CN111778295A - 一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法 - Google Patents
一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111778295A CN111778295A CN201910270699.6A CN201910270699A CN111778295A CN 111778295 A CN111778295 A CN 111778295A CN 201910270699 A CN201910270699 A CN 201910270699A CN 111778295 A CN111778295 A CN 111778295A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phospholipase
- immobilized
- solution
- free
- phosphatidylserine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 55
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 102000011420 Phospholipase D Human genes 0.000 claims abstract description 109
- 108090000553 Phospholipase D Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 51
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 37
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 claims abstract description 31
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 9
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 7
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 35
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 12
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 12
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 7
- 229940057847 polyethylene glycol 600 Drugs 0.000 claims description 6
- -1 silica compound Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 5
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 4
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 3
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006096 Attention Deficit Disorder with Hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 208000036864 Attention deficit/hyperactivity disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910003944 H3 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- IWLXWEWGQZEKGZ-UHFFFAOYSA-N azane;zinc Chemical compound N.[Zn] IWLXWEWGQZEKGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000001354 calcination Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001027 hydrothermal synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000010406 interfacial reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
- C12Y301/04004—Phospholipase D (3.1.4.4)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，该方法包括以下步骤：（1）以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体，固定游离磷脂酶D得到固定化的磷脂酶D；（2）以步骤（1）中得到的固定化的磷脂酶D为纳米生物催化剂，先将L‑丝氨酸与CaCl2在25℃水溶液中混合搅拌至溶液澄清，再加入已溶解于乙酸丁酯的底物磷脂酰胆碱，置于温度35～55℃恒温摇床400rpm反应制备磷脂酰丝氨酸,反应结束后过滤回收固定化磷脂酶D重复使用。本发明方法中固定化的磷脂酶D的酶负载量可达到150mg/g载体，转酯率达到96.4％。固定化的磷脂酶D温度及pH稳定性得到提高，可以重复性能好，有效降低工业化生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生化科技技术领域，特别是一种用高活性及稳定性的固定化磷脂酶D作为生物催化剂制备合成磷脂酰丝氨酸的方法。
背景技术
近年来，随着人们对磷脂类物质的深入研究，越来越明确地意识到了磷脂的药用价值和营养价值，并将它广泛应用到了食品、药物及保健品等领域。以磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine ,PS )为例，它是一种重要的磷脂物质，通常位于细胞膜内层，是细胞膜的重要组成部分，能参与一系列膜功能反应。尤其在人体的神经系统中，磷脂酰丝氨酸（PS）是大脑细胞膜的重要组份之一，因其对改善记忆力、缓解压力、修复大脑损伤、治疗儿童多动症以及预防老年痴呆症等作用效果明显而市场需求量很大，故制备纯度高、质量好的磷脂酰丝氨酸产品具有重要意义。目前常用的磷脂酰丝氨酸（PS）的制备方法主要有提取法与酶转化法两种，其中：提取法主要是从动物大脑组织中提取得到PS；酶转化法是利用磷脂酶D（PLD）催化卵磷脂的转酯反应制备得到PS。由于后者反应条件温和、过程简单且绿色环保而为公认的制备PS的理想方法。其中涉及的磷脂酶D（PLD），是一种磷脂水解酶(EC3.1.4.4 )，除具有催化磷脂的水解，释放磷脂酸( PA )和醇残基的功能外，还具有催化转磷脂酰反应的功能。
由于由磷脂酶D催化的磷脂酞转移反应是一个油-水两相之间的界面反应，磷脂酶D溶解在水相中，通过搅拌与油相中的反应底物在两相界面之间接触促使反应发生，所以，酶在两相界面之间分布的越多，越能够提高反应速率。但由于磷脂酶D是水溶性的酶，与有机溶剂接触时容易聚集结块，甚至失活，故会导致反应速率下降。因此，如何才能够促使磷脂酶D向有机相靠拢而又不会造成酶活力损失、以提高转磷脂酰的反应速率，是目前业界普遍关心、正在探索和急需攻克的一大难题。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中所存在的问题，提供一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法。
本发明用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，特征在于所述的固定化生物催化剂由以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体、固定游离磷脂酶D，制备得到的高活性及稳定性的固定化的磷脂酶D充任，该方法包括如下步骤：
（1）以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体，固定游离磷脂酶D，制备得到固定化的磷脂酶D，步骤如下；
（1a）载体准备：将ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸入到含有阴离子交联剂的水溶液中，30分钟后，将样品从溶液中取出并用蒸馏水洗涤，以除去水中的游离交联剂，得到吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物；
（1b）游离磷脂酶D溶液制备：将磷脂酶D粉末加入乙酸钠缓冲液中，混合物保持搅拌15分钟，然后在25℃下离心10分钟收集上清液，得到游离磷脂酶D溶液；
（1c）游离磷脂酶D的固定化：将吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸泡在游离磷脂酶D溶液中20～30小时，温度保持在15℃，之后取出样口品，并用去离子水和乙酸钠缓冲溶液洗涤样品，再将样品储存在4℃下冰箱中，得到固定化的磷脂酶D；
（2）以步骤（1）中得到的固定化的磷脂酶D为生物催化剂，先将L-丝氨酸与CaCl2加入到25℃水溶液中混合搅拌至溶液澄清，再加入已溶解于乙酸丁酯的底物磷脂酰胆碱，置于温度35～55℃恒温摇床 400rpm反应0.5～2h，制备得到磷脂酰丝氨酸，反应结束后过滤回收固定化磷脂酶D以重复使用。
其中：
步骤（1a）中所述的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体为小于8mm3的颗粒状载体；
步骤（1a）中所述的阴离子交联剂为聚乙二醇600，含有聚乙二醇600的水溶液浓度为10mg/ml；
步骤（1b）中所述的游离磷脂酶D溶液为浓度为1～5mg/ml的游离磷脂酶D溶液；
步骤（1b）中所述的乙酸钠缓冲液为20ml的100mM、pH 6.0～8.0的乙酸钠缓冲液；
步骤（1c）中所述的游离磷脂酶D溶液为10ml、pH 6.0～8.0的游离磷脂酶D溶液；
步骤（2）中所述的固定化的磷脂酶D的用量为0.1～0.3mg/ml反应体系；
步骤（2）中使用的L-丝氨酸的浓度为20mM, CaCl2的浓度为15mM,L-丝氨酸与CaCl2加入的体积比为10：1；
步骤（2）中所述的已溶解在乙酸丁酯中的磷脂酰胆碱浓度为6mM,使用的乙酸丁酯与L-丝氨酸的体积比为1:1；
所述固定游离磷脂酶D的载体还包括ZnO纳米线/大孔二氧化硅复合载体、ZnO纳米线/介孔二氧化钛复合载体、ZnO纳米线/分子筛MCM复合载体、ZnO纳米线/分子筛SBA复合载体。
此外，所述的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体的制备方法可参考李雪飞等人的报道（李雪飞，尚传洋，张瑞丰.ZnO纳米线／大孔SiO2复合物的制备及吸附性能[J].复合材料学报,2014,31(6):1490-1496），制备步骤如下：
采用Zn（Ａc）2、聚乙二醇600、Ｈ2Ｏ三元混合溶液作为前驱物，通过100～２00 ℃温度范围内的两阶段加热使Zn（Ａc）2水解，再经过高温煅烧使ZnO晶种在介孔二氧化硅孔壁上形成；以锌氨络合物为锌源，在90℃下热分解后生成的Zn（OH）2沉积在孔道中，并在100℃下利用水热合成原位制备ZnO纳米线，通过改变三元前驱物组分用量以调节ZnO晶种的尺寸与分布，进而控制纳米线的形貌，最终获得直径为15～20nm的ZnO纳米线，其以无规线团形貌均匀填充于三维孔道中。
基于上述构思的本发明用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，由于采用了ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物作为载体，固定游离磷脂酶D，确保制备得到的固定化的磷脂酶D具有较的高活性及稳定性，并以此作为合成磷脂酰丝氨酸的催化剂，极大地提高了工作可靠性及合成效率，而且固定化的磷脂酶D用过后还可以回收、重复利用，在确保合成产品质量的同时，还显著降低了生产成本，为实现PS大规模工业化生产提供了技术保障；而且在实践中证明，本发明将游离PLD固定在ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合载体上，固定化的PLD的负载量会随着pH7.0的游离PLD浓度的增加而增加，当游离PLD浓度达到4.0mg/ml时，负载量最大值可达150mg/g；经过固定化的PLD的酶活可达到172.3U/mg蛋白质，并且固定化后的PLD较游离酶相比展现出了更好的温度和pH稳定性；.固定化的PLD可高效的用于从PC催化合成PS，PS转化率在50℃、pH7.0条件下40分钟内达到96.4％；固定化的PLD具有相当好的重复性能，经过15次循环后，重复使用后PS转化率仍保持在85.6％。所以，本发明的方法科学且合理，反应条件温和、过程简单且绿色环保，可操作性强，解决了现有技术中的一大难题，有很强的实用性和可贵的经济性。
附图说明
图1是本发明实施例中PLD的浓度对固定化酶负载量的影响关系示意图；
图2是本发明实施例中反应时间对生物催化合成PS的影响关系示意图；
图3是本发明实施例中反应温度对生物催化合成PS的影响关系示意图；
图4是本发明实施例中反应pH对生物催化合成PS的影响关系示意图。
具体实施方式
下面结合典型实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：固定化磷脂酶D的制备
（1）将ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合载体切成小颗粒（小于8mm3），将载体浸入含有10mg/ml阴离子交联剂（聚乙二醇600）的水溶液中，30分钟后，将样品从溶液中取出并用蒸馏水洗涤三次以除去水中的游离交联剂。
（2）将磷脂酶D粉末加入到20ml的100mM、pH6.0～8.0乙酸钠缓冲液中，混合物保持搅拌15分钟，然后通过离心收集上清液，制备得到不同浓度的PLD溶液（1～5mg/ml）。
（3）将吸附有聚乙二醇600的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸泡在10ml、pH6.0～8.0游离PLD溶液中20～30小时，温度保持在15℃，之后，用去离子水和乙酸钠缓冲溶液洗涤样品，在4℃下储存在冰箱中供下一步实验使用。
实施例2：固定化酶负载量测定
为了测定实施例1中所述的固定化磷脂酶中PLD的负载量，酶液中蛋白含量用Bradford法检测，用牛血清蛋白作为标准蛋白，绘制蛋白浓度与吸光度的标准曲线；测定用于反应初始游离PLD蛋白浓度C1（mol/ml），固定化反应结束后体系中的PLD蛋白浓度C2（mol/ml），用于洗涤样品的缓冲溶液中的PLD蛋白浓度C3（mol/ml）；反应体系初始体积V1（ml），用于洗涤样品的缓冲液体积V2（ml），所用复合载体质量为M（g），则单位载体酶负载量为：
负载量（mg/g）=
实验结果如图1所示，在固定化反应过程中当游离PLD浓度为1-4mg/ml时，酶负载量随PLD浓度增加快速上升，负载量高达150mg/g载体；当PLD浓度超过4mg/ml时，酶的负载量不再继续上升基本保持稳定。
实施例3：游离PLD和固定化PLD的酶活测定
为了便于实验，以本发明的PLD的水解活性来确定其活性，按照类似于D'Arrigo等人（P. D'Arrigo, V. Piergianni, D. Scarcelli, S. Servi, A spectrophotometricassay for phospholipase D, Anal. Chim. Acta 304 (1995) 249–254.）描述的过程，测定405nm下PLD从对磷脂酰对硝基苯酚（PpNP）中释放出来的硝基苯酚。酶活反应体系由50μl底物溶液（10mM pH7.0 Tris/HCl中含有10mM PpNP，5％Triton X-100，5mM SDS），400μl的0.1M pH5.5乙酸钠缓冲液（含有20mM CaCl2），和50μl游离 PLD酶。在30℃温育10分钟后，加入100μl的 1M pH7.0 Tris/ HCl（含有0.1M乙二胺四乙酸）缓冲液终止反应。固定化PLD酶的活性测量与游离PLD酶在相同条件下进行，以25mg（湿重）固定化PLD开始反应，且反应体系保持搅拌状态，在分光光度读数之前通过从反应混合物分离固定化的PLD结束反应。本发明磷脂酶D的水解活性定义为：单位时间内1分钟释放出1.0mmol的对硝基苯酚为一个酶活单位U。
当反应体系中加入的固定化PLD为实施例2中酶负载量达到最大值时的固定化PLD时，测得PLD酶活高达172.3U/mg蛋白质。
实施列4：反应时间对生物催化合成PS的影响
在双相体系中进行从PC合成PS的转酯反应。先将50μl20mM L-丝氨酸与CaCl2在25℃100mM pH7.0水溶液中混合搅拌至溶液澄清，再加入50μl6mM已溶解于乙酸丁酯的底物磷脂酰胆碱，50μl游离PLD或25mg（湿）如实施1所述方法制备的固定化PLD，分别置于45℃恒温摇床 400rpm反应2h制备磷脂酰丝氨酸。
对催化反应时间的研究是必要的，因为它会有助于确定获得最高产量所需的最短时间，从而提高生产成本。图2显示了PC在相同实验条件下，分别以游离PLD和固定化PLD的催化过程中，产生PS的转化率与反应时间的关系。当反应时间超过80分钟，在游离PLD的催化下，PS转化率达到70.4％且不再增加。而使用固定化PLD催化可以有效提高PS转化率，反应仅60分钟，PS转化率达到最高为95.2％。
检测方法：
采用高效液相色谱法检测产物及底物，取反应体系中一定量有机相作为样品。
样品预处理：
1 .将含10μl样品的1ml离心管置于60℃烘箱或使用吹风机吹干；
2 .在步骤1中离心管中加入400μL流动相；
3 .将步骤2中离心管上下颠倒混匀3min；
4 .吸取步骤3中液体，有机滤头过滤，进样分析。
色谱条件：
流动相：正己烷/异丙醇/H2O/H3PO4( 45:48:7.5:1.5 ,V/V )
柱子：汉邦Si-100正相硅胶柱
柱温：25℃
紫外检测波长：206nm
流速：1ml/min
PS的出峰时间为3.71min，PC的出峰时间为15.07min。
实施列5：反应温度对生物催化合成PS的影响
以游离PLD和固定化PLD为催化剂分别设置7组与实施例4中相同的催化体系，仅将恒温摇床的反应温度设置为梯度温度：35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，1h后结束反应并分别取样检测。
图3显示了PS转化率随反应温度变化的情况。在所有温度范围内，由固定化PLD催化合成PS的效率比游离PLD高得多。游离PLD最适反应温度为45℃，固定化PLD为55℃，该固定化PLD显示出比游离酶的更好的热稳定性。在游离的PLD催化反应中，当温度高于45℃PS转化率迅速下降，而固定化的PLD即使在65℃时，转化率仍高达80.2％。因此，与游离PLD相比，固定化PLD即使在高温下活性损失较低。
实施列6：反应pH对生物催化合成PS的影响
以游离PLD和固定化PLD为催化剂分别设置7组与实施例4中相同的催化体系，仅将100mM水溶液pH依梯度改为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0，恒温摇床的反应温度均改为50℃，1h后结束反应并分别取样检测。
实验结果如图4所示。游离PLD的最佳pH值为6.0，最高PS产率为70.5％，而固定的PLD的最佳pH值移到7.0，PS转化率高达96.4％。结果还表明固定化的PLD与游离PLD相比，在更宽的pH范围内具有更好的适应性。
实施列7：固定化PLD的重复性
将实施例4中反应结束后体系中的固定化PLD过滤出来，用pH7.0乙酸钠缓冲清洗三次，加入新的微量缓冲，L-丝氨酸，CaCl2含6mM PC的乙酸丁酯进行催化，检测发现其可以在双相中循环使用15次仍能保持85.6％左右的转酯率。
上述实施例有助于本领域的技术人员更好地理解本发明，但应当理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
Claims (10)
1.一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于固定化生物催化剂由以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体、固定游离磷脂酶D，制备得到的固定化的磷脂酶D充任，该方法包括如下步骤：
（1）以ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物为载体，固定游离磷脂酶D，制备得到固定化的磷脂酶D，步骤如下；
（1a）载体准备：将ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸入到含有阴离子交联剂的水溶液中，30分钟后，将样品从溶液中取出并用蒸馏水洗涤，以除去水中的游离交联剂，得到吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物；
（1b）游离磷脂酶D溶液制备：将磷脂酶D粉末加入乙酸钠缓冲液中，混合物保持搅拌15分钟，然后在25℃下离心10分钟收集上清液，得到游离磷脂酶D溶液；
（1c）游离磷脂酶D的固定化：将吸附有阴离子交联剂的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体浸泡在游离磷脂酶D溶液中20～30小时，温度保持在15℃，之后取出样口品，并用去离子水和乙酸钠缓冲溶液洗涤样品，再将样品储存在4℃下冰箱中，得到固定化的磷脂酶D；
（2）以步骤（1）中得到的固定化的磷脂酶D为生物催化剂，先将L-丝氨酸与CaCl2加入到25℃水溶液中混合搅拌至溶液澄清，再加入已溶解于乙酸丁酯的底物磷脂酰胆碱，置于温度35～55℃恒温摇床 400rpm反应0.5～2h，制备得到磷脂酰丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（1a）中所述的ZnO纳米线/介孔二氧化硅复合物载体为小于8mm3的颗粒状载体。
3.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（1a）中所述的阴离子交联剂为聚乙二醇600，含有聚乙二醇600的水溶液浓度为10mg/ml。
4.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（1b）中所述的游离磷脂酶D溶液为浓度为1～5mg/ml的游离磷脂酶D溶液。
5.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（1b）中所述的乙酸钠缓冲液为20ml的100mM、pH 6.0～8.0的乙酸钠缓冲液。
6.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（1c）中所述的游离磷脂酶D溶液为10ml、pH 6.0～8.0的游离磷脂酶D溶液。
7.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（2）中所述的固定化的磷脂酶D的用量为0.1～0.3mg/ml反应体系。
8.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（2）中使用的L-丝氨酸的浓度为20mM, CaCl2的浓度为15mM,L-丝氨酸与CaCl2加入的体积比为10：1。
9.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于步骤（2）中所述的已溶解在乙酸丁酯中的磷脂酰胆碱浓度为6mM,使用的乙酸丁酯与L-丝氨酸的体积比为1:1。
10.根据权利要求1所述的用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于所述固定游离磷脂酶D的载体还包括ZnO纳米线/大孔二氧化硅复合载体、ZnO纳米线/介孔二氧化钛复合载体、ZnO纳米线/分子筛MCM复合载体、ZnO纳米线/分子筛SBA复合载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910270699.6A CN111778295A (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910270699.6A CN111778295A (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111778295A true CN111778295A (zh) | 2020-10-16 |
Family
ID=72754881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910270699.6A Pending CN111778295A (zh) | 2019-04-04 | 2019-04-04 | 一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111778295A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114088898A (zh) * | 2021-11-02 | 2022-02-25 | 大连理工大学 | 一种制备药物代谢酶-多孔材料复合物的方法及应用 |
| CN114774495A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-07-22 | 山东大学 | 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法 |
| CN115029331A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-09-09 | 中国海洋大学 | 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000077183A1 (en) * | 1999-06-15 | 2000-12-21 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Enzymatic preparation of phospholipids in aqueous media |
| WO2012051341A1 (en) * | 2010-10-13 | 2012-04-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Hydrothermal process for enhanced stability of mesoporous nanoparticles |
| CN103966277A (zh) * | 2014-05-22 | 2014-08-06 | 南京工业大学 | 一种固定化磷脂酶d催化制备磷脂酰丝氨酸的方法 |
| CN109486790A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-03-19 | 南通励成生物工程有限公司 | 一种以磷脂酶d转化制备磷酯酰丝氨酸的方法 |
-
2019
- 2019-04-04 CN CN201910270699.6A patent/CN111778295A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000077183A1 (en) * | 1999-06-15 | 2000-12-21 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Enzymatic preparation of phospholipids in aqueous media |
| WO2012051341A1 (en) * | 2010-10-13 | 2012-04-19 | Regents Of The University Of Minnesota | Hydrothermal process for enhanced stability of mesoporous nanoparticles |
| CN103966277A (zh) * | 2014-05-22 | 2014-08-06 | 南京工业大学 | 一种固定化磷脂酶d催化制备磷脂酰丝氨酸的方法 |
| CN109486790A (zh) * | 2018-12-10 | 2019-03-19 | 南通励成生物工程有限公司 | 一种以磷脂酶d转化制备磷酯酰丝氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李雪飞等: "ZnO纳米线/大孔SiO2复合物的制备及吸附性能" * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114088898A (zh) * | 2021-11-02 | 2022-02-25 | 大连理工大学 | 一种制备药物代谢酶-多孔材料复合物的方法及应用 |
| CN114774495A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-07-22 | 山东大学 | 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法 |
| CN114774495B (zh) * | 2022-04-21 | 2024-05-14 | 华熙唐安生物科技(山东)有限公司 | 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖的双酶共固定化合成方法 |
| CN115029331A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-09-09 | 中国海洋大学 | 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 |
| CN115029331B (zh) * | 2022-07-29 | 2024-01-30 | 中国海洋大学 | 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111778295A (zh) | 一种用固定化生物催化剂合成磷脂酰丝氨酸的方法 | |
| JP4279351B2 (ja) | 架橋タンパク質結晶処方物、およびその有機溶媒中での触媒としての使用 | |
| JP2599789B2 (ja) | 水―不溶性グルコースイソメラーゼ結晶およびその製造法 | |
| CN104004002B (zh) | 一种由青霉素发酵液直接制备6-氨基青霉烷酸的方法 | |
| CN103966277B (zh) | 一种固定化磷脂酶d催化制备磷脂酰丝氨酸的方法 | |
| CN111662898A (zh) | 一种脂肪酶固定化新技术及其应用于对映体拆分的方法 | |
| CN103555807B (zh) | 一步酶法制备7-氨基头孢霉烷酸并获得α-氨基己二酸的方法 | |
| Ou et al. | Lipase from pseudomonas cepacia immobilized into ZIF-8 as bio-catalyst for enantioselective hydrolysis and transesterification | |
| JP2678341B2 (ja) | 固定化リパーゼ | |
| CN104480181A (zh) | 3-去乙酰基-7-氨基头孢烯酸的制备方法 | |
| CN102517361A (zh) | 脂肪酶催化合成熊果苷的方法 | |
| CN114438072A (zh) | 一种海藻糖的生产方法 | |
| RU2475538C2 (ru) | Фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на твердом носителе, способ иммобилизации фермента, биокатализируемый проточный реактор и способ очистки симвастатина | |
| JP2002095471A (ja) | 固定化リパーゼ、リパーゼの基質特異性向上方法及び光学分割反応方法 | |
| CN106701699B (zh) | 一种生物催化剂及其制备方法和应用 | |
| Babaei et al. | Use of mesoporous MnO2 as a support for immobilization of lipase from Candida rugosa | |
| CN100519564C (zh) | 头孢拉定的制备方法 | |
| CN108753755A (zh) | 一种交联生物酶催化剂及其应用 | |
| Silva et al. | Organofunctionalized silica gel as a support for lipase | |
| RU2626964C1 (ru) | Гетерогенный катализатор жидкофазного окисления органических соединений | |
| AU2019203362B2 (en) | Monolithic cellulose acetate column, its enzyme reactor, preparation method and application | |
| KR102307780B1 (ko) | 디아이소노닐 아디페이트 합성용 고정화 리파아제, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 디아이소닐 아디페이트 제조방법 | |
| KR101644939B1 (ko) | 효소의 고정화 방법 및 이에 의한 고정화 효소 | |
| Hrydziuszko et al. | Screening of lipase carriers for reactions in water, biphasic and pure organic solvent systems | |
| CN111647634A (zh) | 一种填充床连续流不对称合成(S)-1-Boc-3-氨基哌啶的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20221205 Address after: 201403 floor 2, building 3, No. 4, Lane 1515, Huifeng North Road, Fengxian District, Shanghai Applicant after: Shanghai Yunluo Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 226133 East of Room 101, Building B2, No. 188, Linjiang Avenue, Linjiang Town, Haimen City, Nantong City, Jiangsu Province Applicant before: NANTONG HOUYUAN BIOLOGY TECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20201016 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |