KR100260097B1 - 베타-갈락토시데이즈를 이용한 락토사민의 제조방법 - Google Patents

베타-갈락토시데이즈를 이용한 락토사민의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비피도박테리움(B. bifidum) 유래의 β-갈락토시데이즈를 그 자체 혹은 나일론 파우더에 고정화 상태로 이용하여, 고수율로 락토사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum)으로부터 유래한 β-갈락토시데이즈를 이용하고, 락토스, 갈락토실 플루오라이드(galactosylfluoride), 파라나이트로페닐 β-D-갈락토피라노사이드(PNPG) 또는 갈락토스를 당 공여체로, N-아세틸 글루코사민(glcNAc)을 당 수용체로 사용하여, 전기 효소에 의한 전이반응에 의하여 목적물인 갈락토스 β1-4글루코낙을 합성한다. 또한, 전기 β-갈락토시데이즈를 재이용할 수 있도록 나일론 6(nylon 6) 파우더에 고정화한 컬럼(column)과 활성탄 컬럼을 연결시킨 연속식 공정에 의해서도 제조가 가능하다. 본 발명의 β-갈락토시데이즈를 이용하면, 종래의 방법에 비하여 갈락토스 β1-4글루코낙을 경제적이고도 용이하게 합성할 수 있으며, 이렇게 제조된 갈락토스 β1-4글루코낙의 갈락토실 β1-4(gal β1-4) 구조는 의약품 원료나 당단백질 당쇄에 관한 연구용 시약으로 유용하게 사용될 것이다.

Description

β-갈락토시데이즈를 이용한 락토사민의 제조방법
본 발명은 β-갈락토시데이즈를 이용한 락토사민의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 비피도박테리움(B. bifidum) 유래의 β-갈락토시데이즈를 그 자체 혹은 나일론 파우더에 고정화 상태로 이용하여, 고수율로 락토사민을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 생체세포의 표면에 존재하는 특이적 탄수화물들은 바이러스-숙주 반응, 항원-항체 반응과 같은 세포-세포의 상호작용, 염증을 일으키는 반응들, 그리고 종양과 같은 이상세포들이 전이될 때 세포들간의 유착(adhesion) 현상에 중요한 역할을 하며, 이들은 세포 표면의 단백질 또는 지방질과 공유 결합된 상태로 존재한다.
이러한 탄수화물 유도체로서 관심의 대상이 되는 락토사민 구조(lactosamine unit, Gal β1-4GlcNAc)는 인체내의 여러 부위의 종양에서 발견되는 항원이나 혈액의 구성성분 뿐만 아니라, 독소와 병원체들이 부착하는 수용기(receptor)들에 존재하는 N-당단백질(N-glycoprotein)의 전형적인 구조이다. 특히, 이들 종양이 인체에서 퍼지는 기작과 관련지어 볼 때, 종양부위에서 발견되는 이 구조가 세포의 유착 작용 또는 전이에 의해 혈액으로 들어온 후, 종양과 함께 몸전체로 퍼지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이와 같은 유착이 되는 부위를 발견하고, 이 부위에 있는 탄수화물과 유사한 물질을 투여함으로서 유착작용을 방해할 경우, 전기 탄수화물 유사물질은 의약품으로서의 이용이 가능하다.
이와 같은 당복합체에 이용되는 당질이 중요성이 널리 인식됨에 따라, 당질을 화학합성하거나 혹은 그 자체를 약리활성이 있는 화합물과 결합시켜 당질의 기능을 이용하는 새로운 의약품을 개발하기 위한 시도가 많이 행하여지고 있다. 그러므로, 이러한 관점에서 필요한 기능을 가진 당질을 설계하여 그것을 자유롭게 합성하는 기술이 필요하다.
상술한 바와 같이, 생체내에서 당질 복합체로서 존재하는 탄수화물들이 생리작용을 조절하고 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려짐에 따라, 이들에 대한 연구와 관심이 증가하게 되었다. 한편, 이들은 자연계에 매우 소량 존재하여, 실제 연구를 위하여 필요한 양 만큼 자연계로부터 얻는 것이 어렵기 때문에, 화학적 방법에 의해 합성하고자 하는 많은 시도가 있어 왔다. 그러나, 계속되는 노력에도 불구하고 당질 복합체의 효율적인 화학합성은 당질 구조자체에 함유된 비슷한 반응성을 가진 수산기(OH)들 때문에 아직도 개선의 여지가 많다고 볼 수 있다. 즉, 원하는 위치에 선택적인 결합을 시키기 위하여, 원하지 않는 위치에 존재하는 수산기(OH)에 보호기를 결합하여 반응에 참가하지 못하도록 한 후, 반응이 끝나면 다시 보호기를 떼어내야 하는 복잡한 단계들을 거쳐야 하므로, 생성물의 수율이 낮고, 원하는 α, β-아노머(anomer) 형태로 합성하기가 어렵다는 점이 문제점으로 대두되었다. 따라서, 화학합성법의 빠른 진보에도 불구하고, 탄수화물 유도체의 화학 합성은 아직도 난제로 남아 있다.
이러한 문제들을 해결하기 위한 하나의 수단으로, 효소들의 월등한 입체특이성(stereospecificity)과 위치 특이성(regioselectivity)을 이용하여, 온화한 조건 하에서 이들의 촉매반응에 의하여 탄수화물 유도체를 합성하는 효소합성 방법이 소개되었다. 일반적으로, 이러한 탄수화물 유도체의 효소합성에는 글라이코시데이즈(glycosidase)와 글라이코실트랜스퍼레이즈(glycosyltransferase)가 널리 이용되고 있다. 글라이코실트랜스퍼레이즈를 이용하는 경우에는, 원하는 결합을 가진 물질들을 대량생산할 수 있는 장점은 있으나, 기질로서 이용이 되는 슈가 뉴크레오타이드(sugar nucleotide)가 비싸고, 실제로 이용할 수 있는 글라이코실트랜스퍼레이즈의 종류가 적다는 단점이 있다. 한편, 일반적으로 가수분해 효소로 알려진 글라이코시데이즈를 이용하는 경우에는, 상대적으로 저렴한 비용으로 반응 조건만 잘 조절할 경우, 탄수화물 유도체를 합성할 수 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 락토사민(lactosamine) 합성에 있어서는, 갈락토스(galactose) 잔기를 글루코사민(glucosamine) 잔기에 β1-4 형태로 특이적 결합을 시키는 문제가 반드시 해결되어야 할 과제로 대두된다.
화학합성법에 의한 락토사민의 합성에 대해서는, 레뮤(Lemieux) 등은 락탈(lactal)에 아세틸(acetyl)을 결합시킨 후, 아지도나이트레이션(azidonitration) 반응에 의해 또는 옥심(oxime)을 C-2에 도입하는 방법을 제시하였고(참조:Lemieux et al., Chem. Abstr., 90, 877846, 1979; Can. J. Chem., 60, 63, 1982), 또한 아조디카복실레이트(azodicarboxylate)의 사이클로에디션(cycloaddition)(참조:Toepfer et al., Carbohydr. Res., 247, 159, 1933)이나 아이오도슐폰아미데이션(iodosulfonamidation)(참조:Danishefsky et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 8331 1992), 아이도아세톡시레이션(iodoacetoxylation)(참조:Lafont et al., Carbohydr. Res., 297, 117, 1997) 등의 반응에 의해 이들의 합성이 시도되었다.
한편, 효소에 의한 β-갈락토사민의 합성에 대해서는, β1-4 갈락토실트렌스 퍼레이즈(β1-4 galactosyltransferase)를 이용하여 직접 UDP-갈락토스(UDP-galactose)와 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)을 합성하거나(참조:Brew et al., Biochemistry, 59, 491, 1968), 또는 UDP-갈락토스를 다른 효소들에 의해 재생시켜 기질로서 계속 이용하는 경우(참조:Wong et al., J. Org. Chem., 57, 4343, 1992; J. Am. Chem. Soc., 113, 6300, 1991)와 UDP-글루코스(UDP-glucose)를 에피머레이즈(epimerase)에 의해 UDP-갈락토스로 전환시켜 이를 공여체로 락토사민을 합성한 경우(참조:Theime et al., Synthesis, January, 141, 1992; J. Am. Chem. Soc., 115, 2536, 1993) 등이 소개되어 있다. 아울러, 글라이코시데이즈를 이용한 경우에는, 대장균(E. coli)이나 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae) 등의 그 유래가 다른 β-갈락토시데이즈를 이용하여, 수여체의 아노메릭(anomeric) 탄소에 여러 종류의 반응기를 치환한 것을 사용하여 원하는 결합을 가진 물질들을 합성하였다(참조:Nilsson, Carbohydr. Res., 188, 9, 1989). 특히, 바실러스 서큐런스(B. circulans) 유래의 β-갈락토시데이즈를 촉매로 하여 락토스를 공여체로, 글루코사민을 수용체로 하여 락토사민을 합성할 수 있음이 보고되었다(참조:Sakai et al., J. Carbohydr. Chem., 11, 553, 1992).
이에, 본 발명자들은 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum)에서 유래한 β-갈락토시데이즈를 효소 그 자체 또는 나일론 파우더에 고정화된 상태로, 전이활성을 이용하여, 갈락토스 β1-4글루코낙(galβ1-4glcNAc)을 경제적이고도 효율적으로 합성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum) 유래의 β-갈락토시데이즈를 효소 그 자체 또는 나일론 파우더에 고정화된 상태로 이용하여, 연속식 반응에 의해 고수율로 락토사민을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
제1도는 본 발명의 β-갈락토시데이즈를 이용한 락토사민의 제조과정을 나타내는 그림이다.
제2도는 본 발명에서 컬럼에 의한 락토사민의 연속식 제조방법을 개략적으로 나타내는 그림이다.
제3도는 본 발명에 의해 제조된 생성물의 HPLC 분석결과를 나타내는 크로마토그램이다.
제4도는 본 발명에 따른 생성물의 활성탄 컬럼 분석 결과이다.
제5도는 나일론 파우더에 효소를 고정화시키는 공정을 개략적으로 나타내는 그림이다.
제6도는 δ0-190ppm에서의 락토사민(실시예 1, 2, 3)의13C NMR 스펙트럼이다.
제7도는 δ0-0.6ppm에서의 락토사민(실시예 1, 2, 3)의1H NMR 스펙트럼이다.
본 발명의 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum)으로부터 유래안 β-갈락토시데이즈를 이용하여 락토사민을 제조하는 방법에 있어서, 락토스, 갈락토실 플루오라이드(galactosylfluoride), 파라나이트로페닐 β-D-갈락토피라노사이드(PNPG) 또는 갈락토스를 당 공여체로, N-아세틸 글루코사민(glcNAc)을 당 수용체로 하여, 효소에 의한 전이반응에 의하여 목적물인 갈락토스 β1-4글루코낙을 합성할 수 있다(참조:제1도). 이때, PNPG와 갈락토실 플루오라이드를 용해시키기 위한 용매로는, β-갈락토시데이즈의 활성을 저해하지 않는 유기용매인 트라이에틸 포스페이트를 사용한다. 또 다른 락토사민의 제조방법으로는 전기 β-갈락토시데이즈를 재이용할 수 있도록 나일론 6(nylon 6) 파우더에 고정화한 컬럼(column)과 활성탄 컬럼을 연결시킨 연속식 공정에 의해서도 가능하다. 본 발명에 따른 갈락토스 β1-4글루코낙의 제조방법은, 종래의 β-갈락토시데이즈를 사용한 반응에 비하여 경제적이고도 용이하게 합성할 수 있으며, 이렇게 제조된 갈락토스 β1-4글루코낙의 갈락토실 β1-4(galβ1-4) 구조는 의약품 원료나 당단백질 당쇄에 관한 연구용 시약으로 유용할 것이다.
본 발명의 갈락토스 β1-4글루코낙의 제조방법에 있어서, 갈락토스 β1-4글루코낙의 분석 조건은 다음과 같다:
1. HPLC 분석
HPLC 분석:영린 M920 펌프, UV 모니터 M 720(215nm)
칼럼:Asahipak NH2P-50(200mm×5mm)
이동상:아세토나이트릴:물=85:15(v/v)
이동상 유속:1ml/min
2. 활성탄 분석
LC:영린 M 920
칼럼:Econo 칼럼(Bio-Rad), 활성탄(Wako:031-02135)
이동상:에탄올:물=35-40%:65-60%
페놀-황산분석:
시료(0.01ml)+페놀(0.01ml)+황산(1ml)
흡광도 측정:490nm
3. NMR 분석
NMR 분석기:Bruker-500AMX(1H, 499.82MHz;13C, 125.68MHz)
용매:D2O
내부 표준물:TSP
이하 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
갈락토실 플루오라이드(galactosylfluoride) 300mg 또는 p-나이트로페닐 β-D-갈락토피라노사이드(PNPG) 300mg을 당 공여체로 하고, N-아세틸 글루코사민 600mg을 당 수용체로 하여, 이들을 각각 트라이에틸 포스페이트(triethyphosphate) 0.3㎖와 초산 완충용액(50mM, pH 5.1) 1.45㎖에 용해시켰다. 이것에 β-갈락토시데이즈(2.5units, 0.25㎖)를 첨가하여 37℃에서 10시간 반응시켰다. 이때, β-갈락토시데이즈는 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum:DSM 20456)을 브리그 배지(Briggs liver broth:pH 6.8, 조성은 배지 1리터당 네오펩톤 15g, 이스트 익스트랙트 6g, 글루코스 20g, 가용성 스타치 0.5g, 트윈 80 1g, 시스테인/염화수소 0.2g, 토마토 쥬스 400㎖, 간즙 75㎖ 및 증류수 505㎖)에서 7일간 혐기성 배양한 배양액 4℃에서 30분간 6,000rpm으로 원심분리하여 수득한 상층액 내에 100units/㎖(1unit는 1분 동안 p-나이트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드에서 p-나이트로페놀 1mmol을 분리시키는 효소의 활성단위)의 활성단위로 함유되어 있는 바, 이를 1/10로 희석하여 사용하였다. 그런 다음, 반응을 정지시키기 위하여 효소를 열에 의해 불활성화하여 원심분리하고, 반응액을 활성탄 칼럼(55g)을 이용하여 0-40% 에탄올 농도구배로 용출시켜 용매를 제거하고 112mg의 갈락토스 β1-4글루코낙을 제조하였다.
[실시예 2]
락토스 500mg과 아세틸 글루코사민 1g을 초산 완충액(50mM, pH 5.1) 0.7㎖에 용해시킨 다음, 이 용액에 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum) 유래와 β-갈락토시데이즈(30 units, 0.3ml)를 첨가하여 37℃에서 10시간 반응시켰다. 효소를 열에 의해 불활성화시키고 원심분리한 다음, 반응액을 활성탄 칼럼(55g)에서 0-40%에탄올 농도구배로 용출시켜 용매를 제거하고, 85mg의 갈락토스 β1-4글루코낙을 제조하였다.
[실시예 3]
먼저, 나일론 파우더에 고정화시킨 비피도박테리움 비피도(B. bifidum) 유래의 β-갈락토시데이즈(3 units/g) 47.5g(습중량)을 채운 컬럼과 활성탄 컬럼(30g)을 직렬로 연결하였다. 이어, N-아세틸 글루코사민(6g)과 갈락토스(4g)를 초산완충액(50mM, pH 5.1) 40ml에 용해시킨 다음, 이 용액을 0.1ml/분 속도로 페리스탈틱 펌프(peristaltic pump)를 이용하여 5일간 순환시켰다. 그런 다음, 활성탄 컬럼을 물로 세척하고, 35% 에탄올 농두구배로 용출시켜 갈락토스 β1-4글루코낙을 함유한 분획을 얻었다. 이어, HPLC 아미노컬럼(NH2column)에서 아세토나이트릴(CH3CN):물(H2O)=85:15(v/v)로 분리하여, 이 중 59mg의 갈락토스 β1-4글루코낙을 제조하였다.
제3도는 생성물 갈락토스 β1-4글루코낙의 HPLC에 의한 분석결과를 나타내는데 피크 1은 PNPG를, 피크 2는 N-아세틸 글루코사민을, 피크 3은 갈락토스 β1-4글루코낙을 각각 나타낸다. 제4도는 활성탄 컬럼을 0-40% 에탄올 농도구배로 용출시 용출되는 분획 크로마토그램을 나타내며, 이 때 피크 1은 갈락토스 β1-4글루코낙의 용출을, 피크 2는 갈락토스 β1-4글루코낙의 용출을 각각 나타낸다(실시예 1, 2). 컬럼을 이용한 연속식 제조방법과 나일론 파우더에 효소를 고정화시키는 공정은, 당업계에서 널리 공지된 방법을 사용하였으며, 제2도와 제5도에 각각 나타내었다(실시예 3). 제2도는, N- 아세틸 글루코사민과 갈락토스를 함유한 용액은 페리스탈틱 펌프를 이용하여, 고정화효소 컬럼과 활성탄 칼럼을 순차적으로 통과하여 갈락토스 β1-4글루코낙을 생성할 수 있게 한 공정을 나타낸다. 제5도는, TFB(triethyloxonium tetrafluoroborat)를 이용하여 나일론 파우더를 알킬레이션 시킨 후 PEI(polyethyleneimine)와 결합시키고, 이 나일론-PEI 혼성중합체에 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)를 스페이서로 하여 β-갈락토시데이즈를 부착시킨, 나일론 파우더에 고정화된 효소를 제조하는 과정을 나타낸다. 제6도는 δ0-190ppm에서의 갈락토스 β1-4글루코낙(실시예 1, 2, 3)의13C NMR 스펙트럼으로서, 각 피크들은 갈락토스 β1-4글루코낙의 해당 구조를 나타낸다. 제7도는 δ0-0.6ppm에서의 갈락토스 β1-4글루코낙(실시예 1, 2, 3)의1H NMR 스펙트럼이다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum) 유래의 β-갈락토시데이즈를 효소 그 자체 또는 고정화된 상태로 이용하여 고수율로 락토사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 β-갈락토시데이즈를 이용하면, 종래의 방법에 비하여 갈락토스 β1-4글루코낙을 경제적이고도 용이하게 합성할 수 있으며, 이렇게 제조된 갈락토스 β1-4글루코낙의 갈락토실β1-4(gal β1-4) 구조는 의약품 원료나 당단백질 당쇄에 관한 연구용 시약으로 유용하게 사용될 것이다.

Claims (3)

  1. 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum) 유래의 β-갈락토시데이즈를 이용하여 갈락토스, 갈락토실 플루오라이드, p-나이트로페닐 β-D-갈락토피라노사이드 및 락토스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 당 공여체와 당 수용체인 N-아세틸 글루코사민을 반응시키는 공정을 포함하는 갈락토스 β1-4글루코낙의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 당 공여체로 갈락토실 플루오라이드 또는 p-나이트로페닐 β-D-갈락토피라노사이드를 사용시, β-갈락토시데이즈에 친화적인 트라이에틸 포스페이트를 용매로 사용하는 것을 특징으로 하는 갈락토스 β1-4글루코낙의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum) 유래의 β-갈락토시데이즈를 나일론 6(nylon 6) 파우더에 고정화한 컬럼과 활성탄 컬럼을 연결하여 연속식 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 갈락토스 β1-4글루코낙의 제조방법.
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