CN114774495A - 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法 - Google Patents
一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法。包括步骤：以胶体几丁质为底物，以几丁质酶为催化剂，生物合成得到N,N‑二乙酰化壳二糖；向N,N‑二乙酰化壳二糖中加入尿苷三磷酸、磷酸根离子、无机离子、Tris‑HCl缓冲液、无机焦磷酸酶，以磷酸化酶和UDP‑GalNAc焦磷酸化酶共固定化酶制剂为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖。本发明中的生物合成方法是以几丁质为原料，再以几丁质酶PbChi70、磷酸化酶和UDP‑GalNAc焦磷酸化酶进行两步催化，实现了尿苷二磷酸‑N‑乙酰氨基葡萄糖的量产。且不需要昂贵辅料ATP的加入，极大地降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及了一种尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，属于生物合成技术领域。
背景技术
糖核苷酸作为功能性糖缀合物和碳水化合物生物合成中的天然糖基供体，参与了对生物体的功能和生存至关重要的过程，也是体外利用Leloir型糖基转移酶合成碳水化合物不可或缺的组成元件。糖核苷酸还可以通过调节作用决定糖蛋白在细胞表面的整体分布。以糖核苷酸为底物合成寡糖和多糖是近年来的研究热点，例如多糖产物中的肝素具有抗凝、抗炎、调节血脂、抗过敏等功效，在治疗哮喘和慢性阻塞性肺病方面具有潜在的应用价值。
尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)作为GlcNAc的活化形式是Leloir型糖基化酶促反应合成生理活性糖链的普遍供体，参与体内的O-GlcNAc循环，也是内膜系统中糖脂、O-连接的GalNAc和N-连接的糖蛋白的前体，帮助内质网和高尔基体的内膜糖基化。UDP-GlcNAc是真核生物内质网中脂质连接寡糖组装所需的第一个糖核苷酸。很多重要的多糖或糖复合物如糖胺聚糖的基本构成单元广泛需要UDP-GlcNAc作为供体。因此研究有效制备UDP-GlcNAc及其衍生物的方法在合成、生物和药物化学中都具有相当重要的意义。
糖核苷酸的合成方法主要包括化学法和酶法合成。由于在有机溶剂中糖核苷酸的溶解度较低，且糖苷键和焦磷酸键不耐水解，加上多糖结构的复杂性，通过化学法合成糖核苷酸十分艰难。化学合成需要用到吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺等许多有机试剂和活化剂，通常包括多步保护基操作和异构体分离，操作过程繁琐、副产物较多、产物纯化困难，不仅会造成环境污染，而且长时间的化学反应可能会导致糖核苷酸的降解，从而降低反应产率。酶法合成利用酶的高效专一的特异性，具有高立体选择性和高区域选择性，能够模拟糖核苷酸的生物合成途径，催化效率高，反应条件温和，对环境十分友好。但是在极端条件下酶的稳定性差，高温或强酸强碱的条件下易失活，游离酶在反应体系中无法回收利用导致生产成本高，这些限制性因素限制了一些酶在工业生产中的应用。中国专利文献CN101230372A公开了一种全细胞生物催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺的方法。该合成方法以果糖、尿苷酸、葡糖胺和磷酸根为底物，以有透性的酵母细胞为载体全细胞催化合成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺。但是该专利通过加入谷氨酰胺利用酵母细胞自身的UDP-GlcNAc代谢途径进行全细胞催化合成的步骤繁杂、中间产物多不易控制、产物得率较低、无法做到酶的重复利用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法。该方法包括一条全新的UDP-GlcNAc合成路径，该路径以几丁质作为原料，在无需ATP的加入下合成UDP-GlcNAc，降低生产成本；并且双酶共固定化合成方法，提高了酶的稳定性，实现了酶的可重复利用，是一种简单高效、经济环保的UDP-GlcNAc及其衍生物的生物合成方法。
本发明的技术方案如下：
一种尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，包括步骤如下：
(1)以胶体几丁质为底物，以几丁质酶PbChi70为催化剂，生物合成得到N,N-二乙酰化壳二糖((GlcNAc)2)；
(2)向步骤(1)得到的N,N-二乙酰化壳二糖中加入尿苷三磷酸、磷酸根离子、无机离子、Tris-HCl缓冲液、无机焦磷酸酶，然后以磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述胶体几丁质的终浓度为0.6～1.0g/L。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述几丁质酶PbChi70的终浓度为0.5～1.5mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述生物合成的反应温度为50～60℃，反应时间40～80min。
进一步优选的，所述生物合成的反应温度为55℃，反应时间为60min。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述几丁质酶PbChi70的制备方法如下：
a、以几丁质酶基因PbChi70为目的基因，以pET-21a(+)为载体质粒，构建重组质粒，然后将重组质粒转化至大肠杆菌中，得到含有几丁质酶基因PbChi70的重组大肠杆菌；
b、选择转化成功的重组大肠杆菌扩大培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，收集菌液后进行破碎和离心，得到上清液；
c、将上清液经分离纯化后，得到几丁质酶PbChi70。
根据本发明优选的，步骤a中，所述几丁质酶基因PbChi70的GenBank登录号为KJ634701.1。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述N,N-二乙酰化壳二糖的终浓度为1～1.2mM。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述尿苷三磷酸的终浓度为1.0～1.5mM。
进一步优选的，所述尿苷三磷酸的终浓度为1.2mM。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述磷酸根离子为KH2PO4或Na2HPO4，所述磷酸根离子的终浓度为1.2～1.5mM。
进一步优选的，将KH2PO4或Na2HPO4溶解于水中配制成缓冲液，所述缓冲液中PO4 3-的总浓度为300mM，pH为7.5，。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述无机离子为镁离子。
进一步优选的，所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为100mM。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述无机焦磷酸酶(PmPPA)的终浓度为0.4～0.8mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的制备方法如下：
1)分别以磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1为目的基因，以pET-21a(+)为载体质粒，构建重组质粒，然后分别将重组质粒转化至大肠杆菌中，得到含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌；
2)选择转化成功的重组大肠杆菌扩大培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，收集菌液后进行破碎和离心，分别得到含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的上清液；
3)将含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的上清液一起加入到阳离子交换树脂中，在4℃，1000rpm/min下孵育2～3h，得到磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂。
根据本发明优选的，步骤1)中，所述磷酸化酶基因Vf.ChbP的GenBank登录号为50536557，所述UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因AGX1的GenBank登录号为6675。
根据本发明优选的，步骤3)中，所述磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂中Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1的酶负载量比为(0.5～2.0)：1；
进一步优选的，所述磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂中磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP的负载量为0.2～1.6mg/g，UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1的负载量为0.2～0.8mg/g，单位：蛋白mg/树脂g。
最优选的，所述Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1的酶负载量比为1：1。
根据本发明优选的，步骤3)中，所述阳离子交换树脂为purolite chromalite MS/C树脂。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述生物合成的反应温度为25～55℃，转速900～1100rpm/min，反应时间40～80min。
进一步优选的，所述生物合成的反应温度为32℃，转速1000rpm/min，反应时间为60min。
本发明的技术特点：
如图1所示，本发明首先以几丁质酶PbChi70为催化剂，催化胶体几丁质生物合成N,N-二乙酰化壳二糖((GlcNAc)2)，然后以磷酸化酶Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1为催化剂，催化N,N-二乙酰化壳二糖((GlcNAc)2)和磷酸根离子得到N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(GlcNAc-1-P)，再加入尿苷三磷酸、无机离子和无机焦磷酸酶，得到尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)。
有益效果：
1、本发明中的生物合成方法是以几丁质为原料，再以几丁质酶PbChi70、磷酸化酶Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1进行两步催化，实现了尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的量产。且不需要昂贵辅料ATP的加入，极大地降低了生产成本。
2、本发明中的磷酸化酶Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1是以共固定化酶制剂的形式参与反应，省去了酶的纯化步骤，提高了酶的pH耐受性和热稳定性，并且共固定化酶的转换数是游离酶的8～12倍，极大地提高了生产效率。
3、本发明中的磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂可以多次重复使用，进一步降低了成本，并且制备方法简单，条件温和、工艺环保，适合推广应用于工业生产。
附图说明
图1：尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)的双酶共固定化合成方法流程图；
图2：游离酶几丁质酶PbChi70、磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1的SDS-PAGE分析结果图；
图3：单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的SDS-PAGE分析结果图；
图4：几丁质酶PbChi70的催化反应活性的TLC检测结果图；
图5：单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂的催化反应活性的TLC检测结果图；
图6：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应活性的HPLC检测结果图；
图中，横坐标为保留时间，纵坐标为电信号强度；
图7：单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂的最佳酶负载量结果图；
图中，横坐标为载体上酶的负载量，纵坐标为相对活性；
图8：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的最佳酶负载量结果图；
图中，横坐标为载体上酶的负载量，纵坐标为相对活性；
图9：单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂的最适pH结果图；
图中，横坐标为pH值，纵坐标为相对活性；
图10：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适pH结果图；
图中，横坐标为pH值，纵坐标为相对活性；
图11：单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂的最适温度结果图；
图中，横坐标为温度，纵坐标为相对活性；
图12：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适温度结果图；
图中，横坐标为温度，纵坐标为相对活性；
图13：单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂的循环利用次数结果图；
图中，横坐标为循环次数，纵坐标为产率；
图14：单独固定的Zbasic2-AGX1固定化制剂的循环利用次数结果图；
图中，横坐标为循环次数，纵坐标为产率；
图15：Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的SDS-PAGE分析结果图；
图16：Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂催化反应活性的HPLC检测结果图；
图中，横坐标为保留时间，纵坐标为电信号强度；
图17：Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最佳负载量之比结果图；
图中，横坐标为载体上酶的负载量之比，纵坐标为相对活性；
图18：Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最适温度结果图；
图中，横坐标为温度，纵坐标为相对活性；
图19：Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的循环利用次数结果图；
图中，横坐标为循环次数，纵坐标为产率。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特殊说明，本发明中所运用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而非限制本发明的保护范围。
实施例中所述purolite chromalite MS/C树脂，苏州汇通色谱分离纯化有限公司有售。
所采用的底物糖类标准品试剂均购自于sigma公司，重组大肠杆菌均为南京金斯瑞生物科技有限公司合成，所用菌株和质粒载体见表1。
表1本发明所用的菌株和质粒载体
本发明所采用的TLC检测方法如下：
硅胶板：TLC Silica gel 60F254硅胶薄层层析板；展开剂：正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1(v:v:v)；染色剂：酸性茴香醛染色液。
本实验用日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，紫外检测器为SPD-20A，色谱柱为YMC-Pack PolyamineⅡ(250×4.6mml)，UDP-Sugar的液相分析程序如表2所示：
表2UDP-Sugar所用HPLC分析程序
实施例1.重组大肠杆菌PbChi70、Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1的表达与单独固定化
1、分别以几丁质酶基因PbChi70、磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1为目的基因，以pET-21a(+)为载体质粒，构建重组质粒PbChi70、Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1，然后分别将重组质粒PbChi70、Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，得到含有几丁质酶基因PbChi70的重组大肠杆菌、含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌。以上重组菌的构建均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
所述几丁质酶基因PbChi70的GenBank登录号为KJ634701.1。所述磷酸化酶基因Vf.ChbP的GenBank登录号为50536557所述UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因AGX1的GenBank登录号为6675。
2、将含有几丁质酶基因PbChi70的重组大肠杆菌、含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌分别接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的30mL LB液体培养基中，37℃，转速为225rpm，活化14h；将活化后的菌液接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的500mL LB培养基中扩大培养，使初始OD600值为0.05；37℃，转速为225rpm，扩大培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，22℃，转速为225rpm，诱导18～20h，测定重组大肠杆菌菌液的OD600值，含有几丁质酶基因PbChi70的重组大肠杆菌、含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值分别为3.1～3.3，3.0～3.2和3.2～3.4。
收集菌液，4℃，转速为9000rpm/min，离心30min，然后将菌体沉淀用Tris-HCl缓冲液(20mmol/L Tris，5mmol/L咪唑，0.5mmol/L NaCl，pH为8.0～8.5)进行重悬，重悬后的菌液进行超声破碎。超声破碎的程序为超声8s，停顿25s，能量15000KJ，振幅40％，有效破碎时间15min。随后用低温高速离心机在4℃、9000rpm/min的条件下离心30min，分别获得含有几丁质酶基因PbChi70的重组大肠杆菌、含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的破碎后上清液。
使用Lysis平衡缓冲液对Ni-Sepharose 6Fast Flow柱进行平衡，流速1mL/min，平衡10个柱体积。将过滤后的含有几丁质酶基因PbChi70的重组大肠杆菌、含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的破碎上清液加到平衡好的Ni-Sepharose 6Fast Flow柱中，流速0.5mL/min，；用洗涤缓冲液洗涤Ni柱以除去杂蛋白，流速1mL/min，洗涤8个柱体积或者直到流出液的A280值达到最低且稳定；用洗脱缓冲液洗脱Ni柱，收集洗脱液，当流出液的A280值陡然上升时开始收集洗脱液，直到A280数值降到最低且稳定时停止收集。收集到的洗脱液用SDS-PAGE进行分析，结果如图2所示，目的蛋白分子量与理论值相符，说明纯化得到了目的蛋白几丁质酶PbChi70、磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1。
所述Lysis平衡缓冲液的组分为50mmol/L NaH2PO4，0.3mol/L NaCl，pH＝8.0。
所述洗涤缓冲液的组分为50mmol/L NaH2PO4，0.3mol/L NaCl，10mol/L咪唑，pH＝8.0。
所述洗脱缓冲液的组分为50mmol/L NaH2PO4，0.3mol/L NaCl，250mol/L咪唑，pH＝8.0。
将含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的破碎后上清液分别加入到阳离子交换树脂purolitechromalite MS/C上，4℃，1000rpm/min，孵育3h，进行单独固定化，得到单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂。孵育结束后取出上清液，用Tris-HCl洗涤树脂，破碎上清液、固定化后的上清液、洗涤液和固定化酶用SDS-PAGE进行分析。结果如图3所示，两种目的蛋白均有选择性地固定到了树脂上。
所述洗涤包括用双蒸水洗涤阳离子交换树脂2次后再用Tris-HCl缓冲液洗涤2次，所述Tris-HCl缓冲液组分为50mM Tris，250mM NaCl，pH8.0。
实施例2.几丁质酶PbChi70的催化反应
制备胶体几丁质：称取4g几丁质粉末，缓慢加入到60mL浓盐酸中，放置在冰上搅拌，搅拌均匀后放在4℃冰箱过夜；向该混合物中加入冰冷的95％乙醇，同时快速搅拌，此时有晶体析出，4℃，在5000g下离心20min，收集沉淀；用双蒸水反复冲洗沉淀直到pH为7.0；最后加入100mL双蒸水制备成4％胶体几丁质溶液。
催化反应：在250μL 4％(w/v)胶体几丁质中加入250μL柠檬酸缓冲液(pH＝5.5)和500μL实施例1中纯化的几丁质酶Pbchi70，55℃水浴反应1h。反应结束后，取出反应液，煮沸5min终止反应，6000rpm/min离心2min，将离心上清液用TLC分析。
催化反应体系中，胶体几丁质终浓度为1.0g/L，几丁质酶PbChi70的终浓度为1mg/mL。
检测结果如图4所示，以N,N-二乙酰化壳二糖((GlcNAc)2)标准品做正对照，反应液中有(GlcNAc)2生成，说明几丁质酶PbChi70具有将胶体几丁质转化为(GlcNAc)2的活性。
实施例3.单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应
1)Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂的催化反应活性测定
将实施例1中制备的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂加入反应体系中，反应体系如表3所示，37℃，1000rpm/min反应1h后，煮沸5min终止反应，室温条件下6000rpm/min离心2min，将离心上清液用0.45μm滤膜过滤后进行TLC分析。
表3单独固定化酶Zbasic2-Vf.ChbP的催化反应体系
TLC结果如图5所示，与负对照相比，反应液中生成了GlcNAc-1-P，说明Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂具有将N,N-二乙酰化壳二糖转化为GlcNAc-1-P的活性。
2)Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应活性测定
将实施例1中制备的Zbasic2-AGX1固定化制剂加入反应体系中，反应体系如表4所示，37℃，1000rpm/min反应1h后，煮沸5min终止反应，室温条件下6000rpm/min离心2min，将离心上清液用0.45μm滤膜过滤后进行HPLC分析。
表4单独固定化酶Zbasic2-AGX1的催化反应体系
HPLC结果如图6所示，反应液中生成了UDP-GlcNAc，说明Zbasic2-AGX1固定化制剂具有将GlcNAc-1-P转化为UDP-GlcNAc的活性。
3)单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最佳酶负载量测定
固定化酶的负载量是指固定在阳离子交换树脂上的蛋白质量除以树脂的质量，也就是加入的破碎上清中蛋白的质量与固定化后上清液中蛋白的质量和两次洗涤液中蛋白的质量之差除以阳离子交换树脂的质量。反应体系如表5所示，每组实验设置三个平行。
表5Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的催化反应体系
结果如图7、8所示，Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最佳酶负载量分别为0.4mg/g和0.5mg/g(蛋白mg/树脂g)。
4)单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适pH测定
反应体系如表5所示，设置六个pH梯度：pH5.5/6.5/7.5/8.5/9.5/10.5，同时用游离酶做对照，比较单独固定化酶和游离酶在不同pH反应条件下的活性差异，每组实验设置三个平行。
结果如图9、10所示，Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适反应pH均为9.5。
5)单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适温度测定
反应体系如表5所示，设置反应温度分别为27℃、32℃、37℃、45℃、55℃，同时用游离酶做对照，比较单独固定化酶和游离酶在不同温度反应条件下的活性差异，每组实验设置三个平行。
结果如图11、12所示，Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的最适反应温度分别32℃和27℃。
6)单独固定的Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂和Zbasic2-AGX1固定化制剂的循环利用次数测定
反应体系如表5所示，按已测得的最适pH和温度进行测定，每组实验设置三个平行。
结果如图13、14所示，Zbasic2-Vf.ChbP固定化制剂重复利用33次后合成UDP-GlcNAc的产率由初始的98％降为61％，Zbasic2-AGX1固定化制剂重复利用19次后合成UDP-GlcNAc的产率由初始的78％降为50％。
实施例4.磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的制备与活性测定
1、Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的制备
取实施例1中的含有目的基因Zbasic2-Vf.ChbP和含有目的基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌破碎上清液，混合后加入到阳离子交换树脂purolite chromalite MS/C上，在4℃，1000rpm/min下孵育3h，进行共固定化。孵育结束后取出上清液，用Tris-HCl洗涤树脂，固定化酶用SDS-PAGE进行分析。
结果如图15所示，固体载体上结合了两种蛋白，与相应蛋白的分子量一致，说明Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化到了树脂上，得到了磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂(Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂)。
2、Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的催化反应活性测定
取步骤1得到的Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，按表6所示的反应体系进行催化反应，37℃反应1h后用HPLC检测。
表6Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的催化反应体系
结果如图16所示，反应生成了UDP-GlcNAc，说明Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂具有合成UDP-GlcNAc的活性。
3、Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最佳酶负载量之比的测定
取步骤1得到的Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，设置Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1的酶量比为1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1，按表6所示的反应体系，37℃反应1h，每组实验设置三个平行，HPLC分析反应产物。
结果如图17所示，Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1的酶量比为1时，UDP-GlcNAc产率最高。
4、Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最适温度测定
取步骤1得到的Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，按表6所示的反应体系进行催化反应，设置反应温度分别为27℃、32℃、37℃、45℃、55℃，同时用游离酶做对照，比较Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂和游离酶在不同温度反应条件下的活性差异，每组实验设置三个平行。
结果如图18所示，Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂在27～55℃时UDP-GlcNAc产率保持在80％以上，在32℃时UDP-GlcNAc产率最高，所以Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的最适温度为32℃。
5、Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的循环利用次数测定
取步骤1得到的Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，按表6所示的反应体系进行催化反应，一次反应结束后回收利用Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，进行新一轮循环，每组实验设置三个平行。
所述催化剂的重复利用具体为：
取出反应后的Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂，用Tris-HCl缓冲液(50mM Tris，250mM NaCl，pH＝8.0)进行洗涤，然后再次加入反应底物进行生物合成。
结果如图19所示，Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂共循环利用28次，平均UDP-GlcNAc产率为80.5％。说明本发明中的磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂可以多次重复使用，进一步降低了成本，并且制备方法简单，条件温和、工艺环保，适合推广应用于工业生产。
Claims (10)
1.一种尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)以胶体几丁质为底物，以几丁质酶PbChi70为催化剂，生物合成得到N,N-二乙酰化壳二糖；
(2)向步骤(1)得到的N,N-二乙酰化壳二糖中加入尿苷三磷酸、磷酸根离子、无机离子、Tris-HCl缓冲液、无机焦磷酸酶，以磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖。
2.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胶体几丁质的终浓度为0.6～1.0g/L。
3.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述几丁质酶PbChi70的终浓度为0.5～1.5mg/mL。
4.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物合成的反应温度为50～60℃，反应时间40～80min；
进一步优选的，所述生物合成的反应温度为55℃，反应时间为60min。
5.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述几丁质酶PbChi70的制备方法如下：
a、以几丁质酶基因PbChi70为目的基因，以pET-21a(+)为载体质粒，构建重组质粒，然后将重组质粒转化至大肠杆菌中，得到含有几丁质酶基因PbChi70的重组大肠杆菌；
所述几丁质酶基因PbChi70的GenBank登录号为KJ634701.1；
b、选择转化成功的重组大肠杆菌扩大培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，收集菌液后进行破碎和离心，得到上清液；
c、将上清液经分离纯化后，得到几丁质酶PbChi70。
6.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤(2)中，所述N,N-二乙酰化壳二糖的终浓度为1～1.2mM；所述尿苷三磷酸的终浓度为1.0～1.5mM；所述磷酸根离子为KH2PO4或Na2HPO4，终浓度为1.2～1.5mM；所述无机离子为镁离子；所述Tris-HCl缓冲液的终浓度为100mM；所述无机焦磷酸酶的终浓度为0.4～0.8mg/mL。
7.如权利要求6所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，所述尿苷三磷酸的终浓度为1.2mM；所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM。
8.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤(2)中，所述磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂的制备方法如下：
1)分别以磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1为目的基因，以pET-21a(+)为载体质粒，构建重组质粒，然后分别将重组质粒转化至大肠杆菌中，得到含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌；
所述磷酸化酶基因Vf.ChbP的GenBank登录号为50536557，所述UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因AGX1的GenBank登录号为6675；
2)选择转化成功的重组大肠杆菌扩大培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG进行诱导，收集菌液后进行破碎和离心，分别得到含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的上清液；
3)将含有磷酸化酶基因Zbasic2-Vf.ChbP的重组大肠杆菌和含有UDP-GalNAc焦磷酸化酶基因Zbasic2-AGX1的重组大肠杆菌的上清液一起加入到阳离子交换树脂中，在4℃，1000rpm/min下孵育2～3h，得到磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂。
9.如权利要求8所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤3)中，所述磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂中Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1的酶负载量比为(0.5～2.0)：1；所述阳离子交换树脂为purolite chromalite MS/C树脂；
进一步优选的，所述磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP和UDP-GalNAc焦磷酸化酶Zbasic2-AGX1共固定化酶制剂中磷酸化酶Zbasic2-Vf.ChbP的负载量为0.2～1.6mg/g，UDP-GalNAc焦磷酸化酶AGX1的负载量为0.2～0.8mg/g，单位：蛋白mg/树脂g；
最优选的，所述Zbasic2-Vf.ChbP和Zbasic2-AGX1的酶负载量比为1：1。
10.如权利要求1所述的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生物合成的反应温度为25～55℃，转速900～1100rpm/min，反应时间40～80min；
进一步优选的，所述生物合成的反应温度为32℃，转速1000rpm/min，反应时间为60min。
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