátu a v tomto roztoku se podrobí chemické nebo enzymmaické isomeraci při pouužtí příslušné isomerázy aldóza nebo její moonfcafát na odppoíddjící ketózu nebo její moonfcofát při pH 6 až 10a při teplotě 25 až 100 °C za přítomnooti kommpexotvorného činidla, které vytváří silnější kommlex s ketózou nebo jejím mooooosfátem než β aldózou nebo jejím mooofosfátem s následnou izolací ketózy nebo jejího eooofcsfftu,- vyznačující se tím, že kommlexotvorným Činidlem je kyslíkatý aniont nebo smíšené kommpexní kyslíkaté enionty, vznnkaaící reakcí mmzi kyslíkatý aniontem germania nebo cínu s iontem dalšího prvku ze skupiny IV nebo s prvkem ze skupiny V. nebo VI. periodického systému.

Vynález je aplikovatelný na široký rozsah přeměn a zejména na ty konverze, jež byly svrchu specifiko.ványje nejušitečněji použitelnt při přeměně glukózy na mannozu a fnukt tózu. V průběhu přeměny může být příoomen enzymmaický katalyzátor, tam, kde umooňuje použití mírněěších podmínek reakce, nebo m^jí další výhody, jako je selektivní působení použitého enzymu na pouze jediný isomer (D nebo L)..aldózy nebo aldózového derivátu. Provvddíli se enzymmaicky katalyzovaná přeměna, enzym může být příoomen v roztoku nebo v imobilizované formě na pevné mai^l^i^i, kterou může být živá buňka, - Zaktivovaná buňka nebo delší vhodná таarice. Enzym může rovněž být v roztoku. Isemerázový typ enzymu vhodný pro přeměny tohoto typu (příklady jsou vyjmenovány v tabulce A), na který je vynález aplikovatelný, může sestávat - z jednoho nebo ze série enzymů zapojených do následných reakci.

TabblkaA

Přeměna

Enzym

Odkaz

1. D-glukóza ^=í* D-tagatóza

2. L-arabinóza L-ribulóza

3. L-fukóza L-fukuloza

L-arabinoza-iscmeráza (D-gajaktóza-isbmeráza) jako v 1

L-fukózo-isomeráza (D-arabZóza-isbmeráze)

J. Biol. Chem.

^59Tož .5 106 jako v 1

J. Biol. Chem.

1958, 230. 457

Tabulka A - pokračování

Přeměna	Enzym	Odkaz
4» Lwrhemno za b-rhamulóza	L·-rhpmlhZQoisoщerázp	Methods Enzymol, WW “⁵⁸²
5. L^m^^i^i^iózp	lr-ťriikt.óza	L-mapnóóZoiaomerázf^.	Carb Řeš, 1968, g, 3 444
6. D-mannOZP ·	Dďruktóze.	D-lyyózq-isomeráza (D~nmahhszol_!af)щenáza)	J. Biol. Chem. 218 (1956) 535
7. D-glukóza	D-frukťóza	D-glukózo-isomeráza (D-yrlózo-isomeráza)	Biochem. Blolhys. Actp, (1969) 178, 376 až 379
8. D-glycero- D-sedoheptu- -В-прппо- lóza oza	jako v 6	J. Biol. Chem. 218 (1956) 535
9. D-Jykózp D-yrlulóza	jako v 6	jako v 6
10. D-xylóza	D-xyluloza	jako v 7	jako v 7
1 '. L-xylóza —	L-xylulóza	L~xcC-ózq-i s ome ráza	Fed. Proč. 19 (1960) 82
12, D-arabinoza™··	=3f D-rii>uiózp	jako v 3	jako v 3
13. D-nibózs- · -5-fosfát	_b, D-ribulózo- ’ -Sffosfát		J· Biol. Chem. 1957, 226, · 65
14. D-arabinózp- D-ribulózo- -5-fosfó.t -S-fosfát	D-tarabihóso-5“ -isomerázp	Methods Enzymol, 9. 585 až 588 П966)
15. D-glyceral- __d/hidydroxy- delhrd-l-fosfáťr* -pceton-l-fosfát		Biochem. J. 1968, 10'7, 775
16. D~galaktózo- D-tagoóózo- -6-fosfát -6-fosfát		Biochem. Biophys. Res. Comm, 1973 52, 641 až 647
17. D-glukózo·-6-fosfát ^:	D-frukt.ózo~ -ó-fosfát		J. Biol. Chem. 1973, 248. 2 219
18. D-mannózo-ó-fosfát * '	f rukt Ó ZO - -G-fosfát		J« Biol. Chern. 19618, 243. 5 410 až 5 419
19. D-glukospmin-G-fosfát	__^D-ťruktózo- - -6-SoaSát		Adv. Enzymo1, Ц, 491 (1975)

V této přihlášce pod termínem ketósa ae rozumí ketulóza, viz diskusi o nomenklatuře ketóz v Tiie Editorial Report on Nomenklatuře Journal of the Clh^mical Society P 5110 (1952).

Komplexe ční činidlo může být zavedeno do procesu přeměny jakýmkoli vhodným způsobem, tj. jako komplex aldózy a kyslíkatého aniontu nebo jako derivát kommlexu. pldózy a kyblíkatého aniontu nebo jako sůl nebo jako sloučenin s_; jako je oxid, který tvoří kyslíkaté anlonty nebo smíšené komp^pe^:^]^:í kyslíkaté anlonty za podmínek procesu přeměny. Ko.pi.eyační činidlo může být rovněž zavedeno jako kyslíkatý pniont, který byl předtím přechováván na polyolu nebo na iontoměničové pryskyřici nebo jiném nerozpustném nosiči, který tvoří ehelát ,s komplexačním Činidlem nebo obsahuje komp^Ka^i činidlo.

Vhodným způsobem se smíšený kommlexní kyslíkatý iont vytváří interakcí kyslíka^ého anio&tu s germaniem nebo cínem, s iontem dalšího prvku IV. ' skupiny nebo s prvkem, ze skupiny V. nebo VI. S výhodou tyslíkatý pnioM nebo smíšený kommlex kyslíkatého aniontu obsahuje germanium.

Zejména vhodnými komopexačníri činidly jsou gerranátové nebo po.lý-gerranátové ionty, zahrnuté například jako gerranát sodný nebo germanium dioxid e použité v roztoku jako bilizovtrné cheláty nebo . jako protiionty iontorěničových pryskyřic. Smíšené ionty jako LGeO^SO^)²]²“ [HGeO₂(PO₄)] ²” nebo ja^ko Z-ak^ét-germani-ová směs (str. 7) mohou tyt s výho^dou v některých · případech použity.

Je známo. z práce Lindberga a Swana, Acta Chem. Scand. 14 (1960), 1 043 ai 1 050, ie kdyi jsou elektroforeticky separovány při pH 10_J7_lfruktózo.-geгíanátové komrlexy se velmi liší od glukózo-gerranátsvých, a ie prvé.mají více nei dvojnásobnou . moobiitu proti druhým při 40 °C.

V. A. Nazarenko a G. · V. Fyantikova (Zh Neorgan Khim 8, · (1963) 2 271, 1 370) citují ⁱoniza^čn^{í k}onstant^y pro glu^kózu s germanátem ^8,3 x ¹⁰~° a ¹,04 x ^10-4 pro frulctozu s germanátem. Dále uvádějí konstanty nestálosti pro glukózu s germanátem 3,54 x 10^—2 a pro frukto_— 5 zu s germanátem 4,24 x 10 J

Je překvappjící, ie gerrenátové ionty mohou být užitečné jako činidla při přeměně glukózy na fruktózu z následujících důvodů;

1. Bylo dokázáno, ie germanát existuje jako monogermmátová 5=ppntagermeaiátová heptagermanátová rovnováha, která je posunuta vpravo při zvyšování germaniové koncentrace a vlevo při zvýšení pH nad pH 9 (D. Everest a J. C. Haarison, J. Chem. Soc. 1959, str. 2 178 ai 2 182). Pro ekonomické postupy je . předností minirílní hmoonost germanátové síÍsí a . rychlost přeměny a stejně tak vyhrnutí se výrobě vedlejších produktů alkalické degradace.

2. Germaniurrddoxid a germanát sodný ííPí velmi omezenou rozpustnost ve vodě, viz P. J. Anikainen (Suirnen KeenGtiiehti, 33B (1960), 38 ai 40). GgIzíio a Muller,.J. Amnr. Chem. Soc. 1932, 51, 3 142 uvádí 31 ai 33 mnri/1 pro GeO9 ve vodě. D. A. Everest a J. C. Harrison, J. Chem. Soc. 1959, 2 178 uvádí 870 mnrl/1 pro gerranát sodný.

3. Meagneiivé ionty jsou obvykle přílorné v reakčních oéédích používaných pro enzynraicksu přeměnu glukózy na fruktózu. Magnesium lrthllgeríanát (MggGeO^) je extrémně nerozpustný ve vidě a používá se při analytckkér určováni germania, viz J. H. Muler, J. .Anrr. Chem. Soc., 1923, str. 2 493 ai 2 498. Za níie citovaných podmínek neprecipituje z roztoku.

Glukózová isoreráza má sterické piiadavky pro D-glukózu (K. J. Schray a I. A. Rose, Biochemiitry 10 (1971, 1 058 ai 1 962) a gluk:ózogermanátivý komrpex, jeni, jak je známi, se vytváří a může interferovat s enzymmtickou reakcí tím, ie ji zcela nebi částečnš inhibuje. Ve skutečnosti je 1,2-cis-elykll-вfP--D-glukózy vhodivší pro vytvoření komplexu s gexmanátem nei alfa-D-glukóza.

5. Mnnóza vytváří mnohem pevn^ší komplex s germanátem nei glukóza (P. J. Annikainen, Acta Chem. Scand., 13_r /1959/, 312).

Přeměna glukózy na fruktózu může tyt uskutečněna čistě chemickou reakcí s použitím gerranátových sloučenin nebi cíoičipnnových komrlexů, které posunují pseuddiekviibria popsaná S. A. Barker, B. W. Heat a P. J. Sudím (Carb. Res. 26, /1973;/, 41 ai 53). S výhodou se však provádí jako enzyrmaticky katelyzovaná reakce v přítomnosti glukósoieomerázy. glukózoisorerázový enzym může být pouH^t při přeměně, ale tyto enzymy se liší . ci do svého optima pro pH a teplotu.

Wnodné isorerázy zalh^i^^n^;jí enzymy získané z . rodu Aerobbaker, Pseudimonas, ^с^Ьь^П^ (K. Yamrnaka, Agr. Biol. Chem. 27, 1963, 265 ai 270), Streptoryces, Curtobacteriím (jak je popsáno v britském patentu č. 1 328 970). Glukósové isomerázy z thermofilních mikroorganismů rodu Therroietinoryces, Therrogplyspora, Τιθρώοιποιιοορογρ p PseldlmolOoapdia, jak jsou popsány v japonském patentovém spisu č. 74/30 588, jsou rovněž vhodné. Nkteré ze svrchu uvedených glukózoisomeráz vyžadují ke své účinnosti kobaltové ionty.

Přeměna glukózy na fruktózu může být provedena kontinuálně průchodem roztoku s obsahem glukózy sloupcem, který obsahuje imobblizovaný enzym nebo jiný katalyzátor, S výhodou se enzym imooilizuje tak, že je obsažen ve flokulovaných celých buňkách způsobem, popsaiým v britském patentu δ. 1 368 650. Kompplxoovorné činidlo, například sloučeniny germania nebo cínu, může být příomno v roztoku, který prochází sloupcem nebo v enzymu nebo jiném katalyzátoru ve sloupci. V tomto případě je výhodné plnit sloupec materiálem, v němž je činidlo dispergováno nebo jej plnit střídavě vrstvami imoЬilizovan.ého enzymu a reakčního činidla při použití sítí nebo mřížek k oddělení těchto vrstev. Je-li reakční činidlo příoomno ve sloupci, jde o jeho nerozpustnou formu, například gel jako zeooit nebo o anorganický nebo organický derivát polymeru.

Po přeměně glukózy ve fruktózu je možno fruktózu ze smmsi obsahující kommlexotvorné činidlo izolovat jako takovou nebo spolu s glukózou. Produktem je tedy glukóza, glukózofruktázový sirup nebo fruktóza i glukózofruktózový sirup. Konmlleotvorné činidlo lze odděěit jako takové, spolu s glukózou nebo spolu s glukózou a kommlexně vázaným podílem glukózy a vrátit do počáteční fáze postupu. Oddělení je možno provést jaSýppkti vhodným způsobem, ' zejména následujícími dvěma metodami:

a) Je možno nechat počáteční produkt konverze glukózy na fruktózu procházet sloupcem s obsahem iontoměniče spolu s' ionty kovů II. skupiny periodické soustavy a s obsahem vodíku. Tím se rozdělí počáteční produkt na fruktózu, která se odvádí jako výsledný produkt a glukóza spolu s kompleχotvornýp činidlem se přivádí zpět. Kovem II. skupiny je s výhodou vápník.

b) Je možno nechat prošít počáteční produkt přeměny glukózy na fruktózu nejprve sloupcem s obsahem kationtoměniče spolu s kationty I. a II. skupiny periodické soustavy, s výhodou s obsahem sodných iontů. Tím se počáteční produkt rozdělí na dvě části, a to na

i) sirup s obsahem glukózy a fruktózy a na ii) fruktózu s komp^p.exotvoi^rý^m činidlem.

První podíl se odstraní a druhý poddl se nechá probít sloupcem stejně jako ve stupni a) k oddělení fruktózy od kommlexotvorného činidla, které se přivádí zpět.

Při provádění způsobu a) i b) je pryskyřicí s výhodou na jádře sulfonovaný polystyrénový kationtoměnič s obsahem činidla pro tvorbu příčných míůtků.

Je možno užít i jiných způsobů k oddělení fruktózy s koímpexotvorným činidlem, například rozrušení komplexu s obsahem použitím polymeru s obsahem dlouhého řetězce cis-hydrooylovýeh skupin, vázaných terciárním atomem dusíku k pslystřreněivnnyibenzenove mřížce (Borasori-CalbOochep. Ltd.). V případě, že se reakce provádí s kompPexotvornýp činidlem v roztoku v reakčním prostředí, může být toto reakční činidlo rovněž vráceno do výchozího stupně. Cc^ps^, vázaný ne B^jrasorb je možno vymýt zásadou nebo ky slinou. Všechny tyto stupně je možno vynechat v případě, že se Soo>p<^:^(^ dvorné činidlo užije v imobllizované formě.

Přeměna glukózy na fruktózu se s výhodou provádí enzřmoaicSy' s kontinuálně při pouužtí sloupce vyvločkovaných celých buněk s obsahem enzymu, jak bylo popsáno svrchu. V případě, že je reakční činidlo přítomno v maaeeiálu, přiváděném do sloupce, má konccntraci 200 až 800 mnml/i,s výhodou 500 až 600 mmml/1. Reakční prostředí, přiváděné do sloupce s výhodou obsahuje 30 až 50 hmotových % glukózy ve vodném roztoku a reakce se řídí tak, že koncentrace. fruStózř ve vytékajícím roztoku je 40 až 85 %, s výhodou 75 ež 80 %. Reakční prostředí má' pH 6 až 10 s optimem při 8,0 a zejména při 7,8. Tato hodnotě se poněkud mění podle typu enzymu, uvedené hodnoty se týkají enzymu z Arthrobacter. Teplota vhodná k provádění postupu

226164 6 se pohybuje v rozmezí 50 až 100, s výhodou 45 až 80 °C. Eluá.t má obvykle nižší pH, protože vznikající fruktóza vytváří kommPex s tyslíkotým aniontem.

Kromě glukózy a germanátových iontů může reakční prostředí ' s výhodou obsahovat ještě další slo^žky, a to zejména ionty Ms⁺⁺ v ^koncenⁿrac± ⁴ ranol/1 s chloridovými ionty v ekvivalentní koncentraci a NaOH k úpravě pH.

Pro Ρα^ί enzymatické reakce, například při použžtí f-sfoglukózli-ooerlzy, která převádí glukózzoó-fosfát na ' frak^sc-č-fosfát s nejvyššími výtěžky při teplotě 25 °C při použití germeaináu^jsou reakční podmínky velmi odlišné a je nutno je stanovit zvlášť pro každý en?ym. GlukÓ20Í8C>merázu je možno užít také pro přeměnu D-zxylózy na D-xylulózu. Tato metoda je výhodná zejména pro dosažení vyšších výtěžků xylulózy, zvláště při pouužtí germanátu.

Užžtí germanátových iontů jako kom^pl^z^c^tvorného činidla je výhodděěáí než užití borátu proto, že germiMnát tvoří peroněší kommPex s fruktózou a je selektivnější. OOppadj také obtíže, spojené s toxicitou sloučenin boru. Na rozdíl od organických sloučenin boru tvoří germroát s fruktózou chelát v poměru 1:2, takže je tento postup také levněěší.

Norrnminí optimální pH pro enzym nemusí být optimální pH i pro komplex enzymu a komppexotvorného činidla. Znamená to například, že schopnost snížit pH například glukózo!somerázy bude příznivá pro provádění tohoto postupu. To je neočekávaná pravdivé právě v případě glukózoisomerázy z Arthrobaater a u některých dalších důležitých enzymů. Příznivá je i schopnost snižovat teplotu při současné sch-ртlě-tl ztyšit nebo udržet výtěžek.

To sice není pravdivé v případě glukózo!somerázy z v tomto případě však hraje úlohu jiná příznivá okolnost. . Přidání geimantáu totiž značně zvyšuje p^j^i^ltefinzí reakční rychlost přeměny glukózy na fruktózu, takže se dostatečné přeměny dosáhne v kratší době a tím i levněěi. M.moto germanát nijak nenarušuje stálost uvedené glukózo!8-oerázy, nebot zmirňuje pokles pH, k němuž při postupném hromadění glukózy za přít-mě>-ti germanátu do chám <

Na obr. 1 je graficky znázorněn vztah procenta glukózy v eluentu ze sloupce s 1ооИ1Иzlvtělu glukóžoi8omerlzou pro o i době, kterou přiváděný roztok stráví v minutách ve sloupci.

Křivka 1: přivádí se roztok fruktózy, obsah germanátu je 600 mM Křivka.2: přivádí se roztok glukózy, obsah germanátu je 600 mM Křivka 3: přivádí se roztok glukózy, který neobsahuje germanát Křivka 4: přivádí se roztok fruktózy, který neobsahuje germirnát.

Z grafického záznamu získaných výsledků na obr. 1 je zřejmá výhodnost pouužtí germanátu jako klmpPeχotvlrěéhl činidla při provádění způsobu podle vynálezu.

Xa obr. 2 je znázorněna změna optické v % jako výsledek' tvorby komf^llexu v na pH.

Křivka 1: kommlex s fruktózou

Křivka 2: komplex s glukózou

K^vka 3: kunppex s marmozou

Jak je zřejmé, bylo u ^uk^zového klmoPexu zjištěno nižší pH než pro glukózový a mannózový kumpex. .

Vyyniez bude osvětlen následujícími příklady

Přikladl

Enzymatická přeměna glukózy na fruktózu

Byl připraven sloupec o délce 32 cm a vnitřním průměru 0,4 cm, naplněný neporušenými vyvločkovánými buňkami s obsahem glukózoizomerázy. Tímto sloupcem procházely vodné roztoky glukózy s různou koncentrací glukózy, hořěíkových iontů a germanátových iontů· Odpovídající roztoky bez germanátu byly užity jako kontrolní roztoky. Procentuální přeměna glukózy na fruktózu v eluátu ze sloupce byla měřena na přístroji Autoanalyser při použití resorcinolové metody· Reakce byla prováděna při počátečním pH 8,5 a teplotě 60 °C a při koncentraci 0,004 mol/1 chloridu hořečnatého ve vodných roztocích glukózy·

Při přípravě glukózových roztoků o koncentraci 100 mmolů/1 bylo nutno zabránit, aby germanátové ionty nezpůsobily vysrážení hořečnatých iontů z roztoku· Z tohoto důvodu byly germanátové ionty vždy přidány ke glukózovým roztokům těsně před vstupem do sloupce, ale ještě před přidáním chloridu hořečnatého, protože hořčík se navysráží v přítomnosti komplexu glukózy a germanátových iontů, který je již v roztoku vytvořen· Roztoky s obsahem germanátových iontů byly připravovány tak, že byl uveden v suspenzi ve vodě kysličník germaničitý, načež byl přidán koncentrovaný roztok zásady až do dosažení pH 10,5 a pak teprve roztok glukózy a nakonec chlorid hořečnatý· Nakonec byl roztok upraven na pH 8,5, čímž současně došlo к jeho vyČeření.

V případě přípravy roztoků s obsahem 200 molů germanátových iontů nebo s ještě vyšším obsahem těchto iontů byl postup prováděn tak, že kysličník germaničitý byl přidán к roztoku glukózy o koncentraci 1 mol/1, přičemž byla přerušovaně přidávána zásada až do pH 8,5, takže germanát pomalu přecházel do roztoku· Po přidání chloridu hořečnatého se roztok slabě zakalil, avšak eluát ze sloupce byl naprosto čirý.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce I.

T a b u 1 к a 1

Koncentrace glukózy (mmol/1)	Koncentrace germanátových iontů (mmol/1)	% přeměny glukózy na fruktózu	рИ eluátu	Rychlost průtoku ml/min
0,528	0	59	n.a.	0,12
0,528	25	75	n.a.	0,12
4,65	0	57	8,3	0,10
4,58	25	• 82	8,1	0,10
12?	0	47,5	7,0	0,11
118	25	80,5	6,8	0,11
337	0	44,5	6,8	0,11
270	25	63	6,7	0,11
259	0	46*	6,5	0,11
265	25	53	6,3	0,11
300	50	52	6,0	0,11
284	100	59,5	6,4	0,4
275	200	72,5^м	7,2	0,11

55,5 % při rovnovážném stavu ^M 82 % při rovnovážném stavu (koncové pH 6,5)

Jak je zřejmé z tabulky 1, došlo za přítomiosti germanátových iontů vždy k vzestupu koncentrace fruktózy ve srovnání s obdobnými roztoky bez přítomnost germanátových iontů.

Příklad 2

Enz;ynaaická přeměna glukózy na fruktózu

Byl opakován postup podle příkladu 1 při použití sloupce s obdobnými rozměry, tj. 30 cm délky a 0,4 cm vnitřního průměru, přičemž.byl sledován vliv stoupající koncentrace glukózy. V tomto případě byla rychlost průtoku snížena na 0,03 ml/min. tak, aby roztok zůstával ve sloupci 125 oinut, takže bylo dosaženo rovnovážného stavu po. dobu několika hodin a bylo možno stanovit podmínky, které vedou ke vzniku tohoto rovnovážného stavu. Po vzniku soOěi byla vždy stanovena koncentrace glukózy, aby bylo možno provést opravu ne přítomnost zásady a hořečnatých solí·

Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Počáteční koncentrace glukózy g/100 ml roztoku	Konnentrace germmátových iontů (mnol/1)	Koncentrace fruktózy g/100 ml roztoku	% přeměny
47,4	0	25,6	54,0
45,6	364	32,0	70,0
43,7	524	35,0	80,0
430	696	36,5	84,0
50,0	800 ·	39,7	79,4

Jak je zřejmé z tabulky 2, zvyšuuí germanátové ' ionty podstatrým způsobem přeměnu· glukózy na fruktózu.

Mno^v! fruktózy bylo stanoveno Chaplin-Kennedyho metodou (Carbotydrate ReSs, 1975, 40, 22 až 33). Při tomto způsobu provedení se získají o něco vyšší výsledky než při resorcinlové metodě, která byla ke stanovení fruktózy užita ve všech následnících příkladech.

Daší pokus byl proveden při . po^-užtí resorcinolové metody (Carbotyfrate ReSs, 1975, 26. 41) a při ponuří sloupce týchž rozměrů při teplotě 60 °C a pH 8,5. PřL různých průtokových rychlostech byly získány následnicí výsledky.

Rrchloet průtoku (ml/min)	Přiváděný maaterál (vždy s 4 шпо^ MJCI2
51,2,g/100 ml glukosy	47,8,g/100 ml glukózy + 800 geratanátu
0,015	53	74
0,030	42,5	69
0,050	36	50

Produkt při počáteční koncentraci glukózy 43,5 % ze svrchu uvedené tabulky 2 byl frakcionován na jniontomёn0či Jeol v borátové formě při pouužtí gradientově eluce borátovými pufry (0,13 ooo/1 borát o pH 7 a 0,35 ooV1 borát o pH 9,8), čímž bylo ·dosaženo oddělení glukózy a fruktózy. Totéž dělení bylo prováděno po oddělení germanátu i na sloupci.přípravku BORASORB. Poměr glukózy a fruktózy se pohyboval v rozmezí 3,31:1 bez předchozího odstranění germanátu. Fruktóza a glukóza byly stanoveny metodou s užitím cysteinu a kyseliny sírové.

Příklad 3

Chemická přeměna glukózy na fruktózu

Čistě chemická přeměna glukózy na fruktózu za přítomnosti germanátových iontů byla sledována tak, že byl zahříván roztok s obsahem 50 % glukózy, 4 ϋ1/1 hořečnaté soli a 600 mml/l germanátových iontů na 60 °C při pH 8,5. Bylo dosaženo následujících konccnnrací fruktózy po . různých reakčních dobách.

čas (min)	% fruktózy
90	3,3
135	4,6
180	5,7

Pokus byl opakován při teplotě 90 °C a při krnceetraci glukózy 48,8 až 50 % a koncentraci germanátových iontů 600 až 582 mamou. Procentuální přeměna glukózy ne fruktózu po různých reakčních dobách je uvedena v tabulce 3. Fruktóza byla stanovena rnssrcinslsvsu metodou. V průběhu pokusu byl příd^men v zahřívaném sirupu dusík. Ve vSech případech došlo k poklesu počátečního pH, měřeného při teplotě 310 °C a bylo nutno pH vyrovnávat.

Tabulka 3 ·

48,4,(g/100 ml roztoku) glukózy, počáteční pH 7,0 bez MgClg

582 mamo/l germanát (g/100 ml roztoku) glukózy počáteční pH 7,5 bez Mg^

600 germanát .(g/100 ml roztoku) glukďzy, počáteční pH 8,0 bez MgClg

600 miVl germanát čas % přiměny h na frkcóozu čas % peiměiKy h na frukóozu čas % přeměny h na fukóózu

0,5	2,0	0,5	4,3	0,5	9,1
1,0	3,8	1,0	8,2	1,0	12,5
1,5	4,7	1,5	9,7	1,5	14,4
2,5	6,8			2,0	15,2
3,0	7,4	3,0	12,6	3,5	15,4
3,5	7,8	3,5	12,6	3,5 (pH 6,74)	15,4
4,0	8,3			4,0	18,3
4,5	8,7	6,0	12,2	4,5	13,3

(koncové pH 6,37)

Podobné pokusy byly provedeny za přítomno ti MgCg Výsledky, dosažené rnssrcin.slovsr metodou jsou uvedeny v tabulce 4.

N^sed^ící výsledky, získané za přítoinosti 1,245 ϋ!/1 glukózy, 600 ϋν1 germa- . nátu a 4 mni1/1 chloridu. hořečnatého ukazuj důležitost poměru mezi glukózou a germanáto“ vými ionty.

Čas (h)	0,5	1,0	1,5	2,0	2,5	(pH 7,48
% přeměna na fruktózu	19,8	31,6	36,2	38,6	38,6
Čas (h)	3,66	4,33	6	6,5
% přeměna na fruktózu	46,1	48,5	48	45

Produkt, který byl získán v průběhu několika hodin, byl rozdělen na borátovéna sloupci po předchozím odstranění germanátových iontů 1 bez tohoto odstranění· Byl získán v obou případech týž výsledek 39,7 % fruktózy.

Tabulka 4 g/100 ml glukózy, počáteční pH 8 0,004 mol/MgCl₂

600 mol/1 germanátu čas % přeměna na hod fruktózu g/100 ml glukózy, počáteční pH 8,5 0,004 mol/1 MgCl₂

600 mmol/1 germanátu čas % přeměna na hod fruktózu g/100 ml glukózy počáteční pH 9,0 0,004 mol/1 MgCl₂

600 mmol/1 germanátu čas % přeměna na hod fruktózu

	0,5 ’,o	19.5 28.5	0,5 1,0	30,3 35,2
2,17	16,9			2,0	35,7
2,83	19,0	2,83	29,8	2,33	36,7
3,33	18,8	3,33	27,2	2,67
		(pH 6,42)		(pH 6,98)
4,0	18,0			3,33	35,8
(pH 6,37)
4,5	22,1	4,5	34,3	3,67	36,2
4,83	23	5,0	35,5
5,33	22,7

Při použití roztoku s obsahem glukózy 55 g/100 ml roztoku, 600 mmol/1 germanátu, 0,004 mol/1 MgCl₂ při zahřátí na teplotu 90 °C a při počátečním pH 7,5 po 6 hodinách bylo dosaženo přeměny glukózy na fruktózu v rozsahu 13,7 %, jak bylo zjiětěno resorcinolovou metodou·

Chemická přeměna glukózy na fruktózu probíhá velmi pomalu při nízkých koncentracích germanátových iontů a při teplotě 90 °C a pH 8,5 bez přidání chloridu hořečnatého.

100 mmol/1 glukózy 20 mmol/1 glukózy 20 mmol/1 glukózy mmol/1 germanátu 10 mmol/1 germanátu 20 mmol/1 germanátu čas ' % přeměny čas % přeměny čas % přeměny

0,5 1	3.5 7.6	0,5 1	4,3 a,5	0,5 1	4,3 8,5
1	10,7	’,5	11,7	2	15,5
2,67	18,2	2,5	18,7
3⁺	18,8	3*	19,8
(pH 8,16)		IpH 7,78)
3.5	21,5	3,5	25,3	3⁺ pH 8,22	19,8
4	24,2	4	29,1	3,5	20,4
				4	25,6
s 7	25,6

π

Tabulka - pokračování

100 mmol/1 glukózy mmol/1 germanátu čas % přeměny mmol/1 glukózy mmol/1 germanátu čas % přeměny mmol/1 glukózy mmol/1 germanátu čas % přeměny

5	27,5	5 (pH 7,8)	33,4	5	29,7
5,5	29,1			5,9 (pH 8,0)	32,2
6	30,3	6	36,8	6	33,5
7	31,8			7	37,3
7,5*	31,9	7,5	39,7
(pH 7,82) 8,5	33,4	8	40,6	8	39,4
9	34,6	9	40,6	9	38,9

* pH 8,5

Příklad 4

Přeměna glukózy na fruktózu při použití rozpustné glukózoisomerázy

Počáteční reakční rychlost při použití 200 mikrolitrů glukózoisomerázy v rozpustné formě při teplotě 60 °C a pH 8,5, přičemž substrátem byla D-glukóza v koncentraci 0,5 mM při přidání 4 mmol/1 chloridu hořečnatého a 0,5 mmol/1 chloridu kobaltnatého v sérii roztoků po 25 ml 8 obsahem různého množství germanátu. Roztoky byly analyzovány automatizovanou resorcinolovou metodou. Bylo užito následujících typů roztoků:

1. bez germanátu, 6,25 mikrogramů fruktózy/min/ml enzymu.

2. 0,5 mmol germanátu, 8,75 mikrogramů fruktózy/min/ml enzymu.

3. 25 mmol germanátu, 15 mikrogramů fruktózy/min/ml enzymu.

Bylo stanoveno i procentuální množství přeměny v průběhu 21 hodin. V roztoku 1 - přeměna 43 %, v roztoku 2 - 51 % a v roztoku 3 - 62 %,

Příklad 5 o

Přeměna mannózy na fruktózu

Roztok 8 obsahem 50 g/100 ml mannózy, 4 mmolu/1 chloridu hořečnatého a 600 mmolu/1 germanátu byl zahříván na teplotu 90 °C při pH 8,5. Koncentrace fruktózy při stanovení resorcinolovou metodou byly následující:

Tabulka ' 5

Čas (min)	% přeměna na fruktózu
30	3,44
60	6,42
120	13,4
150	15,4
170 (pH 7,25, upraveno 15,9
260 na pH 8,5)	20,4
280	20,6

Příklad ' 6

Přeměna glukóz o ^-fosfátu na fruktózo-6-fosfát

Způsobem podle příkladu 1 byla provedena řada pokusů při použití 0,5 mol/1 roztoku glukozo-6-fosfátu s různým rnioostvím germeaiátu. Pokusy byly prováděny při teplotě 25 °C při různém pH. Pouuitý enzym byl enzym - Sigma Grade III z kvasnic ve formě krystalické suspenze a byl ředěn 200x a dialyzován proti destilované vodě k odstranění pufru těsně před použitím. Získaný fruktózo-6-fosfát byl stanoven reslrcioolovlu metodou.

Procentuální ' přeměna je uvedena v tabulce 6.

Tabulka 6

Koncentrace germanátových iontů mírnou/1	10,5	10,0	9,5	9.0	% přeměny (pH) 8,5	8,0	7,5	7,0
200	84	86	84	63	56	48	36	30
100	81	81	77	68	48	40	36	32
50	82	81	77	62	48	40	33	29
25	89	81	78	60	50	39	29	23
12,5	76	69	64	56	40	29	25	22
6,25	62	55	48	40	32	25	23	22
0					23			22

Z tabulky je zřejmé, ie procento přeměny stoupá s rnidstvím germanátových iontů.

Příklad 7

Stabblita enzymmaické přeměny glukózy na fruktózu

Sloupcem, obdobným sloupci z příkladu 1, se nechá pro;Jít roztok s obsahem 41,2 % glukózy, 600 mmo/l gerarnnátu a 4 - mmo/l chloridu h^iřeěnaté^ho při počátečním pH 7,0. Kmcové pH a % přeměny na fruktózu se měří -v různých Sašových intervalech. Pokus byl rozdělen na tři Sasové úseky·

Po prvním - úseku trvajícím 43 hodin byl roztok vySeřen k odstranění slabého zákalu, který se tvoří po delší době v roztoku glukózy a germanátu. Po druhém období, které tríalo od 43 do 102 hodin^bylo pH roztoku zvýšeno na 7,8 s velmi dobrým výsledkem. Po delším s průchodu sloupcem pokleslo významně pH eluátu. Je zřejmé, že je možno udržet % ' přeměny než 70 % po delší dobu v případě, že se pH eluátu udržuje na hodnotě alespoň 7,0 nebo jen o málo nižší. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7A.

Tabulka .. 7A

Řas hod	Počáteční pH	Kuncové pH po průchodu enzymem	% přeměny na fruktózu
2	7,0	6,6	67,2
17	7,0	5,6	61,5
43	7,0	5,5	60,8*
54	7,0	5,8	64,9
102	7,0	5,7	65,5**
126	7,8	6,9	76,5
150	7,8	6,9	78,3
174	7,8	6,9	76,5
198	7,8	6,8	71,6

* na konci prvního časového úseku - následovalo vyčeření převáděného roztoku ** na konci druhého období - došlo ke vzestupu počátečního pH

Vliv teploty na stabilitu reakce v delším časovém úseku je uveden v tabukách 7B a 7C při pouuití obdobného sloupce jako v příkladu 1. V tabulkácn jsou uvedeny reakční podmínky.

V tabulce 7B bylo přeměny dosaženo až po rovnovážném stavu, kdežto v tabulce 7C od počátku.

V obou případech je zřejmý kumultivní efekt.

Tabulka 7B g/100 ml glukózy .+ 4 mmo/1 MgClg + 600 mimo/l germanátu pH 7,1 Rychlost průtoku 0,05 ml/min enzymem

Teplota °C	Datum	% přeměny na fruktózu (enzym byl promyt před 2 dny)
55	26. 11. 75	69,2
60	26. 11. 75	73,4
65	26. 11. 75	75,1
70	27. 11. 75	71,5
75	27. 11. 75	72,1
80	27. 11. 75	75,0
85	27. 11. 75	60,5

Tabulka 7C g/100 ml glukózy + 4 mol/1 Mg^ + 600 mol/1 germanátu pH 7,1 rychlost průtoku 0,16 ml/min sloupcem enzymu

Teplota °C	Datum	% přeměny na frukt0zu (enzym byl promyt před 14 dny)	Průchod sloupcem při určité teplotě (hod)	Celková doba průchodu roztoku sloupcem (hod)
55	8. 12. 75	22,7	1 1/2	1 1/2
60	9, 12. 75	30,1	1 1/2	3
65	9. 12. 75	31,8	1 1/2	4 1/2
70	9. 12. 75	34,1	1 1/2	6
75	9. 12. 75	35,8	2 1/2	8 1/2
80	9. 12. 75	32,4	2	10 1/2
85	9. 12. 75	25,6	1 1/2	12

Příklad 8

Chemická přeměnp cukrů

a) Přeměna glukózy na fruktózu

Roztok glukózy o konceetraci 55 až 60 % byl připraven s přísadou 600 mM germanátu nebo bez této přísady. Okarnmitě po přípravě byly odebrány podíly o velikosti 50 mi^rc^oi^^,tr^ů, ^tyto ^podíl^y tyly ředěny na ⁵ ml a pa^{k by}l^y sladovány při. ^teplo^tě -²⁰ °C do analýzy.

Sirupy pak byly uloženy do zazátkovaných lahví do lednice při teplotě 4,5 °C. Pak byly láhve denně protřepávény v časových intervalech, uvedených v tabulce 8A. Všechny roztoky byly analyzovány dělením na ilttloёntčl s blriatnovýoi ionty a získané vrcholy byly podrobeny stanovení s automatizovanou metodou při použití cysteinu a kyseliny sírové. (Annl. Bioch., 26. 219, , 1968). Bylo zjištěno, ie roztoky s obsahem germenátu měly bělavou barvu, a to v průběhu celého období, uvedeného v tabulce BA, kdežto roztoky bez obsahu germanátu rychle zezelenaly a toto zbarvení se prohlubovalo v průběhu skladování.

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8A.

Tabulka 8A

Doba skla- Roztok s obsahem germanátu Roztok bez germanátu

dování (dny)	fruktóza g/100 ml	glukóza zbytek g/100 ml	fruktóza g/100 ml	glukóza zbytek g/100 ml
0	2,1	51,8	2,2	48,7
14	17,8	40,3	8,9	44,6
23	25,0	34,2	11,1	35,2
27	-	-	11,1*«	35,6
31	31,9*	26,9	-	-

ekvivalentní 54% přeměny za přítomneti pouze 3,1 % marrnózy, ** bylo přítomno 5 % mannózy.

b) Byl sledován i vliv inkubace při pH 12 a teplotě 5 °C za přítomnosti a v nepřítomnosti germanátových iontů při použití celé řady cukrů. Výsledky získané při zásaditém pH jsou uvedeny pro fruktózu, mónnózu, maltózu a 3-0-methyl-D-glukózu v tabulkách 8B, 8C а 8E. Ve všech těchto případech měl germanát dva účinky, a to a) oddaluje rozpad cukrů a b) mění rovnovážný stav směsi. V tabulkách nedávají údaje dohromady 100 %, protože dochází к rozkladu.

Tabulk в 8B

Počáteční koncentrace D-fruktózy s germanát em	52,1	g/100 ml 0	50,5 g/100 ml 600 mmol/1
složky (%ϊ	17 dní	30 dní	17 dní
D-glukóza	36,4	42,3	'8,1
D-mannóza	22,8	24,3	26,7
D-fruktóza	27,8	21,2	51,2
neznámá složka a	+++	+++	+
neznámá složka b	++++	4-+4-4-	+

Tabulka 8C

Počáteční koncentrace D-mannózy s germanátem složky (%)	51,'4 g/100 ml 0	53,3 g/100 ml 600 mmol/1
17 dní	30 dní	17 dní	30 dní
D-mannóza	79,3	53,4	60,2	27,45
D-fruktóza	13,65	18,3	32	44,4
neznámá složka 1	+	+ +	-	-
neznámý složka 2	+	+++	-	-
D-glukózy	7,2	18,8	7,1	13,36

Tabulka 8D

Počáteční koncentrace	59 g/100 ml	58,7 g/100 ml
maltozy s germanátеш		0	358 mmol/1
složky (%)	15 dní	27 dní	15 dní	27 dní
maltoza	38,3	26,5	48,5	13,9
maltulóza*	24,5	21,5	51,9	67,9
fruktóza	2,4	4,39	-	++
glukóza	22,1	22,8	stopy	9,3

počítáno přes molekulovou hmotnost s 0,5 moly glukózy +0,5 moly fruktózy

Tabulka 8E

Počáteční koncentrace	41,8	58,7
3-0-me thyl-D-glukózy*	g/100 ml	g/100 ml
s germanátem	0	464 mllal/1
složky	15 dní	15 dní
3-0-me ethrlfruktó za**	'8,5	29,7
3-0-me ttylglukóza	36,1	46
* nestálá v alkaicckém prostředí ** s ohlede na fruktózu

Příklad 9

Enz;ynatická přeměna xylózy na xylulózu

Roztok xylózy obsahoval 44 g/100 ml xylózy a 4 maoly chloridu hořečnatého. Tento roztok byl po úpravě pH na 7,0 nanesen na sloupec s obsahem glukózoisomerázy, tj. téhož enzymu, který byl užit v předchozím příkladu pro enzymmtickou přeměnu glukózy na fruktózu.

Teplota sloupce byla 60 °C a rychlost průtoku 0,05 ml za minutu. Obddbným způsobem byl týmž sloupcem při pH 7,0 proháněn roztok, který obsahoval 44 % xylózy, 4 mnmly/1 chloridu hořeěnatého a 600 germaniových iontů.

Po 2 hodinách byly odebírány frakce a tyto frakce byly dále' děleny na sloupei iontoměničové pryskyřice v borátové formě. ' Pro srovnání byl obdobným sloupcem dělen i roztok xylózy, který byl užit jako standard. Eluát ze sloupce byl automaticky analyzován na pentózy metodou s použitím cysteinu a kyseliny sírové. Tento roztok reaguje také s pentulózami a z tohoto důvodu byl zřemmý i podíl xylulózy.

Protože standardní roztok xylulózy pro kalibrační účely není dosud dostupný, byl stupeň reakce posuzován srovnáním ploch pod jednotlivými vrcholy. Tímto způsobem byl proveden odhad, že poměr xylulózy k celkovému mioossví xylózy a xylulózy byl 41:100, v případě germanátových iontů 58:100.

Příklad 10

Přeměna glukózy na fruktózu při pouužtí'iontů cínu

Na vrchol sloupce s obsahem glukózoisomerázy byly stejně jako v předchozích příkladech naneseny dva roztoky, které obsahovaly 44,6 % glukózy a'4 imi»oy/1 chloridu hořeěoatého při pH 8,5. Jeden z těchto roztoků neobsahoval ionty cínu, druhý roztok obsahoval 600 mmalů/1 Na2SnOo.3HgO. Výsledky'jsou'uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 9

čas hod	% přeměny na fruktózu bez cíničitanu	% přeměny na fruktózu (600 mollů/1 cíničitanu)
a	b
1			59,4
2	- .	-	56,6
3	42,6	53,3	-
4	-	-	56,1

Vzorky odebírané ze sloupce po smíšení a dalším podílem glukózy již nebyly schopny převádět glukózu na fruktózu, což znamená, že ae aktivní - glukózoisooeráza nevyOýVla ze sloupce.

Příklad 11

Enzymoaická přeměna glukózy na fruktózu

Viv pH a množstvím germanátu

a) Byly provedeny dvě série pokusů, přičemž byl užit sloupec s obsahem glukózoisomerázy o délce 31 cm a vnitřním průměru 4 cm, obdobný sloupci z . předchozích příkladů. V každé sérii byly porovnávány výsledky, které byly získány při pouuití roztoků s obsahem glukózy a 4 mmolů chloridu hořečnatého bez germanátu a za přítomnosti 600 mmoliV1 germirnátu. Rycdost průtoku sloupcem byla 0,05 ml za minutu a teplota enzymu 60 °C. Počáteční pH roztoku se pohybovalo u různých pokusů na různých hodnotách, přičemž bylo měřeno koncové pH eluátu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 10.

Tabulka 10

Série	Počáteční	Pořadí	Počáteční	Kornennrace	% přeměny	Koncové pH
pokusů	pH	analýzy	koncentrace	germanátu	na fruktózu	eluátu
			glukózy g/100 ml	(што^А)

1 1	7 6.9	3 8	48 47	0 0	48,2 49,6	7,2
1	8.5	1	49,2	0	49,2	-
1	8,5	2	49,3	0	49,2	-
1	7	5	40,2	600	76,5	7,0
1	7	6	40,0	600	70,3	6,9
1	8,5	4	38,2	600	74,6	7,2
1	8,3	7	40,0	600	72,5	6,6
1	8,3	9	37,0	600	71,2	7,0
2	7,0	2	42,0	0	54,0	6,8
2	8,4	1	41 ,6	0	49,3	7,1
2	8,5	4	44,6	0	54^9	7,0
2	7,1	5	53,4	600	67,4	6,8
2	8,6	3	50,0	600	66.7	6,8

1Θ

b) Byly provedeny dvě série pokusů při použití obdobného sloupce jako v předchozích příkladech. Na vrchol sloupce byl nanášen roztok s obsahem 50 % glukózy, 4 тпоИЪ^ chloridu hořečnatého a 200 nebo 600 m^oHů/1 germanátu. Pokusy byly prováděny při různém pH.

Srovnávací pokusy byly prováděny bez přítomnosti germanátových iontů. Ve všech pokusech byly použité roztoky proháněny sloupcem s obsahem imobilizovaného enzymu při průtokové rychlosti 0,05 ml za minutu, doba pobytu roztoku ve sloupci byla 75 minut. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11. '

Tabulka 11

pH	Sloimií eluátu (% fruktózy)
bez germanátu	200 mnooů/1 germanátu	600 maoo/1 germanátu
9,0	51		68
8,5	51	64	69
8,0	49	59	70
7,5	50	60	70
7,0	50	60	70
6,5	39	59	69
6,0		58
		50

P řík.l a d 12

Enz^ynmtická přeměna glukózy na fruktózu - reverzibblita

Byly připraveny roztoky glukózy a fruktózy, které mOly koncern^ci z tabulky 12. Tyto roztoky byly v případě, ie měly obsahovat germrniát, připraveny tak, ie bylo rozpuštěno odvážené mnnoitví kysličníku germot0čitého mícháním v malém mnoitví 50% hydroxidu sodného a tento roztok byl pak přidán do roztoku, určeného k rozpuštění cukru. Pak byl k roztoku přidán chlorid hořečnatý do konečné koncentrace 4 mnooy/1 a pH roztoků bylo upraveno na 8,5 při teplotě 25 °C.

Roztoky byly potom proháněny rychlostí, uvedenou ·v tabulce sloupcem s obsahem enzymu o rozměrech 30x0,4 cm při teplotě 60 °C. Po zředění byla stanovena hladina fruktózy v eluátu. Pro kalibraci byly připraveny roztoky o ^ηοοπΟ^Η 0,55 %, které procházely celým analytcekým sys^nem. Aby bylo možno kontrolovat počáteční hladinu glukózy v nanášeném rlitl^ku^, tylo ^prOvá^děno ^dění vzor^ků i standard v ^poměru ² x ¹0^ ru^čně a t^yto roztok^ytyly pak · analyzovány běžným způsobem, při pouřití cysteinu a kyseliny sírové. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12 a graficky znázorněny na obr. 1.

Z těchto údajů je zřejmé, ie bez přítomnooti germanátových iontů je rovnovážný stav mezi 52 a 53 % fruktózy, a to bez ohledu na to, zda se · vycl^i^i^zí z roztoků s obsahem glukózy nebo fruktózy. Za přítomnost 600 mnmoů/1 germanátu jevšak rovnováiný stav za týchi podmínek mozi 74 ai 79 %a to opět bez ohledu na to, zda se vychází z roztoku glukózy nebo fruktózy.

Tabulka 12

Rychlost, průtoku	% uhlohydrátu v roztoku bez germanátu	% uhlohydrátu v roztoku s germanátem	Doba pobytu (min)	Složení eluátu	Přiváděný cukr
bez germanátu	600 mmol/1 germanátu
0,1	54,6	50,5	38	22,5	31,0
0,05	51,2	47,8	75	36 ť0	49,5	glukóza
0,03	51,2	47,8	125	42,5	68,5
0,015	51,2	47,8	251	53,0	74,0
0,1	55,0	48,2	38	71,0	79,0
0,05	55,0	48,2	75	55,5	77,5
0,03	55,0	48,2	125	53,5	77,0	fruktóze
0,015	55,0	48,2	251	52,0	77,0

P říklad 13

Enz;ynatická přeměna glukózy na fruktózu - závislost na koncentraci

Sloupcem glukózoisoaerázy, podobným jako v přédchozía příkladech, byla při teplotě °C proháněna·řada roztoků, z nichž všechny obsahovaly 600 mmaoů/1 germanátu a 4 mmaoy/1 chloridu zinečnatého, avěak různé koncentrace glukózy. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13. Tabulka 13 ,

Kootentrace glukózy v %	% přeměny na fruktózu	Koncové pH
20,6	92,7	7,8
30,0	80,0	7,8
40,0	72,5	7,5
53,4	67,4	6,8*
60,0	65,0	7,5

z předchozího pokusu

Příklad 14

Chemická přeměna meeibiózy

Chemická přeměna meeibiózy (6-O-alfa-D-galaktopyrenosyl-D-glukózy) byla studována za přítomnosti a v nepřít omasti german átových iontů při pH 12,0 a teplotě 4 °C. Kootentrace m^e^libiózy v počátečním roztoku 51,6 %, koncentreace · germanátu 324 mmooů/1. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 14.

Tabulka 14

Sloučenina	% cukru po uvedeném počtu dnů	Germanát
0	15	29	42
meibióza	92,2	55,5	57,5	49,6
6-0-alfa-D-galaktop^ranosyl-^D-fruktoza	3,2	9,8	12,8	11,0
galaktóza	-	9,9	11,9	12,3
výtěžek idennifikovaných prdduktů	95,4	75,2	82,2	72,9
melibióza	-	42,7	35,0	25,2
6-0^0 a-D-galaktopyгaossyl-D-fгuktózj		37,8	42,5	31,1	+
galaktóza	-	-	7,9	12,8
výtěžek identifikovaných produktů	-	80,5	85,4	69,1

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob . přeměny aldózy nebo jejího monofosfátu na ketózu nebo její monofosfát . tak, že se připraví vodný roztok aldózy nebo jejího mononosSátu a v tomto roztoku se podrobí chemické nebo enzymaaické isomeraci při použití příslušné isomerázy aldóza nebo její monoOosOét na odppoVídjící ketózu nebo její mononooS‘át při pH .6 · ai 10 a při teplotě 25 ai 100 °C za přítomnooti komppexotvorného činidla, které vytváří silnější komplex s ketózou nebo jejím mononoofáteů než s aldózou nebo jejím mononosOátem s následnou izolací ketózy nebo jejího mononosfátu, vyzne^^ící se tím, ie komplexotvorným činidlem je kyslíkatý aniont něho smíšené koiappexní kyslíkaté anionty, vzní^aící reakcí mezi kyslíkatým aniontem germania nebo cínu s iontem dalšího prvku ze skupiny IV. nebo s prvkem ze skupiny V, nebo VI. periodického systému.
2. Způsob podle bodu 1, vyznc^u^! se tím, ie se užívá koímpexotvorného činidla, které je kyslíkatým aniontem, nebo smíšeným komplexním kyslíkat^ antontem germania.
3. Způsob podle bodu 1 a 2, vyzna^^íci se tím, že se komplexotvorné činidlo uvádí do reakce jako komplex aldózy a kyslíkatého antontu nebo jeho derivát kommlexu aldózy a kyslíkatého aniontu nebo jako sůl nebo·kysličník jiné sloučeniny, která tvoří kyslíkaté anionty nebo smíšené komp^p.exy kyslíkatých aniontů za reakčních podmínek.
4. Způsob podle bodu 1 až 3, se tím, že se komp^KO^o^ činidlo přivádí do reakce ve formě kyslíkatého antontu, předběžně vázaného na po^yo! nebo na iontoměničovou pryskyřici nebo na jinou nerozpustnou podložku, která tvoří chelát s kom^p^l^^ot^voi^r^t^m činidlem nebo toto činidlo obsahuje.
5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že knmpPexotvorné činidlo je pří0oπoю v roztoku v koncentraci 200 až 900 ^11/1. ’