JPH11504817A - 単糖およびオリゴ糖を酵素的にガラクトシル化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 単糖およびオリゴ糖を酵素的にガラクトシル化する方法本発明は、単糖およびオリゴ糖を酵素的にガラクトシル化するための、スクロースシンターゼ、β-1-4-ガラクトシル転移酵素およびウリジン二リン酸グルコース4'-エピメラーゼ（UDP-グルコース-4'-エピメラーゼ）存在下で、in situにおける糖ヌクレオチド（またはヌクレオシド二リン酸糖）の再生をともなう、改良された処理方法に関連するものであり、この方法は、ウリジン二リン酸-グルコース4'-エピメラーゼを、ケト糖誘導体によって再活性化することが必要である。

Description

【発明の詳細な説明】 単糖およびオリゴ糖を酵素的にガラクトシル化する方法 本発明は単糖およびオリゴ糖を酵素的にガラクトシル化するための、スクロー ス合成酵素、β-1-4-ガラクトシル転移酵素およびウリジン二リン酸グルコース4 '-エピメラーゼ（UDP-グルコース4'-エピメラーゼ）存在下で、糖ヌクレオチド のin situ（同一系内）における再生をともなう、改良された方法に関連するも のである。 β-1-4-ガラクトシル転移酵素（GalT）[EC 2.4.1.38]を用いた、N-アセチルラ クトサミン（LacNAc）およびその誘導体の酵素による合成は、長く知られている （C.H.ウォン(Wong)ら：J．Am．Chem．Soc．118，8137(1991)、J．Org．Chem．5 7，4343(1992)）。ウォンら（第１図および第２図）は、UDP-グルコースのin si tuにおける再生に関連する、LacNAc合成酵素を開発し、それによると高価な糖ヌ クレオチドを、化学量論的な量用いる必要がないが、それでも、６つの異なる酵 素を必要とする。 既知の回路に比べ、エリング（Elling）ら（Glycobiology 3，349(1993)，DE 42 21 595 C1)）によって提唱されたLacNAc回路（第３図）は、６つの酵素が合 成に必須であるのに比べ、たった３つの酵素、すなわちイネのスクロース合成酵 素、β-1-4-ガラクトシル転移酵素およびUDP-グルコース4'-エピメラーゼしか必 要でないことに関しては、改善を示している。合成される二糖類は、例えばシア リル（sialyl）転移酵素やフコシル（fucosyl）転移酵素などの、異なる酵素に よる、それ以降の反応の出発化合物である。これらの酵素による合成の標的生成 物は、シアリルルイス(Lewis)Ｘおよびその誘導体（イチカワ(Ichikawa)ら、J.A m．Chem．Soc．114，9283(1992)）であり、細胞／細胞認識におけるその重要性 は、集中的な研究の対象である（デフリース(DeFrees)ら、J．Am．Chem．Soc.， 117,66(1995)）。 スクロースシンターゼ[EC 2.4.1.13]（S．Syn.）は、特に植物に広く分布する 糖転移酵素であり、植物代謝における糖ヌクレオチド形成のための触媒としての 役割は、アヴィガード(Avigad)（ローヴス(Loewus)ら（編）、植物生理学百科辞 典ニューシリーズ、第13A、炭水化物Ｉ、細胞内炭水化物、シュプリンガー・フ ェアラーク、ベルリン、217-347、1982）によって要約されているが、UDP-Glc、 dTDP-Glc、ADP-GlcおよびGDP-Glcなどの糖ヌクレオチド合成に適している（エリ ングら、Glycobiology 3，349(1993)）。イネのスクロースシンターゼの精製、 およびUDP-グルコースのin situにおける再生のためのその利用は、エリングら （DE 42 21 595 C1、Biotechnol．Appl．Biochem．21，29(1994)）によって記述 されている。このイネの酵素は、362kDaの分子量をもったホモ４量体タンパクで ある。この酵素は、酵素膜反応器（EMR）において、dTDPを出発化合物として用 いたdTDP-Glcの調製的合成のために、ザーボセン（Zervosen）らによって既に利 用されている。 LacNAc合成の中心的な酵素はβ-1-4-ガラクトシル転移酵素であり、これはUDP -ガラクトースをN-アセチルグルコサミンに転移する。これにより、N-アセチル ラクトサミンが出来る。他の単糖およびオリゴ糖も、受容体として使うことがで きる。 エリングら（DE 42 21 595 C1）のLacNAc回路における第三の酵素は、UDP-グ ルコース4'エピメラーゼ[E.C．5.1.3.2]である。シグマから購入可能な、パン酵 母の酵素はNAD分子が強固に、しかし非共有結合で結合する、２つのサブユニッ トからなる（フクサワ(Fukusawa)ら、J．Biol．Chem．255，2705(1980)）。した がって、この酵素は何らかの外から加えられた補因子を必要としない。大腸菌と 酵母のエピメラーゼの性質は、フレイ（Frey）ら（D.ドルフィン(Dolphin)ら編 、ピリジンヌクレオチド・コエンザイム：化学的、生化学的、医薬的視点(Pyrid ine Nucleotide Coenzymes：Chemical，Biochemical and Medicinal Aspects)、 Vol．2B、ワイリー(Wiley)、New York 462-511）によって記述されている。この 異性化反応は、UDP-4'-ケトピラノースヘ酸化され、後者は引き続き出発化合物 のC4'異性体に還元される、UDP-グルコースによって影響を受ける（第４図）。 エピメラーゼは、特定の糖の存在下、およびUMPまたはUDPの存在下、ならびに 基質であるUDP-グルコースとUDP-ガラクトースによって、還元的に不活性化され る（カルメンス(Carmenes)ら、Yeast 2，101，(1986)、ネルエステン(Nelestuen ) ら、J.Biol.Chem．4，7533(1997)）。酵素に結合することにより、UMPなどのウ リジンヌクレオチドは、結合したNADが物質を還元するための反応性を増加する ようなコンフォメーション変化を誘導する。それに続いて形成されるエピメラー ゼ-NADHは、本来の酵素の10%から15%の活性しか発揮しない（カルカー(Kalckar) らProc．Nat．Ac．Sci．65，1113(1970)）。 エピメラーゼが不活性化されることから、糖ヌクレオチドのin-situにおける 再生を含む、前述した酵素によるLacNAcの合成は、少ないサイクル数しか行えず 、また特に天然にない基質の場合、不満足な収量しか得られない。二糖類または オリゴ糖の収量を上げるために、エピメラーゼを繰り返し計量しなければならず 、これにより合成が不経済となる。 これとは対照的に、本発明の目的は、二糖類またはオリゴ糖の酵素による合成 を、経済的に行う方法を可能とすることであり、当該方法においてはUDP-グルコ ース4'-エピメラーゼの不活性化を回避している。 この目的は、スクロースシンターゼ、β-1-4-ガラクトシル転移酵素およびウ リジン二リン酸-グルコース4'-エピメラーゼ存在下で、糖ヌクレオチドをin sit uで再生する、単糖およびオリゴ糖を酵素的にガラクトシル化する方法により達 成されるが、そこでは、ケト糖またはケト糖誘導体を、ウリジン二リン酸-グル コース4'-エピメラーゼの活性化剤として反応混合物に加える。 ジヌクレオシド二リン酸-ケト糖、好ましくはデオキシウリジン・二リン酸-6- デオキシ-D-キシロヘクスロース（deoxyuridine diphosphate-6-deoxy-D-xylohe xulose）またはデオキシチミジン・二リン酸-6-デオキシ-D-キシロヘクスロース （deoxythymidine diphosphate-6-deoxy-D-xylohexulose）が特に好適な活性化 剤である。 ケト糖もまた好適な活性化剤である。6-デオキシグルコソン（6-deoxyglucoso ne）、ガラクトソン（galactosone）、アロソン（allosone）またはグルコソン （glucosone）を用いることが好ましい。 この新規な処理法では、反応混合物内での活性化剤の濃度は０．０１から２０ ｍＭ、好ましくは０．１から１ｍＭである。 本発明による方法はまた、限外濾過セル内で、反復バッチ処理法として行うこ ともできる。 この新規な処理法を用いると、他の酵素の活性なし、すなわちスクロースシン ターゼおよびβ-1-4-ガラクトシル転移酵素なしで、UDP-グルコース 4'-エピメ ラーゼ再活性化され、回復する。 UDP-Glc 4'-エピメラーゼの安定性に関する研究により、酵母のエピメラーゼ はUDP-グルコースおよびUDP-ガラクトース（ガラクトシル転移酵素の供与体）存 在下、および種々の受容体（Glc、2-デオキシグルコース、5-チオグルコースお よびn-オクチルグルコピラノシド）存在下で不活性化されることが示された。こ れは、エピメラーゼを、UDP-ガラクトースをin situで再生するために用いる際 に、よく起こる問題である。それに続く実験で、われわれは現在、特にdUDP-6- デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロースおよびdTDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクス ロースを、UDP-グルコース 4'-エピメラーゼの活性化に利用できることを示すこ とができた（第５図）。 dUDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロースおよびdTDP-6-デオキシ-D-キシロ- 4-ヘクスロースはUDP-グルコースおよびdTDP-グルコースから、dTDP-グルコース 4,6-デヒドラターゼ[EC 4.2.1.46]を触媒として用いることによって形成される （ザルコフスキー(Zarkowsky)ら、J．Biol．Chem．244，4750(1969)）。 dTDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロースは、dTDP-L-ラムノース生合成経路 の中間体である。この酵素による、この物質の合成と単離はマルモ(Marumo)らに よって記述されている（Eur.J.Biochem．204，539(1992)）。dUDP-Glcが市販さ れていなかった間、それはメロ(Melo)ら（J.Biol.Chem．240，398(1965)）によ って、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)のdTDP-Glcピ ロホスホリラーゼを用い、分析に供する程度の量しか合成されていなかった。dU DP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロースおよびdTDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘ クスロースは、dUMPとdTDPから、スクロースシンターゼの合成能を用いてそれぞ れ調製される（第６図）。 次に、dUDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロースは、N-アセチルラクトサミ ン（LacNAc）合成において、エピメラーゼを活性化するために初めて用いられた 。エピメラーゼのこの活性は128時間にわたって監視した。1mMのdUDP-6-デオキ シ- D-キシロ-4-ヘクスロースを添加した結果、エピメラーゼの急速な活性化が起こ り、その活性化は観察を行った期間にわたって安定であった（第１０図）。 提案された方法のさらなる改善は、反復バッチ処理法を用いることによって達 成される（U．クラグル(Kragl)ら、Tetrahedron 4，1193-1202(1993)）。この方 法では、基質をスクロースシンターゼ、ガラクトシル転移酵素、エピメラーゼお よびdUDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロース存在下で、YM10膜を持つ限外濾 過セル内で反応させる。反応が終了に来たところで、酵素をそこに保持したまま 生成物溶液を限外濾過膜で濾過する。この反応は、新鮮な基質溶液を加えること により、さらに酵素を計測することなく、数回反復することができる。その結果 、何らの固定処理をしなくても、元からある酵素を合成に繰り返し用いることが できる。この文脈では、エピメラーゼの活性化は、LacNAcとその類似体を経済的 に合成するために至適な利用法が、反復バッチ処理法であることを確実にしてい る。 実施例： 実施例１： dUDP-Glcを出発物質とした、dUDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクス ロースの合成 合成混合物： 20.1 mgのdUDP-Glc（約10mM、1.2.4参照） 1920ulのHepes(ヘペス)-NaOH（200mM、pH7.2、1mM DTT、500mMスクロース25mMKC l、１mg/ml BSA） 80ulのdTDP-D-Glc- 4,6-デヒドラターゼ（1.48U、粗抽出物） 30℃でインキュベーション；インキュベーション時間：４時間 ４時間後、dUDP-GlcはHPLCではもはや検出不能であった（第９図）。この生成 物はエピメラーゼを活性化するために用いられ、成功した。dTDP-6-デオキシ-D- キシロ-4-ヘクスロースは、同様な実験条件下で合成された。この場合、反応は １時間で完了した。 実施例２： dUMPを出発物質としたdUDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロース の合成 合成混合物： 容量（Ｖ）＝3ml ナーゼ（20U/ml）、3U NMPK（1U/ml）、15 U dTDP-D-Glc 4,6-デヒドラターゼ（ 5U/ml）、 緩衝液：トリス-塩酸(100mM、pH7.2、3mM DTT、1mg/mlウシ血清アルブミン(BSA) 、50mM KCl) インキュベーション温度：２５℃ ４時間のインキュベーション後、69.3%の生成物が形成された。 実施例３： 反復バッチ処理法によるLacNAcの合成 反復バッチ処理法を用いる目的は、合成の生産性を実質的な増加を達成するた めである。 LacNAcの至適合成：1mM UDP-Glc、1mM MgCl₂、10mM GlcNAc、500mM スクロース 、0.05U/ml GalT、0.2U/ml エピメラーゼ、0.4U/ml スクロースシンターゼ、緩 衝液：200mM Hepes-NaOH，pH7.2、0.1% BSA、1mM DTT インキュベーション温度：30℃ 転換率：100% サイクル数：10 生産量：200mM^*ml/U S-T Y: 3.8g/1^*d（S-T Y = 空間-時間 収量） 合成混合物： 1mlの至適化されたLacNAc混合物 を用いて遠心した。残りの約250μlを、ウシ血清アルブミン(BSA)を含まない緩 衝液で透析濾過した。 れの場合において、反応の開始と終了時にサンプルを採取した。 結果 第７図の結果は、反応時間１２時間後、およびYM10膜を通して遠心した後では 、エピメラーゼはもはや活性を持たないことを示している。この結果から、用い られる緩衝液系におけるエピメラーゼの安定性を、さらに詳細に調査した。 実施例４： エピメラーゼの安定性の調査 UMP存在下での糖によるエピメラーゼの不活性化 このエピメラーゼは、用いられた緩衝液系で不活性化され、また酵素の活性は ８時間にわたって監視された。 実験条件： 緩衝液： Ａ： 200 mM Hepes pH 7.2、1mM DTT、１ mg/ml BSA Ｂ： 200 mM Hepes pH 7.2、1mM DTT、１ mg/ml BSA、500 mM スクロース 混合物： Ａ． 緩衝液Ａ Ｂ． 緩衝液Ａ、0.1 mM UMP Ｃ． 緩衝液Ｂ Ｄ． 緩衝液Ｂ、0.1 mM UMP いずれの場合も、0.25mg/mlのエピメラーゼを含む。 インキュベーション温度：３０℃ 活性検定：（フクサワら、J．Biol.Chem．255，2705-2707(1980)） 893μlの100 mM グリシン緩衝液、pH 8.8 20μlの5mM UDP-Gal 20μlの50mM NAD 33.3μlのUDP-Glc脱水素酵素（2U/ml） 33.3μlのエピメラーゼ 温度：２５℃ 340nmで測定を行った。 結果 第８図に結果が要約されており、これによると、エピメラーゼはスクロースま たはその分解生成物であるグルコースおよび果糖、ならびにUMPの存在下で不活 性化されることが明らかである。 実施例５： 種々のGalT受容体および供与体の存在下でのエピメラーゼの不活性 化 エピメラーゼの不活性化が、多くの応用例に関連して起こるという論題を検討 するために、種々のGalT受容体および供与体の存在下で、エピメラーゼの安定性 について試験した。この結果は第１表に要約されている。 第１表の結果は、種々のGalT（グルコース、チオグルコース、2-デオキシグル コースおよびn-オクチルグルコピラノシド）受容体存在下で、またUMPおよびUDP -ガラクトースまたはUDP-グルコース存在下において、エピメラーゼを不活性化 することを明らかにしている。したがって、これは、エピメラーゼをin situに おいてUDP-Galを再生するために用いる時に、よく起こる問題である。 実施例６： エピメラーゼの再活性化 dUDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロースおよびdTDP-6-デオキシ-D-キシロ- 4-ヘクスロースの両者、そして、6-デオキシグルコソン、ガラクトソン、アロソ ンおよびグルコソンもまた、エピメラーゼの再活性化に用いることができる。 実験条件： １． dUDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロースおよびdTDP-6-デオキシ-D-キ シロ-4-ヘクスロースの合成（実施例１参照） ２． エピメラーゼの不活性化 インキュベーション混合物：50mM ガラクトース 0.1mM UMP 0.25mg/ml エピメラーゼ 緩衝液： 20mM Hepes-NaOH、pH7.2 1mM ジチオスレイトール 1mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA) 25mM KCl ３０℃で２時間インキュベーションした後、測定されたエピメラーゼの活性は ３％であった。 ３． エピメラーゼの活性化 インキュベーション混合物：160μlの不活性化されたエピメラーゼ 40μlの活性化剤（種々の濃度） エピメラーゼの活性化の結果は、第９図に示されている。試料GおよびHでは、 エピメラーゼの活性は１２８時間にわたって監視された。その結果は、第１０図 に要約されている。 この結果は、エピメラーゼの急速な活性化および長期にわたる活性化が、dUDP -6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロース、およびdTDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘ クスロースの添加によって行えることを示している。不活性化の速度は濃度依存 的であり、そのため、0.1mMの濃度では、依然として混合物中に存在するガラク トースとUMPのために、３２時間後にエピメラーゼの新たな不活性化が観察され る。 実施例７： エピメラーゼが再活性化される場合の、反復バッチ処理法における LacNAcの合成 材料と方法 200mM Hepes-NaOH（1mM DTT、25mM KCl，pH7.2）中に、183mgのUDP-Glc（ナ 46.2gのスクロース（500mM）、1.25UのGalT（0.05U/ml）、5Uのエピメラーゼ（0 .2U/ml）、10Uのスクロースシンターゼ（0.4U/ml）、および25mgのBSAを含んだ ものを、LacNAcの合成に用いた。バッチ中の反応容量は、25mlが１０回と20mlが １回（総容量270ml）であった。それぞれの場合で、合成混合物の250μl（バッ チ混合物11:200μl）（実施例１）（約0.1uMのdUDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘ クスロース）を、エピメラーゼを再活性化するために加えた。YM10膜を持つ、50 mlのア 25mlまで濃縮することを３回行った。最後の濾過の際に、容量を20mlまで減らし 、5mlの基質溶液を加えることによって、それに続く反応を開始させた。基質溶 液を加えたあと、この反応混合物を濾過滅菌した。ろ液は−２０℃で保存した。 インキュベーション時間： ３１−３０時間 インキュベーション温度： ３０℃ 合成過程は、第１１図に描かれている。１１日間にわたり、597mgのGlcNAc（2 .7mmol）が594mgのLacNAc（1.55mmol）に転換され、これは平均収率５７．４％ に 相当する。 実施例８： 生成物の精製：LacNAc １． インベルターゼによるスクロースの分解 母(Sacch．cerevisiae)）を４５℃で２時間プレインキュベーション処理し；^* 生成物溶液1ml当たり10μlのインベルターゼを添加し、^* ４５℃でインキュベーションし、偏光計を用いて定期的に反応を検査し、^* １２０分後に、YM10膜を用いてタンパク質を分離した。ろ液は５つのバッ チに分けた。 ２．）カルシウムカラムを用いた糖の分離 カラム：Ca型のAG50W-X8（5 x 35 cm）、溶出液：２回蒸留水、 流速：0.5ml/分。 試料を加える前に、回転式蒸留装置（20-25mbar、30-35℃）によって、試料を 約30mlまで濃縮した。糖を分離した後、LacNAcを含む画分を取り置いた。 交換クロマトグラフィー カラム：2.6x26.5cm、流速3.5ml/分、溶出液：２回蒸留水 試料のpHを8.5に調整した。LacNAcを含む画分を取り置き、pHを7.0に調整した 。 ４．）Ｐ₂カラムを用いたゲル濾過 水、流速：0.5ml/分。 LacNAcを含む画分を取り置いた。バッチ1‐5を混合した。 ５．）残存するHepesの残留物を、イオン交換クロマトグラフィーによって分離 した（３.を参照）。 ６．）２回ゲル濾過を行うことによって、生成物は高度に脱塩された（４.を参 照）。 ７．）生成物の純度を上げるために、残存するGlcNAcと塩類のある程度を、Caカ ラムを用いて除いた（２.を参照）。 ８．）生成物溶液を回転蒸留器で濃縮し、次いで凍結乾燥した。 合成後の重量： 594mg 精製後の重量： 356mg（59.9%） 実施例９： GalTの種々の受容体および供与体を用いた合成 引き続く合成において、現在のところ、以下の受容体および供与体が、LacNAc サイクルに用いられている。 受容体： dUDP-Glc 供与体： 2-デオキシ-D-グルコース、5-チオ-D-グルコース、グルコース、n-オ クチルグルコピラノシド、n-オクチルチオグルコピラノシド、6-アミ ノヘキシル-N-アセチルグルコサミニド。 供与体を変えて行う。 実験条件：1mM dUDP-Glcによって再活性化されたエピメラーゼとともに、0.05U/ mlのGalTを含む、至適化されたLacNAc混合物。 分析：LacNAcのためのHPLC法 結果： 0.05U/mlのGalTを含む合成において、１７時間後に12.5%のLacNAcが形成され た。 ラクトース類似体の合成 実験条件： 合成混合物： 0.1mMのdTDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロース、および0.1 mg/mlのα-ラクトアルブミンを含む、至適化された合成混合物。 受容体： 2-デオキシグルコース、チオグルコース、グルコース、n-オクチ ルグルコピラノシド、およびn-オクチルチオグルコピラノシド。 対照試料： 受容体を含まない合成混合物 2-デオキシグルコース、チオグルコースおよびグルコースのためのHPLC分析法。 カラム：アミネックスHPX-87Cを85℃で用いた、流速：0.5ml/分 溶出液： ２回蒸留水、 検出器： ａ） 紫外線-可視光 205nm ｂ） キラライザー（chiralyzer） n-オクチルグルコピラノシド、n-オクチルグルコピラノシド、ならびに6-アミ ノヘキシル-N-アセチルグルコサミニドを分析するための、薄層クロマトグラフ ィー法。 展開溶媒：85:12:3（n-プロパノール：HAC：水） スプレー：５０％メタノール硫酸 結果： この結果は、すべての合成においてラクトースが形成されたことを示した。他 の合成法に比べ、グルコースを受容体として用いる本合成法では、実質的により 多くのラクトースが形成される。チオグルコース、n-オクチルチオグルコピラノ シドおよびn-オクチルグルコピラノシドは、それぞれ二糖に転換されたが、2-デ オキシグルコースの転換は今のところ検出されない。 実施例１１： 調製用の合成（preparative syntheses） １． N-オクチル-4-β-D-ガラクトピラノシル-D-グルコピラノシド、および4-0 -β-ガラクトピラノシル-D-2-デオキシグルコースの調製用合成 200mMのHepes-NaOH（1mM DTT、25mM KCl，pH7.2)中、41mgのUDP-Glc（ナトリ 12mgのMnCl₂（1mM）、10.3のスクロース（500mM）、1.2のGalT（0.06U/ml）、4U のエピメラーゼ（0.2U/ml）、8Uのスクロースシンターゼ（0.4U/ml）、6mgのラ クトアルブミン（0.1mg/ml）、および20mgのBSAが合成に用いられた。反応容量 は、20mlが３回（総容量60ml）であった。合成混合物の200ul（実施例１）（約0 .1mMのdTDP-6-デオキシ-D-キシロ-4-ヘクスロース）を、エピメラーゼを再活性 化 た。 インキュベーション時間： 混合物あたり２日間 インキュベーション温度： ３０℃ 生成物の精製： １． N-オクチル-4-β-D-ガラクトピラノシル-D-グルコピラノシド ンタリオ州、カナダ）の５セップパック（Sep-Pack）C-18逆層カラムに通した（ パルシック（Palcic）ら、Glycoconjugate J．5，49-63(1998)）。 カラムの調製： 10mlのメタノールおよび20mlの２回蒸留水でリンスし、試料を 加え、20mlの２回蒸留水でカラムをリンスし、生成物および開始材料を10mlのメ タノールで溶出する。 メタノールを回転式蒸留装置により、３０℃、120mbarで揮発させ、糖類を２ 回蒸留水に溶解した。二糖類は、Ｐ₂カラム（2.6×82 cm、流速：0.5ml/min、２ 回蒸留水）を用いて単糖類から分離した。 重量：58.3mg、収率：21.4% ２． 4-0-β-ガラクトピラノシル-D-2-デオキシグルコース 生成物は、LacNAcの精製と同様にして精製された。N-オクチル-4-b-D-ガラク トピラノシル-D-グルコピラノシドのついて記述したTLC法を分析に用いた（重量 ：53.4mg＝28.7%）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルクアルト，リュディガー ドイツ連邦共和国デー−60389 フランク フルト・アム・マイン，ギュンタースブル クアレー 69 (72)発明者 ツェルフォーセン，アストリッド ベルギー王国ベ−4840 ヴェルケンレー ト，リュー・ドゥ・レグリーズ 24 (72)発明者 エリンク，ローター ドイツ連邦共和国デー−52066 アーヘン, アム・レメルホフ 18ベー (72)発明者 クラ，マリア・レジーナ ドイツ連邦共和国デー−52382 ニーデル ツィーア，ゼルゲンブッシュ 12

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． スクロースシンターゼ、β-1-4-ガラクトシル転移酵素およびウリジン二 リン酸グルコース4'-エピメラーゼ存在下で、糖ヌクレオチドのin situにおける 再生をともなう、単糖およびオリゴ糖を酵素的にガラクトシル化する方法であっ て、ケト糖またはケト糖誘導体を、ウリジン二リン酸グルコース4'-エピメラー ゼの活性化剤として反応混合物に添加する前記方法。 ２． デオキシヌクレオシド二リン酸ケト糖を活性化剤として用いる、請求の範 囲第１項記載の方法。 ３． デオキシウリジン二リン酸-6-デオキシ-D-キシロヘクスロースを活性化剤 として用いる、請求の範囲第２項記載の方法。 ４． デオキシチミジン二リン酸-6-デオキシ-D-キシロヘクスロースを活性化剤 として用いる、請求の範囲第２項記載の処理方法。 ５． ケト糖を活性化剤として用いる、請求の範囲第１項記載の方法。 ６． 6-デオキシグルコソンを活性化剤として用いる、請求の範囲第５項記載の 方法。 ７． ガラクトソンを活性化剤として用いる、請求の範囲第５項記載の方法。 ８． アロソンを活性化剤として用いる、請求の範囲第５項記載の方法。 ９． グルコソンを活性化剤として用いる、請求の範囲第５項記載の方法。 10． 反応混合物中の活性化剤の濃度が、０．０１ｍＭから２０ｍＭである、請 求の範囲第１項から第９項のいずれか１項記載の方法。 11． 反応混合物中の活性化剤の濃度が、０．１ｍＭから１ｍＭである、請求の 範囲第１０項記載の方法。 12． 当該方法が、限外濾過セル内で反復バッチ処理として行われる、請求の範 囲第１項から第１１項のいずれか１項記載の方法。