PT827549E - Processo para a galactosilacao enzimatica de monossacaridos e de oligossacaridos - Google Patents

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DESCRIÇÃO “PROCESSO PARA A GALACTOSILAÇÃO ENZIMÁTICA DE MONOSSACÁRIDOS E DE OLICOSSACÁMDOS” A invenção refere-se a um processo aperfeiçoado para a galactosilação enzimática de monossacáridos e de oligossacáridos sob regeneração in situ “do açúcar do nucleótido” (ou do açúcar de nucleósido difosfaio) em presença de sacarose-sintase, β-Ι-4-galactosiltransferase e uridinodifosfato-glucose-4’-epimerase (UDP-glucose-4’-epúnerase). Sínteses enzimáticas de N-acetil-lactosamina (LacNAc) e os seus derivados com a β-1,4-galactosiltransferase (GalT) [EC 2.4.1.38] são já conhecidas desde há muito tempo (C.H. Wong et al.: J. Am. Chem. Soc. 118, 8137 (1991), J. Org. Chem. 57, 4343 (1992)). Wong et al. (Fig. 1 e 2) desenvolveram sínteses de LacNAc com uma regeneração in situ de UDP-glucose, que tomou desnecessária a utilização estequiométrica do nucleótido-açúcar dispendioso, e necessita em todos os casos 6 enzimas diferentes. O ciclo de LacNAc (Figura 3) reivindicado por Elling et al. (Glycobiology 3, 349 (1993), DE 42 21 595 Cl)) representa uma melhoria em relação aos ciclos até agora conhecidos, na medida em que só se tem de utilizar para a síntese apenas três enzimas em vez de seis, a sacarose-smtase de arroz, a β-1-4--galactosiltransferase e a UDP-glucose-4’-epimerase. Os dissacáridos sintetizados são eductos para outras reacções com diferentes transferases, por exemplo, 2 2

sialiltransfcrascs c fucosiltransfcroses. Os produtos pretendidos finais destas sínteses enzimáticas são Sialil Lewis X e os seus derivados (Ichikawa et al. J. Am. Chem. Soc. 114, 9283 (1992)), cuja significação no reconhecimento célula-célula é objecto de um intenso trabalho de investigação (DcFrccs ct al. J. Am. Chem. Soc. 117, 66 (1995)). A sacarose-sintase [EC 2.4.1.13] (S. Sin.), uma glicosiltransferase largamente difundida especialmente em plantas, cuja função como catalisador para a formação de nucleótido açúcares dentro do metabolismo das plantas foi demonstrada por Avigad (em Loewus et al. (Eds) Encyclopedia of Plant Physiology New Series Vol. 13A, Carbohydrates I, Intracellular Carbohydrates, Springer Verlag, Berlim, 217-347, 1982) resumindo, é apropriada para a síntese de nucleótido e açúcares como UDP-, dTDP-, ADP-, CDP- e GDP-Glc, (EUing et al. Glycobiology 3, 349 (1993)). A purificação da sacarose-sintase de arroz e a sua utilização para a regeneração in situ de UDP-glucose foi descrita por Elling et al. (DE 42 21 595 Cl, Biotechnol, Appl. Biochem. 21, 29 (1994)). A enzima do arroz é uma proteína homotetrâmera com um peso molecular de 362 kDa. A enzima já foi utilizada para a síntese preparativa de dTDP-GLc a partir de dTDP num reactor de membrana de enzima (EMR) por Zervosen et al. (Angew Chem. 106, 592 (1994). A enzima central para a síntese de LacNAc-sintase é a β-Ι-4-galacto-siltransferase, que transfere UDP-galactose para N-acetilglucosamina. Obtém-se N-acetil-lactosamina. Como aceitadores pode ser utilizadas uma série de vários monossacáridos e oligossacáridos. A terceira enzima no ciclo de LacNAc de acordo com Elling et al. 3 (DE 42 21 595 Cl) é a UDP-glucose-4’-epimcrase [E.C. 5.1.3.2.]. A enzima proveniente de Saccharomyces cerevisiae que se pode adquirir na Firma Sigma consiste em duas unidades secundárias a que está fixa solidamente uma molécula NAD mas não covalentemente. (Fucusawa et al. J. Biol. Chcm. 255, 2705 (1980)). Por consequência, esta enzima não necessita de cofactor extemamente adicionado. As propriedades das epimerases de E. coli e leveduras foram descritas por Frey et al. (em D. Dolphin et al (Eds.) Pyridine Nucleotide Coenzymes : Chemical, Biochemical and Medicinal Aspects, Vol. 2B, Wiley, Nova Iorque, 462 - 511). A epimerização realiza-se por oxidação da UDP-glucose com obtenção de UDP-4’-cetopiranose e a sua subsequente redução para obtenção do C-4’-epímero do educto (Figura 4).

Em presença de determinados açúcares, em presença de UMP ou UDP assim como por meio dos substratos UDP-glucose e UDP-galactose consegue-se a inactivação redutora da epimerase (Carmenes et al, Yeast 2, 101 (1986), Nelestuen et al., J. Biol. Chem. 4, 7533 (1971)). Uridinonucleótidos como por exemplo UMP provocam, pela sua ligação à enzima, uma alteração da conformação em que a reantividade de NAD ligado às substâncias redutoras é aumentada. A Epimerase-NADH formada seguidamente possui apenas só 10 - 15 % da actividade da enzima natural (Kalckar et al., Proc. Nat. Ac. Sei. 65,1113 (1970)).

Por causa da inactivação da epimerase, as sínteses enzimáticas até agora descritas de LacNAc com regeneração in situ do nucleótido açúcar atingem apenas um pequeno número de ciclos e, especialmente em substratos não naturais, apenas rendimentos insuficientes. No caso de se querer aumentar os rendimentos em dissacárido ou oligossacárido é indispensável uma dosagem múltipla da epimerase, o que toma a síntese antieconómica. O objectivo da presente invenção é, pelo contrário, proporcionar um processo económico paia a sintcsc cnzimática de dissaeáridos c oligossocáridos, em que se evita a desactivação da UDP-glucose-4’-epimerase. O objectivo é atingido por meio de um processo para a galactosilação enzimática de monossacáridos e de oligossacáridos sob regeneração in situ do nucleótido açúcar em presença de sacarose-sintase, β-Ι-4-galactosil-transferase e uridinodifosfato-glucose-4’-epimerase que se caracteriza pelo facto de se adicionar à mistura reaccional como activador da uridinodifosfato-glucose-4’-epimerase um ceto-açúcar ou um derivado de ceto-açúcar.

Como activador é especialmente apropriado um desoxinucleósido difosfato-cetoaçúcar, de preferência desoxi-uridinodifosfato-6-desoxi-D-xilo--hexulose ou desoxitimidinodifosfato-6-desoxi-D-xilo-hexulose.

Como activador é também apropriado um cetoaçúcar. Preferivelmente utiliza-se 6-desoxiglucosona, galactosona, alosona ou glucosona.

No processo de acordo com a presente invenção, a concentração do activador na mistura reaccional está compreendida entre 0,01 e 20 mM, de preferência 0,1 e 1 mM. O processo de acordo com a presente invenção pode também realizar-se como um processo repetitivo em cargas numa célula de ultrafiltração.

Com o auxílio do processo de acordo com a presente invenção, realiza-se uma reactivação da UDP-gl ucose-4 ’-epimerase, sem que as outras enzimas, sacaiose-sixilase e β-Ι-4-galactosiltransfcrasc sejam influenciadas na sua actividade.

Nos ensaios de estabilidade da UDP-Glc-4’-epimerase verificou-se que a epimerase de levedura é inactivada em presença de UDP-glucose e UDP-galactose (doador para a galactosiltransferase) assim como em presença de diversos aceitadores (Glc, 2-desoxi-glucose, 5-tioglucose, n-octilglucopiranósido). Trata-se neste caso de um problema que geralmente aparece no caso de utilização da epimerase para a regeneração in situ de UDP-galactose. No quadro de outros ensaios, os requerentes conseguiram agora verificar que se podem utilizar especialmente dUDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulose assim como dTDP-6-desoxi-D--xilo-4-hexulose para a reactivação da UDO-Glc-4”epimerase (Figura 5). dUDP- e dTDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulose são formadas sob catálise da dTDP-glucose-4,6-desidratase [EC 4.2.1.46] a partir de dUDP- e dTDP-glucose (Zarkowsky et al. Biol. Chem. 244,4750 (1969)). A dTDP6-desoxi-D-xilo-4-hexulose é um produto intermediário da via de biossíntese da dTDP-L-ramnose. A síntese enzimática e o isolamento desta substância foram descritos por Marumo et al. (Eur. J. Biochem. 204, 539 (1992)). HT JDP-Glc não pode ser adquirida por compra, no entanto, foi sintetizada por Melo et al. (J. Biol. Chem. 240, 398 (1965)) por meio da dTDP-Glc-pirofosforilase a partir de Pseudomonas aerugeriosa em quantidades analíticas. Por utilização do potencial de síntese da sacarose síntase podem preparar-se dUDP- e dTDP-6-desoxi-D-xilo-4--hexulose a partir de dUMP e dTDP (Figura 6).

Em seguida utilizou-se dUDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulose pela primeira vez para a reactivação da epimerase na síntese de N-acetil-lactosamina (LacNAc). /V.

i 6

Seguiu-se a actividaile da epimerase durante um intervalo de tempo de 128 h. Por adição de 1 mM de dUDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulose foi possível atingir uma rápida mas estável activação ao longo dos tempos de observação da epimerase (figura 1U).

Consegue-se uma posterior melhoria do processo reivindicado antes pela utilização do processo de cargas repetitivas (U. Kragl et al., Tetrahedron 4, 1193 - 1202 (1993)). A reacção dos substratos realiza-se nesse caso na presença de sacarose-sintase, galactosintransferase, epimerase e dUDP-6-desoxi-D-xilo-4--hexulose numa célula de ultrafiltração com uma membrana YM10. Depois de efectuada a reacção, filtra-se a solução do produto através de membrana de ultrafíltraçâo, em que as enzimas são retidas. Por adição de solução de substrato fresca, a reacção pode repetir-se várias vezes sem posteriormente adicionar doseadamente enzimas. Desta forma, pode-se utilizar as enzimas naturais para a síntese repetidamente sem imobilização. A reactivação da epimerase garante uma utilização óptima do processo de cargas repetitivas para a síntese rentável de LacNAc e dos seus análogos.

Exemplos:

Exemplo 1 : Síntese de dUDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulose a partir de dUDP-Glc Mistura de síntese: 21,01 mg dUDPGlc (cerca de 10 mM, vide 1.2.4) 1920 μΐ Hepes-NaOH (200 mM, pH 7,2, 1 mM DTT, 500 mM sacarose, 25 niM KC1, 1 mg/ml DSA) 80 μΐ dTDP-D-glc 4,6-desidratase (1,48 U, extracto bruto)

Incubação a 30°C, tempo de incubação : 4 h

Depois de 4 horas não foi possível detectar dUDP-Glc por meio de HPLC (Figura 9). O produto foi utilizado com êxito para a reactivação da epimerase. A síntese de dTDP-6-fdesoxi-D-xilo-4-hexulose realizou-se sob condições de ensaio análogas. Neste caso, foi possível observar uma reacção completa já no fim de 1 hora.

Exemplo 2 : Síntese de dUDP-6-desoxi-D-xilo-6-hexulose a partir de dUMP Mistura de síntese: V = 3 ml 4 mM dUMP (Sal de Na, Sigma*), 4 mM PEP (CHA-Sal, Biomol®), 0,8 mM MgCla, 0,12 mM ATP (Sal de Na, Sigma®), 500 mM sacarose, 6 S. Sin. (2 U/ml), 60 U piruvatoquinase (20 U/ml), 3 U NMPK (1 U/ml), 15 U dTDP-D-glc 4,6-desidratase (5 U/ml).

Tampão : Tris-HCl (100 mM, pH 7,2, 3 mM DTT, 1 mg/ml de albumina de soro de vitela (BSA), 50 mMKCl)

Temperatura de incubação : 25°C

Depois de um tempo de incubação de 4 horas, foi possível observar-se a formação de 69,3 % do produto.

Exemplo 3 : Síntese de LacNAc de acordo com o processo de cargas repetitivas

Por utilização do processo de cargas repetitivas, a produtividade da síntese deve ser aumentada nitidamente. Síntese óptima dc LacNAc :

1 mM UDP-Glc, 1 mM MnCl2, 10 mM GlcNAc, 500 mM sacarose, 0,05 U/ml GalT, 0,2 U/ml epimerase, 0,4 U/ml sacarose sintase, Tampão : 200 mM Hepes-NaOH, pH 7,2, 0,1 % BSA, 1 mM DTT Temperatura de incubação : 30°C

Rendimento: 100 % Número de ciclos : 10

Produtividade: 200 mM*ml/U R-Z-A : 3,8 g/l*d (R-Z-A = Rendimento-Espacial-Temporal)

Mistura de síntese : 1 ml da mistura óptima de LacNAc

Depois de 12 horas a 30°C separaram-se por centrifugação cerca de 750 μΐ da solução do produto por meio de uma Zentricon® YM 10.

Diafiltração dos cerca de 250 μΐ restantes com tampão sem albumina de soro de vitela (BSA). A solução de enzima foi transferida para copos de Eppendorf® e diluída a 1 ml com solução de substrato.

Realiza-se a recolha de amostrasrespechvamenlenomícioeno fim da reacção.

Resultados

Os resultados da Figura 7 mostram que a epimerase, depois de 12 horas de tempo da reacção c de centrifugação sobre a membrana YM10 deixou de ser activa. Como base nestes resultados ensaiou-se mais exactamente a estabilidade da epimerase no sistema tampão utilizado.

Exemplo 4 : Ensaios para determinar a estabilidade da epimerase

Inactivação da epimerase por açúcar em presença de UMP lncubou-se a epimerase no sistema tampão utilizado e seguiu-se a actividade enzimática durante um intervalo de tempo de 8 horas.

Condições do ensaio:

Soluções tampão :

A : 200 mM Hepes pH 7,2,1 mM DTT, 1 mg/ml BSA B : 200 mM Hepes pH 7,2,1 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 500 mM sacarose

Mistura reaccional:

A. Solução tampão A

B. Solução tampão A, 0,1 mM UMP

C. Solução tampão B

D. Solução tampão B, 0,1 mM UMP

com respectivamente 0,25 mg/ml de epimerase Temperatura de incubação : 30°C

Ensaio de actividade : (Fukusawa et al., J. Biol. Chem. 255, 2705 - 2707 (1980)) 893 μΐ de tampão de glicina 100 mM pH 8,8

20 μΐ NAD 5 mM 33.3 μΐ UDP-Gla-desidrogenase (2 U/ml) 33.3 μΐ epimerase Temperatura: 25°C Medição a 340 nm

Resultados A Figura 8 resume os resultados e evidencia que em presença de sacarose ou dos seus produtos de conversão, glucose e frutose e UMP se verifica a inactivação da epimerase.

Exemplo 5 : Inactivação da epimerase em presença de diferentes aceitadores e doadores de GalT

Para experimentar a tese de que a inactivação da epimerase pode verificar-se em muitas utilizações, ensaiou-se a estabilidade da epimerase em presença de diferentes doadores e aceitadores da GalT. Os resultados estão reunidos uo Quadro 1.

Quadro 1 : Actividade Relativa da Epimerase em Presença de Diferentes Doadores e

Aceitadores da GaIT

Tempo de incubação : Doadores: 2 h 7 h 8 h 24 h R P*, UDP-Glc 1 mM pH 7,2 80,7 - 80,7 58,3 137 P*, UDP-Glc 1 mM pH 8,0 83,3 - 67,9 35,5 128 Aceitadores P, GlcNAc 50 mM 93,6 97,5 - - - P, 2-desoxiglc 50 mM 20,7 - - - - P, Glc 50 mM 15,8 - - - - P, Tioglc 50 mM 87,9 34,3 - - - P, n-Octilglucopiranósido 50 mM 86,1 75,6 29,3 - -

P : Hepes-NaOH 200 mM, pH 7,2, DTT 1 mM, BSA 1 mg/ml, KC1 25 mM com UMP 0,1 mM P* : Tampão sem UMP R : Actividade depois da reactivação da epimerase com dTDP-6-desoxi-D-xilo-4--hexulose (c = 0,1 mM)

Os resultados do Quadro 1 evidenciam que em presença de diversos aceitadores da GaIT (Glc, Tioglc, 2-Desoxiglc, n-octilglucopiranósido) em presença de UMP c UDP-Gal ou de UDP-Glc se verifica a inactivação da epimerase. Por consequência trata-se de um problema que geralmente surge no caso da utilização da epimerase para a regeneração in situ de UDP-Gal.

Exemplo 6 : Reactivação da Epimerase

Para a reactivação da epimerase utilizaram-se juntamente com dUDP- e dTDP-6-desoxi-D-4-xilo-hexulose, 6-desoxiglucosona, galactosona, alosona e glucosona.

Condições do ensaio: 1. Síntese de dUDP- e dTDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulose (vide Exemplo 1) 2. Inactivação da epimerase

Mistura reaccional de incubação : galactose 50 mM UMP 0,1 mM Epimerase 0,25 mg/ml

Tampão : Hepes-NaOH 20 mM pH 7,2

Ditiotreitol 1 mM 1 mg/ml de albumina de soro de vitela (BSA)

KC125 mM

Depois de um tempo de incubação de 2 horas a 30°C mediu-se uma actividade da epimerase igual a 3 %. 3. Activação da epimerase

Composição de incubação : 160 μΐ de epimerase inactivada 40 μΐ de activador (diferentes concentrações)

Os resultados da activação da epimerase podem retirar-se da Figura 9. A actividade da epimerase realizou-se nas Amostras G e H durante um intervalo de tempo de 128 horas. Os resultados estão íesuinidos na Figura 10.

Os resultados mostram que, por meio da adição de dTDP- e dUDP-6-desoxi-d-xilo-4-hexulose, se pode conseguir uma activação da epimerase mais rápida e que dura mais tempo. A velocidade de desactivação é dependente da concentração, assim a uma concentração de 0,1 mM já se pode observar ao fim de 32 horas uma mactivação renovada da epimerase por causa da galactose e de UMP ainda existentes na mistura reaccional.

Exemplo 7 : Síntese de LacNAc no processo de cargas repetitivas com reactivação da epimerase Material e Métodos

Utilizam-se 183 mg de UDP-Glc (sal de Na, Sigma®, 1 mM), 597 mg de GlcNAc (10 mM), 46,2 mg de MnCl2 (1 mM), 46,2 g de sacarose (500 mM), 1,25 U de GalT (0,05 U/ml), 5 U de epimerase (0,2 U/ml), 10 U de sacarose-sintase (0,4/ml) e 25 mg de BSA em Hepes-NaOH 200 mM (DTT 1 mM, KC1 25 mM, pH 7,2) para a síntese de LacNAc. O volume da mistura reaccional na carga montou a 10 vezes 25 ml e uma vez 20 ml (volume total : 270 ml). Para a reactivação da epimerase adicionaram-se respectivamente 250 μΐ (mistura da carga 11:200 μΐ) da mistura reaccional de síntese (Exemplo 1) (cerca de 0,1 mM de dUDP-6-desoxi-D--xilo-4-hexulose). Efectuou-se a diafiltração numa célula Amicon® de 50 ml com u /y\ t/ r ^ 14 uma membrana YM10. A mistura reaccional foi completada por três vezes até nm volume de 50 ml com tampão e concentrada a 25 ml. Na última filtração reduziu-se o volume para 20 ml e iniciou-se a reacção subsequente por adição de 5 ml de solução de substrato. A mistura reaccional foi esterilizada por filtração depois da adição da solução de substrato. Armazenou-se o filtrado a -20°C.

Tempo de incubação : 21 - 30 h

Temperatura de incubação : 30°C O decurso da síntese está representada na Figura 11. Em 11 dias fizeram-se reagir 597 mg de GlcNAc (2,7 mmol) para se obter 594 mg de LacNAc (1,55 mmol), o que corresponde a um rendimento médio de 57,4 %.

Exemplo 8 : Purificação do produto : LacNAc 1. ) Desdobramento da sacarose com invertase • 25 000 U/ml de invertase (Sigma®, Sacch. Cerevisiae) foram incubadas em Tampão B (3.3.1) durante 2 horas a 45°C; • Adição de 10 μΐ de invertase / ml de solução de produto • Incubação a 4 5°C e controlo metódico da reaeçãn com o polarímetro • Depois de 120 minutos separou-se a proteína através de uma membrana YM10.

Dividiu-se o filtrado em 5 cargas. 2. ) Separação do açúcar por meio de uma coluna de cálcio

Coluna : AG50W-X8 (5 x 35 cm) na forma de Ca, agente de eluição : água bidestilada,

Caudal : 0.5 ml/min. A amostra foi, depois da adição da amostra, concentrada até cerca de 30 ml em vaporizador de rotação (20 - 25 mbar, 30 - 35°C).

Depois da separação do açúcar rcuniram-sc as fracções que continham

LacNAc. 3.1 Cromatografía de permuta de iões em Dowex® 1 x 2 Cl' (100 - 200 malhas) Coluna : 2,6 x 26,5 cm, caudal, 3,5 ml/min, agente de eluição : água bibestilada

Regulou-se o valor de pH da amostra para 8,5. Reuniram-se as fracções que continham LacNAc e regulou-se o valor de pH para 7,0. 4. ) Filtração em gel com a coluna P2

Coluna : Coluna P2 Biorad®' (2,6 x 82 cm), agente de eluição : água bidestilada, caudal: 0,5 ml/min.

Reuniram-se as fracções que continham LacNAc.

Juntaram-se as cargas 1-5. 5. ) Os restos de Hepes ainda existentes foram separados por uma nova cromatografía de permuta de iões (veja-se 3.) 6. ) O produto foi desmineralizado por meio de duas operações de filtração em gel

7. ) Para aumentar a pureza do produto separou-se uma parte do GlcNAcs ainda existente e do sal por meio de uma coluna de Ca (veja-se 2.)· 8. ) Concentrou-se a solução do produto cm vaporizador dc rotação e em seguida liofilizou-se.

Peso depois da síntese : 594 mg

Peso depois da purificação : 356 mg (59,9 %)

Exemplo 9 : Sínteses com diversos aceitadores e doadores da GalT

No quadro de outras sínteses, utilizaram-se os seguintes doadores e aceitadores no ciclo de LacNAc :

Doadores: dUDP-Glc

Aceitadores : 2-Desoxi-D-glucose, 5-tio-D-glucose, Glc, n-octilglucopiranósido, n-octiltioglucopiranósido, 6-amino-hexil-N-acetilglucosaminida. Variação do doador Condições do ensaio :

Mistura de LacNAc optimizada com 0,05 U/ml GalT com reactivação da epimerase com dUDP Glc 1 mM.

Analítica : Método de HPLC para LacNAc

Resultados:

Na síntese com 0,05 U/ml de GalT formaram-se 12,5 % de LacNAc depois de 17 horas. Síntese de análogos de lactose Condições do ensaio :

Mistura reaccional de síntese : Mistura de síntese optimizada com 0,1 mM de dTDP-6-desoxi-D-xilo-4-hexulose e 0,1 mg/ml de a-lactalbumina

Aceitadores: 2-desoxiglc, tioglc, Glc, n-octilglucopiranósido, n-octiltioglucopiranósido

Amostra em branco : Mistura de síntese sem aceitador

Analítica de HPLC para 2-desoxiglc, tioglc, Glc Coluna : Aminex HPX-87C a 85°C, caudal: 0,5 ml/min Agente eluente : água destilada, Detector : a) UV-Vis 205 nm b) Quiralizador

Analítica DC para n-octilglucopiranósido, n-octilglucopiranósido, 6-amino-hexil-N--acetil-glucosaminida

Agente eluente .85:12:3 (n-propanol : HAC : H20)

Agente pulverizado : H2S04 metanólico a 50 %

Resultados.

Os resultados mostraram que a formação de lactose se tinha verificado em todas as sínteses. Na síntese com Glc como aceitador forma-se nitidamente mais lactose do que nos outros sistemas. Tioglucose, n-octiltioglucopiranósido e n-octil- glucopiranósidu são feitos reagir para sc obter os respectivos dissacáridos, enquanto a reacção de 2-desoxigIc em primeiro lugar não pode ser detectada.

Exemplo 11 : Sínteses preparativas 1. Sínteses preparativas de N-octil-4-P-D-galactopiranosil-D-glucopiranósido e 4-0-P-galactopiranosil-D-2-desoxiglucose

Utilizaram-se 41 mg de UDP-Glc (Sal de Na, Sigma®, 1 mM), 175 mg de n-octilglucopiranósido (açúcar de ,10 mM) ou 97 mg de 2-desoxiglc (fluka®, 10 mM), 12 mg de MnCl2 (1 mM), 10,3 de sacarose (500 mM), 1,2 GalT (0,06 U/ml), 4 U de epimerase (0,2 U/ml), 8 U de sacarose- sintase (0,4 U/ml), 6 mg de lactabulmina (0,1 mg/ml) e 20 mg de BSA para a síntese em Hepes-NaOH 200 mM (DTT 1 mM, KC1 25 mM, pH 7,2). O volume reaccional montou a três vezes 20 ml (volume total : 60 ml). Para a reactivação da epimerase adicionaram-se diariamente 200 μ 1 da mistura reaccional de síntese (Exemplo 1) cerca de dTDP-6-desoxi-D--xilo-4-hexulose 0,1 mM. A diafiltração realizou-se numa célula Amicon® de 50 ml com uma membrana YM10.

Tempo dc incubação : dois dias por mistura reaccional

Temperatura de incubação : 30°C

Purificação do produto 1. n-Octil-4-P-D-galactopirasonil-D-glucopiranósido A solução do produto foi adicionada em fracções (5 fracções) a 5 colunas de fase inversa Sep-Pack C-18 de Waters® (Mississauga, Ont. Canada) (Palcic et al., 19 *

Glycoconjugate J. 5, 49 - 63 (1988)). Preparação das colunas : lavagem com 10 ml de metanol e 20 ml de água bidestilada, adição das amostras, lavagem da coluna com 20 ml de água bidestilada, eluição do produto e do educto com 10 ml de metanol. Eliminou se o metanol em vaporizador de rotação a 30°C e 120 mbar e retomou-se o açúcar em água bidestilada A separação do dissacárido do mnonossacárido realizou-se por meio de uma coluna P2 (2,6 x 82 cm, caudal : 0,5 ml/min, água bidestilada)

Pesagem : 58,3 mg, rendimento : 21,4 %. 2. 4-0-P-Galactopiranosil-D-2-desoxiglucose A purificação do produto fez-se em analogia com a purificação de LacNAc. Utilizou-se para a análise o método de DC descrito para o N-octil-4-P~D--galactopiranosil-D-glucopiranósido. (Pesagem : 53,4 mg, rendimento : 28,7 %).

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a galactosilação enzimática de monossacáridos e OiigOSSacáridus sub legeueração in situ do nuclcótido açúcar em presença de sacarose sintase, β-Ι-4-galactosiltransferase e uridinodifosfato-glucose-4’-epimerase, caracterizado pelo facto de à mistura reaccional se adicionar como activador da uridinodifosfato-glucose-4’-epimerase um açúcar cetónico ou um derivado de açúcar cetónico.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, como activador, se utilizar um desoxinucleósido difosfato-cetoaçúcar.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de, como activador, se utilizar desoxiuridinodifosfato-6-desoxi-D-xilo-hexulose.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de, como activador, se utilizar desoxitimidinodifosfato-6-desoxi-D-xilo-liexulose.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, como activador, se utilizar um cetoaçúcar.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de, como activador, se utilizar 6-desoxiglucosona 9
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de, como activador, se utilizar galactosona.
8. 8. Processo dc acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de, como activador, se utilizar alosona.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de, como activador, se utilizar glucosona.
10. 10. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de a concentração do activador na mistura reaccional estar compreendida entre 0,01 e 20 mM.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a concentração do activador na mistura reaccional estar compreendida entre 0,1 e 1 mM.
12. 12. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo facto de o processo se realizar como um processo de cargas repetitivas numa célula de ultrafiltração. Lisboa, 20 de Dezembro2001