JPH10248560A - 固定化酵素及びトレハロースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 酵素反応中の微生物汚染による副次的生物反
応を抑制出来る高温でのトレハロースの製造に使用可能
な酵素とこの酵素を利用するトレハロースの製造方法を
提供すること。 【解決手段】 マルトースホスホリラーゼ及びトレハロ
ースホスホリラーゼをイオン交換樹脂、例えば、フェノ
ール系陰イオン交換樹脂に吸着させた固定化酵素であっ
て、ｐＨ７、６０℃で６０分間の加熱後に未加熱処理酵
素組成物に対して９０％以上のトレハロース生成活性を
有する固定化酵素。この固定化酵素を無機燐酸および／
または無機燐酸塩の存在下、少なくともマルトースを含
む溶液に接触させるトレハロースの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はマルトースホスホリ
ラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼをイオン交換樹
脂に固定化した固定化酵素組成物、およびこの固定化酵
素組成物を用いるトレハロース（Ｏ−α−Ｄ−glucopyr
anosyl−（１→１）−Ｄ−glucopyranoside)の新規な製
造方法に関する。さらに詳しくは、フェノールを基本骨
格とする親水性の陰イオン交換樹脂に吸着させて耐熱性
を強化した固定化マルトースホスホリラーゼと固定化ト
レハロースホスホリラーゼの組成物、およびこの固定化
酵素組成物を無機燐酸および／または無機燐酸塩の存在
下でマルトースを含有する溶液に作用させるトレハロー
スの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、凍結あるいは乾燥時に
細胞や酵素などの蛋白質などの細胞内外物質を保護安定
化する作用を有しており、医薬、化粧品、食品などの保
存、安定化剤としての役割が期待されている物質である
為、工業的に本物資を生産する為の多くの試みがなされ
てきた。これらの技術は大別して三つに分類する事が出
来る。その一つはトレハロースを菌体内に蓄積する性質
を有する微生物から該物質を抽出精製する方法である
[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ
ー(J.Am.Chem.Soc.)７２巻、２０５９頁、１９５０年、
ドイツ特許第２６６５８４号、特開平３−１３００８４
号、特開平５−９１８９０号、特開平５−１８４３５３
号、特開平５−２９２９８６号] 。この方法は、微生物
の培養工程、微生物の分離工程、微生物からのトレハロ
ースの抽出工程、抽出したトレハロースの精製結晶化工
程から構成されており製造工程が煩雑である。しかも、
トレハロースの生産性も他の方法に比較して低いばかり
でなく、再利用が困難な多量の微生物抽出残差が廃棄物
として発生する事から経済的に効率の良い方法とは言え
なかった。

【０００３】また、他の方法として、トレハロースを菌
体内（培地中）に生産する微生物が検索され、ブレビバ
クテリウム（Brevibacterium) 属やコリネバクテリウム
(Corynebacterium) 属等の微生物を培養してトレハロー
スを菌対外に生産させる発酵法が開発されている（特開
平５−２１１８８２号）。しかしながら、本方法におい
てもトレハロースの培地中への蓄積率は約３％（ｗ／
ｖ）程度と低収率である事から工業的規模でトレハロー
スを大量生産する為には大容量の発酵槽とそれに見合う
精製設備が必要であり経済的に問題がある。しかも、本
方法においても精製したトレハロースを得る為には除菌
操作が必要とされるばかりでなく、培養時に使用菌株が
生産するトレハロース以外の夾雑物あるいは培地成分等
の除去に煩雑な工程を必要としている。

【０００４】一方、これらの発酵法の種々の問題点を一
挙に解決する方法として酵素法がすでに開発されてい
る。これには、微生物由来のマルトースホスホリラーゼ
（Maltose:orthophosphate β-D-glucosyltransferas
e) と藻類由来のトレハロースホスホリラーゼ(Treharos
e:orthophosphate β-D-glucosyltransferase) を無機
燐酸塩存在下でマルトースに作用させてトレハロースを
得る方法 (特許第１５１３５１７号、Agric.Biol.Che
m., ４９巻、２１１３頁、１９８５年）、および細菌由
来のシュークローズホスホリラーゼ（Sucrose:orthopho
sphate α-D-glucosyltransferase) と担子菌由来のト
レハロースホスホリラーゼ（Trehalose:orthophosphate
α-glucosyltransferase) を無機燐酸塩とグルコース
イソメラーゼの存在下で蔗糖に作用させてトレハロース
を得る方法（平成６年度日本農芸化学会大会講演要旨
集、３Ｒａ１４）とが報告されている。さらには特開平
６−１８９７７９号に記載されているように、α−グル
コース １−燐酸塩とグルコースの混合物に担子菌由来
のトレハロースホスホリラーゼを作用させてトレハロー
スを得る方法等が報告されている。

【０００５】これらの方法によれば、マルトースあるい
は蔗糖から６０〜７０％の高い収率でトレハロースが得
られると報告されている。さらに、この方法は使用する
原料が高度に精製された高純度の糖質である事から、酸
素反応により得られるトレハロースの精製も容易であ
り、他の方法に比較して工業的に有利な方法と考えられ
ている。

【０００６】しかしながら、これらの方法において使用
される酵素、特にトレハロースホスホリラーゼの供給源
はユーグレナやマイタケなどのように藻類や担子菌であ
り、これらから酵素を生産するためには経済的な問題ば
かりでなく技術的にも困難な点があった。しかも、得ら
れるトレハロースホスホリラーゼやこれに組み合わせて
用いられるシュークロースホスホリラーゼやマルトース
ホスホリラーゼはそれぞれの酵素の至適ｐＨ領域が大き
く異なるために組み合わせて使用する際のｐＨ管理が非
常に困難である。そればかりではなく、これらの酵素
は、温度に対する安定性も非常に低く、トレハロースの
生成反応は２５〜３７℃程度の低温下でしか行えなかっ
た。この事は開放型の反応槽を用いて行われる酵素反応
時に雑菌汚染が起こることを示唆しており、これによる
副次的な反応を防止するために厳密な衛生管理を必要と
する等の欠点を有している。さらに、これらの酵素の有
する基質濃度依存性の為に高濃度の原料が使用出来なか
った。この為、これらの方法も経済的に効率の良い方法
とは言えなかった。

【０００７】また、これらの問題点を解決する為に耐熱
性の酵素の検索が行われた結果、特開平８−１３１１６
６号に記載されているように高温での酵素反応が可能な
トレハロースホスホリラーゼが新たに見いだされた。し
かし、併用されるマルトースホスホリラーゼが従来既知
の耐熱性の低い酵素であった為に高温での併用は不可能
であった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
上記方法の欠点を克服すべく製造および精製が容易で高
い温度安定性を有し、しかも、基質濃度依存性の低いマ
ルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラ
ーゼを新たに検索した（特開平８−１３１１５７号、特
開平８−１３１１８２号）。そして、これらの酵素をト
レハロースの工業生産に既に使用している。しかし、こ
れらの酵素を用いても反応中の微生物汚染に起因するｐ
Ｈ低下などの副次的な生物反応を完全に抑制する事は困
難であった。

【０００９】また、これらの方法とは異なる観点から新
規酵素の検索が行われ、澱粉部分加水分解物の還元性末
端をトレハロース構造に変換するトレハロース合成酵素
および還元末端にトレハロース構造を有する非還元性の
糖質からトレハロースを遊離するトレハロース切り出し
酵素が見いだされトレハロースの工業生産に既に使用さ
れている（特開平７−１４３８７６号、特開平７−２１
３２８３号、特開平７−３４９２１６号）。本方法によ
れば、これら二種の酵素とイソアミラーゼやプルラナー
ゼ等の澱粉枝切り酵素とを併用して澱粉液化液に作用さ
せる事により高収率でトレハロースが得られるとの事で
ある。しかし、使用される酵素の耐熱性が低い為にｐＨ
低下などの酵素反応中の微生物汚染による副次的な生物
反応の抑制は困難であると予想される。

【００１０】そこで、本発明の目的は、酵素反応中の微
生物汚染による副次的生物反応を抑制出来る高温でのト
レハロースの製造に使用可能な酵素を提供することにあ
る。より詳しくは、高温下、例えば、４０℃以上、好ま
しくは５０℃以上でも活性を維持できるように熱安定化
させたマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホス
ホリラーゼを提供することにある。さらに本発明の目的
は、酵素反応中の微生物汚染による副次的生物反応を抑
制しつつトレハロースを製造できる方法を提供すること
にある。加えて本発明の目的は、トレハロースを結晶と
して得た後に得られる分蜜液の再利用が可能なトレハロ
ースの製造方法を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、工業的に
使用する為のマルトースホスホリラーゼおよびトレハロ
ースホスホリラーゼの具備すべき諸性質を改変すべく鋭
意検討した。その結果、以下の本発明に到達した。

【００１２】本発明は、マルトースホスホリラーゼ及び
トレハロースホスホリラーゼをイオン交換樹脂に吸着さ
せた固定化酵素であって、ｐＨ７、６０℃で６０分間の
加熱後に未加熱処理酵素組成物に対して９０％以上のト
レハロース生成活性を有することを特徴とする固定化酵
素に関する。さらに好ましくは本発明は、マルトースホ
スホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼをフェノ
ール系陰イオン交換樹脂に吸着させたことを特徴とする
固定化酵素に関する。加えて本発明は、上記固定化酵素
を無機燐酸および／または無機燐酸塩の存在下、少なく
ともマルトースを含む溶液に接触させる特徴とするトレ
ハロースの製造方法に関する。

【００１３】

【発明の実施の態様】本発明の固定化酵素は、マルトー
スホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼをイ
オン交換樹脂に吸着させた固定化酵素である。マルトー
スホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼは、
プレシオモナス（Plesiomonas)属ＳＨ−３５株（生命研
条寄第５１４４号）由来の酵素であることが好ましい。
さらに本発明の固定化酵素は、ｐＨ７、６０℃で６０分
間の加熱後に未加熱処理酵素組成物に対して９０％以上
のトレハロース生成活性を有する熱安定化された固定化
酵素である。例えば、上記ＳＨ−３５株由来の酵素でマ
ルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラー
ゼをフェノール系陰イオン交換樹脂に吸着させて固定化
した酵素は、上記熱安定性を有する。

【００１４】上記フェノール系陰イオン交換樹脂として
は、例えば、フェノール・ホルマリン縮合重合体または
フェノール・ホルマリン・ポリアミン化合物縮合重合体
であって、かつ３級アミンを官能基として有する弱塩基
性を有する陰イオン交換樹脂を挙げることができる。上
記フェノール・ホルマリン縮合重合体及びフェノール・
ホルマリン・ポリアミン化合物縮合重合体は、フェノー
ル及びホルマリン、またはフェノール、ホルマリン及び
ポリアミン化合物を主成分として含むもであり、酵素に
対する吸着性や熱安定性等を阻害しない範囲であれば、
これらの成分以外の重合成分を含むものであってもよ
い。また、イオン交換樹脂の粒子径、粒度分布、比表面
積、細孔容積、ポア径、塩基性の程度等も適宜決定でき
る。

【００１５】イオン交換樹脂へのマルトースホスホリラ
ーゼ及びトレハロースホスホリラーゼの吸着量は、加燐
酸分解反応でのマルトースホスホリラーゼ（Ａ）とトレ
ハロースホスホリラーゼ（Ｂ）との活性の組成比（Ａ／
Ｂ）が、例えば、０．２５〜２の範囲となるように選択
することが、高いトレハロース生成速度が得られるとい
う観点から好ましい。

【００１６】本発明の固定化酵素は、イオン交換樹脂の
少なくとも一部または全部の粒子にマルトースホスホリ
ラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼの両方が吸着し
たものであることができる。または、マルトースホスホ
リラーゼを吸着したイオン交換樹脂粒子とトレハロース
ホスホリラーゼを吸着したイオン交換樹脂粒子の混合物
であることもできる。

【００１７】前者の固定化酵素は、マルトースホスホリ
ラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼを独立に（順
次）または一緒にイオン交換樹脂と接触させることで製
造することができる。また、後者の固定化酵素は、マル
トースホスホリラーゼをイオン交換樹脂と接触させて得
られる固定化マルトースホスホリラーゼと、トレハロー
スホスホリラーゼをイオン交換樹脂と接触させて得られ
る固定化トレハロースホスホリラーゼとを混合すること
で製造することができる。特に前者の場合、二種の酵素
が含まれている培養液濃縮物もしくはその部分精製物を
接触させて本発明の固定化酵素を製造するのが経済的で
あり、技術的にも便利である。尚、酵素のイオン交換樹
脂への吸着は、酵素の溶液と適当なｐＨに調整したイオ
ン交換樹脂とを混合することで行うことができる。この
混合はバッチ式及びカラム式のいずれで行ってもよい。

【００１８】本発明の固定化酵素は、例えば、以下の
（イ）〜（ヘ）の物性を示すものであることが好まし
い。 （イ）活性の組成比：マルトースホスホリラーゼ（Ａ）
およびトレハロースホスホリラーゼ（Ｂ）であり、その
加燐酸分解反応での活性組成比（Ａ／Ｂ）が０．２５〜
２の範囲である。 （ロ）至適ｐＨ：トレハロース生成活性の至適ｐＨが
５．５〜６．０である。 （ハ）作用適温の範囲：６５℃近傍にトレハロース生成
活性の至適温度を有する。 （ニ）温度に対する安定性：ｐＨ７、６０℃で６０分間
の加熱後に未加熱処理酵素組成物の９０％以上の生成活
性を有する。 （ホ）ｐＨ安定性：２０ｍＭ燐酸塩存在下５０℃、６０
分間の加熱後にｐＨ５〜８の範囲でｐＨ７で氷冷保存し
た固定化酵素組成物の９０％以上のトレハロース生成活
性を有する。また、６０℃、６０分間加熱後にｐＨ６．
５〜７．５の範囲で同上未処理固定化酵素の９０％以上
のトレハロース生成活性を有する。 （ヘ）失活条件：ｐＨ７、６０分間の加熱条件下では７
５℃で完全に失活する。

【００１９】本発明のトレハロースの製造方法は上記の
本発明の固定化酵素を無機燐酸および／または無機燐酸
塩の存在下、マルトースを含む溶液に接触させることで
行われる。上記マルトース含有溶液は、マルトースのみ
を含む水溶液であることができる他、澱粉の加水分解物
やトレハロース等のその他の糖質を含有するものである
こともできる。マルトース含有溶液のｐＨは、微生物汚
染による副次的生物反応を抑制するという観点からは、
５〜７の範囲、好ましくは５．５〜６．５の範囲である
ことが適当である。また、固定化酵素とマルトース含有
溶液との接触は、微生物汚染による副次的生物反応を抑
制するという観点からは、４０〜７０℃の範囲、好まし
くは５０〜７０℃の範囲、より好ましくは５５〜６５℃
の範囲の温度で行うことが適当である。

【００２０】固定化酵素と接触させるマルトース含有溶
液の糖質の濃度は、５〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは
２０〜４０％（ｗ／ｖ）の範囲であることが適当であ
る。無機燐酸及び無機燐酸塩としては、例えば、オルト
リン酸、リン酸１水素ナトリウム、リン酸２水素ナトリ
ウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カリウム等
を用いることができる。無機燐酸及び／又は無機燐酸塩
は、マルトース含有溶液中に１〜５０ｍＭ、好ましくは
５〜２０ｍＭの範囲の濃度で存在させることが適当であ
る。固定化酵素とマルトース含有溶液との接触をバッチ
式又は連続式で行うことができ、滞留時間（反応時間）
は、各反応条件下における固定化酵素の特性とマルトー
ス含有溶液のマルトース含有濃度等に応じて適宜決定で
きる。るものではない。

【００２１】

【実施例】以下、本発明について参考例及び実施例によ
りさらに説明する。

【００２２】（参考例１） [マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホ
リラーゼを含有する培養液濃縮物の製造]マルトース
１．２％、トレハロース０．３％、脱脂大豆粉１．５
％、酵母エキス１％、尿素０．４％、硝酸アンモニウム
０．５％、リン酸２水素カリウム０．３％、硫酸マグネ
シウム０．０３％を含むｐＨ７．０の液体培地５０リッ
トルに予め同上培地で一夜通気攪拌培養したプレシオモ
ナス（Plesiomonas)ＳＨ−３５株菌体懸濁液２リットル
を接種し、通気量５０リットル／分、回転数３００ｒｐ
ｍ、温度３５℃で１８時間培養した。ついで、得られた
培養液にリゾチーム（１単位／ｍｇ）を液量に対して
０．０１％と２５０ｇのグリセリン脂肪酸エステル（花
王（株）製、商品名ホモテックスＰＴ）を添加し、３５
℃で軽く攪拌しながら１５時間反応させ溶菌処理をした
後、遠心分離をして水不溶物を除去した。得られた上清
液を分画分子量３万の限外濾過膜を用いて濃縮して約５
リットルの酵素濃縮液を得た。本濃縮液中には、約１３
０単位／ｍｌのマルトースホスホリラーゼと約２１０単
位／ｍｌのトレハロースホスホリラーゼが含まれてい
た。

【００２３】（参考例２） [粗トレハロースホスホリラーゼ濃縮物の製造]参考例１
中のマルトースをトレハロースに代えて同様に培養した
後、同様に処理して得た培養上清濃縮物のｐＨを８．２
に調整し、５０℃で１５分間加温して微量共存している
マルトースホスホリラーゼを完全に失活させた。つい
で、直ちに氷冷し、ｐＨを７に再調整後、遠心分離して
約４．８リットルの粗トレハロースホスホリラーゼ濃縮
液を得た。本濃縮液中には約３１０単位／ｍｌのトレハ
ロースホスホリラーゼが含まれていた。

【００２４】（参考例３） [精製マルトースホスホリラーゼおよび精製トレハロー
スホスホリラーゼの製造]参考例１および参考例２で調
製した粗酵素濃縮液をそれぞれ約２リットルを用い、特
開平８−１３１１５７号記載の方法でマルトースホスホ
リラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを精製し、
約９１０単位／ｍｌの精製マルトースホスホリラーゼ約
１００ｍｌと約２４８０単位／ｍｌの精製トレハロース
ホスホリラーゼ約１００ｍｌをそれぞれ得た。

【００２５】なお、酵素活性は特開平８−１３１１５７
号記載の方法によった。すなわち、５０ｍＭの燐酸緩衝
液（ｐＨ７）に溶解させた２０ｍＭのマルトースもしく
はトレハロース溶液０．５ｍｌに酵素液０．０１ｍｌを
添加し、５０℃で１５分間反応させた後、沸騰水浴中で
３分間加熱して酵素反応を止める。ついで、流水中で冷
却した後、生成したグルコースをグルコースオキシダー
ゼ法（和光純薬工業（株）製、グルコースＣ−ＩＩテス
ト．ワコー）で測定する。ここで１単位の酵素活性は同
上条件下で１分間に１μmol のグルコースを生成する酵
素量とする。

【００２６】また、本発明に係る固定化酵素の活性測定
は以下の方法によった。 [固定化マルトースホスホリラーゼおよび固定化トレハ
ロースホスホリラーゼ活性の測定法]精秤した約１０ｍ
ｇ（乾燥物換算）に上述の基質（マルトースもしくはト
レハロース）溶液１００ｍｌを添加し、５０℃で１０分
間激しく攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応液
０．５ｍｌを分取し、直ちに沸騰水浴中で５分間加熱し
て遊離した酵素を失活させた。流水中で冷却後、生成し
たグルコースを前述のグルコースオキシダーゼ法にて測
定した。ここで１単位の酵素活性は同条件下で１分間に
１μmoleのグルコースを生成する酵素量とした。

【００２７】また、固定化酵素組成物のトレハロース生
成活性は以下の方法で測定した。 [固定化酵素組成物のトレハロース生成活性の測定法]精
秤した約１００ｍｇ（乾燥物換算）の固定化酵素組成物
に２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６）に溶解させた３０％
（ｗ／ｖ）のマルトース溶液２．０ｍｌを添加し、５０
℃で３０分間激しく攪拌しながら反応させた。反応終了
後、反応液０．１ｍｌを分取し、直ちに沸騰水浴中で５
分間加熱した。ついで、応用糖質科学、第４２巻，１９
〜２５頁（１９９５年）記載の方法でグコアミラーゼ処
理をしてトレハロースおよびグルコース以外の澱粉糖を
グルコースに分解させた。該反応液に２ｍｌの水を添加
し、沸騰水浴中で５分間加熱した後、０．４５μｍのメ
ンブレンフィルターで濾過して不溶物を除去し、該糖化
液中のトレハロースを高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）法にて測定した。本方法によれば、同上条件下
でトレハロース生成率が５％以内で固定化酵素量とトレ
ハロースの生成率との間に直線性が認められたのでその
範囲内になるように固定化酵素量は適宜調整して測定し
た。

【００２８】また、本発明に用いられるフェノール系陰
イオン交換樹脂は固定化酵素調製用として広く市販され
ており容易に入手可能である。例えば、デュオライト
（Duolite)５００番シリーズ（住友化学工業（株）製）
等が使用可能である。これらの陰イオン交換樹脂を用い
る固定化酵素の調製法は従来公知の方法で行うことがで
きる。

【００２９】（実施例１及び比較例）各種陰イオン交換樹脂による固定化マルトースホスホリ
ラーゼおよび固定化トレハロースホスホリラーゼ組成物
の調製 市販の固定化酵素調製用に使用される代表的な陰イオン
交換樹脂を予め活性化してＯＨ型とした後、過剰量の２
０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄して平衡化した。つ
いで、これらの樹脂１０ｇ（乾燥物換算）に対して参考
例１記載の酵素濃縮液１００ｍｌを添加し、４℃で３時
間激しく攪拌して酵素を吸着させた。ついで、過剰量の
同上緩衝液で洗浄し、該洗浄液中のマルトースホスホリ
ラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼ活性をそれぞ
れ測定した。また、これとは別に洗浄後の樹脂に吸着し
た両酵素の活性も前述の方法で測定した。なお、ここで
活性吸着率は [（使用酵素の全活性）−（洗浄液中の酵
素の全活性）] ÷（使用酵素の全活性）×１００を示す
る。活性発現率とは（固定化された酵素の全活性）÷
[（使用酵素の全活性）−（洗浄液中の酵素の全活性）]
×１００を示している。結果を表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】表１に示されているように、プレシオモナ
スＳＨ−３５株（生命研条寄第５１４４号）由来のマル
トースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラー
ゼはスチレン系の弱塩基性の陰イオン交換樹脂を除き、
陰イオン交換樹脂であれば殆どの樹脂に吸着し、酵素の
吸着量や発現率に若干の差異は観察されるがいずれも固
定化酵素を調製することが出来る。

【００３２】トレハロース生成活性の至適ｐＨ 実施例１及び比較例で調製した４種の固定化酵素組成物
（試料番号３、４、５および６）について、２０ｍＭ燐
酸塩存在下各ｐＨでのトレハロース生成活性を求め、相
対活性として図１に示した。図中に示したように、本発
明に係るフェノール系の弱塩基性陰イオン交換樹脂を用
いて調製した固定化酵素組成物（試料番号４、５）のト
レハロース生成活性の至適ｐＨは５．５〜６．０の範囲
であり、他の固定化酵素組成物のそれよりもかなり低か
った。このことは、酵素反応時の微生物汚染が少なく、
且つ糖質の着色も少ない酸性側での酵素反応が可能であ
る事を示している。また、微生物汚染が起きた場合のｐ
Ｈ調整が容易である事を示している。

【００３３】トレハロース生成活性の作用適温 実施例１及び比較例で調製した４種の固定化酵素組成物
（試料番号３、４、５および６）について、それぞれの
至適ｐＨで２０ｍＭ燐酸緩塩存在下でのマルトースから
のトレハロースの生成活性の作用適温を測定した。図２
に示したように、これら４種の固定化酵素組成物の作用
適温はいずれも６５℃であった。但し、本発明に係る固
定化酵素組成物（試料番号４、５）の６５℃以外の相対
活性は、他固定化酵素組成物の相対活性よりも高く、特
に、高温部での相対活性が非常に高かった。このことは
本発明に係る固定化酵素組成物が他の固定化酵素組成物
よりも微生物汚染の少ない高温部で使用可能であること
を示している。

【００３４】温度に対する安定性 実施例１及び比較例で調製した４種の固定化酵素組成物
（試料番号３、４、５および６）および参考例１で調製
した粗酵素濃縮液を２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７）存在
下、各温度で６０分間加温した。ついで、氷冷した過剰
量の同上緩衝液（ｐＨ６）で良く洗浄した後（粗酵素濃
縮液は除く）、残存するトレハロース生成活性を測定し
た。なお活性は別に氷冷して保存したそれぞれの固定化
酵素組成物および粗酵素濃縮液を１００％とする相対活
性で表した。図３に示したように、本発明に係る固定化
酵素組成物（試料番号４、５）は、６０℃、６０分間の
加温でも９５％以上の活性を維持していたが、他の２種
の固定化酵素組成物は同条件下で約２５％および９５％
が失活した。また、粗酵素濃縮液中のトレハロース生成
活性は５０℃、６０分間の加温で完全に失活した。この
ことは、本発明に係る固定化酵素組成物が他の組成物よ
りも耐熱性が非常に高く、他の組成物よりもより以上の
高温で使用できることを示している。

【００３５】ｐＨに対する安定性 実施例１で調製した本発明の固定化酵素組成物（試料番
号４および５）のｐＨに対する安定性を測定した。即
ち、固定化酵素組成物を２０ｍＭ燐酸塩存在下、各ｐＨ
で６０分間、５０℃および６０℃で加温した後、氷冷し
た過剰量の２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６）で良く洗浄し
た後、残存するトレハロース生成活性を測定した。な
お、活性は別に２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６）中で氷冷
保存したそれぞれの固定化酵素組成物を１００％とする
相対活性で表した。図４に示したように、本発明に係る
固定化酵素組成物は５０℃、６０分間の処理ではｐＨ５
〜８の範囲で、そして、６０℃、６０分間の処理ではｐ
Ｈ６．５〜７．５の範囲で対照（無処理）の９０％以上
の活性を維持していた。

【００３６】トレハロース生成反応に及ぼす基質濃度
の影響 実施例１及び比較例で調製した４種の固定化酵素組成物
（試料番号３、４、５および６）および参考例１で調製
した粗酵素濃縮液を用い、２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ
６）および各濃度のマルトース存在下でトレハロース生
成活性を測定した。なお、活性は１７％（ｗ／ｖ）マル
トースを基質として用いた時のトレハロース生成活性を
１００％とする相対活性で表した。図５に示したよう
に、いずれの固定化酵素組成物も可溶性粗酵素濃縮液に
比較し、より強くマルトース濃度に依存し、基質濃度が
高くなるにしたがい活性は低下した。しかし、本発明に
係る固定化酵素組成物（試料番号４、５）は他の固定化
酵素組成物よりも濃度依存性は低かった。

【００３７】また、本発明に係る固定化酵素組成物（試
料番号４、５）は、その有する固有の比重から約５０％
程度のマルトース溶液中でも沈降し、トレハロース生成
反応が可能であった。しかし、他の固定化酵素組成物は
４３％（ｗ／ｖ）マルトース溶液中で浮遊した。この事
はバッチ式反応だけでなくカラムを用いる連続反応にお
いても本発明に係る固定化酵素組成物が操作上の優位性
を持っていることを示している。

【００３８】トレハロース生成活性に及ぼす無機燐酸
塩濃度の影響 実施例１及び比較例で調製した４種の固定化酵素組成物
（試料番号３、４、５および６）を過剰量の各濃度の燐
酸緩衝液（ｐＨ６）で良く洗浄後、同濃度の同上緩衝液
存在下で残存するトレハロース生成活性を測定した。な
お、活性は２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６）を用いて測定
した活性を１００％とする相対活性で表した。図６に示
したように、本発明に係る固定化酵素組成物はそれぞれ
の酵素が樹脂から脱離することなく１〜５０ｍＭ程度の
比較的低い燐酸塩濃度での使用が可能であった。

【００３９】しかし、スチレン系の強塩基性陰イオン交
換樹脂に吸着させた固定化酵素組成物（試料番号３）は
その最大反応速度を得るにはより高い濃度の燐酸塩が必
要であった。この事は酵素反応の最大反応速度を得るた
めに多量の燐酸塩が必要である事を示しており、糖液の
脱塩処理の負荷が大となり経済的でない事を示してい
る。また、キトサン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂に吸
着させて得た固定化酵素組成物（試料番号６）は２．５
ｍＭ程度の比較的低い燐酸塩濃度で最大活性を示すが、
燐酸塩濃度が増加するにつれて酵素が脱離し活性が低下
した。この事は、両酵素のキトサン樹脂に対する吸着強
度が弱く、イオン強度の変化により容易に樹脂から脱離
することを示しており実用上の問題が予想された。

【００４０】トレハロース生成反応に及ぼすマルトー
スホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの活性
比 参考例３で調製した精製マルトースホスホリラーゼおよ
び精製トレハロースホスホリラーゼ各５０ｍｌに２０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した各１０ｇ（乾燥物
換算）のデュオライトＡ５６１を添加し、４℃で７時間
攪拌して、それぞれの固定化酵素を調製した。ついで、
過剰量の同上緩衝液で両固定化酵素を良く洗浄して５５
８０単位／ｇ（乾燥物換算）の固定化トレハロースホス
ホリラーゼおよび４３５０単位／ｇ（乾燥物換算）の固
定化マルトースホスホリラーゼを得た後、２０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した未処理の樹脂を加えて各
固定化酵素が４０００単位／ｇ（乾燥物換算）となるよ
うに調整した。ついで、両固定化酵素を表２に示した各
配合比で混合した後、さらに未処理の樹脂を加えてマル
トースホスホリラーゼとトレハロースホスホリラーゼの
両酵素の活性の和が約２０００単位／ｇ（乾燥物換算）
となるように調整した。

【００４１】ついで、表２中の試料番号７〜１３の固定
化酵素組成物各０．５ｇ（乾燥物換算）に５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ６）を含む２００ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）
マルトース溶液を添加し、５０℃で攪拌しながら反応さ
せ、経時的に少量の反応液をサンプリングした。つい
で、沸騰水浴中で５分間加熱した後、水を加え、少量の
混合型イオン交換樹脂（ローム・アンド・ハス社製、ア
ンバーライトＭＢ−３）を用いてグルコース １−燐酸
を含むイオン性物質を除去して得られる糖質中のトレハ
ロース含有率を先に述べたＨＰＬＣ法にて測定した。図
７で明らかなように、両酵素の活性比が１に近い程トレ
ハロース生成反応速度は大きく、１未満あるいは１を超
える範囲でのトレハロース生成速度は小さかった。両酵
素を用いるマルトースからのトレハロースの生産には、
トレハロースホスホリラーゼの役割がより大きく、実用
上、両酵素の活性組成比（Ａ／Ｂ）が０．２５〜２の範
囲であることが適当である。この範囲を超えるとトレハ
ロースの生成速度がかなり遅く長時間の反応が必要にな
る。

【００４２】

【表２】

【００４３】（実施例２）カラムを用いる連続反応でのトレハロースの製造 予め２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した実施例
１で試料番号４および５として用いた弱塩基性陰イオン
交換樹脂１００ｇ（乾燥物換算）をそれぞれカラムに充
填し、参考例１で調製したマルトースホスホリラーゼお
よびトレハロースホスホリラーゼを含む粗酵素濃縮液各
１リットルを４℃、ＳＶ（ＳｐａｃｅＶｅｌｏｃｉｔ
ｙ）＝０．２で通液して樹脂に吸着させた。ついで、過
剰量の同上緩衝液（ｐＨ６）で樹脂を洗浄後、２０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ６）を含む３０％（ｗ／ｖ）のマルト
ース溶液を試料番号４の樹脂を充填したカラムに、マル
トースを含有する糖質（日本食品化工（株）製、商品
名：ＭＣ−９０、固形物当たり８９％のマルトースを含
有）の３０％（ｗ／ｖ）溶液を試料番号５の樹脂を充填
したカラムに、ＳＶ＝０．５、６０℃でそれぞれ２リッ
トル通液した。得られた糖化液を常法により脱色、脱塩
した精製糖化液（ＡおよびＢ）中には固形物当たりそれ
ぞれ約５９．５％および５３．０％のトレハロースが含
まれていた。ついで、精製糖化液ＡおよびＢを各７２％
（ｗ／ｗ）まで減圧濃縮して濃縮液約７７０ｍｌをそれ
ぞれ得た後、少量の結晶トレハロースを種核として添加
し、４℃で緩やかに攪拌しながら５日間放置して結晶を
析出させた。

【００４４】生成した結晶トレハロースはバスケット型
遠心分離器を用いて分取して乾燥させ、純度約９８．５
％で約１０％の水分を含む結晶トレハロースをそれぞれ
約２６８ｇおよび２２２ｇ得た。また、遠心分離により
得られた分密液中には固形物に対して約２９％および２
７％のトレハロースがそれぞれ含まれていたので両分密
液を合わせ定法により再度脱色、脱塩処理を行って固形
分７５％（ｗ／ｗ）のトレハロース含有シラップ８５０
ｍｌを調製した。本シラップ中には、固形物当たり単糖
約６％、トレハロース以外の二糖類約５６％、トレハロ
ース約２８％、三糖類約６％、その他の糖類約４％が含
まれていた。本シラップは少量の結晶トレハロースを添
加した場合、あるいは貯蔵時の温度変化が激しい場合に
はトレハロースの結晶が容易に析出し白濁するが、１５
℃以上の条件下で静置した場合には２ヵ月間は結晶析出
が観察されなかった。

【００４５】（実施例３）トレハロースおよびマルトースを含有する糖質からのト
レハロースの製造 実施例２で調製した試料番号４の本発明に係る弱塩基性
陰イオン交換樹脂に固定化した固定化酵素組成物を充填
したカラムに実施例２で調製したトレハロースを含むシ
ラップ８００ｍｌを５０％（ｗ／ｖ）に希釈し１０ｍＭ
燐酸塩存在下、ｐＨ６でＳＶ＝０．５、６５℃で通液し
た。次いで、常法により脱色、脱塩した後、減圧濃縮し
て固形物当たり約５５％のトレハロースを含む固形分約
７４％の精製糖化液７３０ｍｌを得た。ついで、実施例
２と同様な方法で結晶化して水分約１０％を含む約２２
６ｇのトレハロースの結晶が得られた。

【００４６】（実施例４）トレハロースを含む粉飴の製造 実施例２と同様な条件で調製した試料番号４の本発明に
係る弱塩基製陰イオン交換樹脂に固定化した固定化酵素
組成物を実施例２と同一量充填したカラムに５ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ６）を含むマルトースを含有する糖質（日
本食品化工（株）製、商品名：ＭＣ−７０、固形物当た
り約７０％のマルトースを含む）の３５％（ｗ／ｖ）溶
液５リットルをＳＶ＝０．５、７０℃で通液した。次い
で、常法により脱色、脱塩し、減圧濃縮して固形物当た
り約４１％のトレハロースを含む約７０％（ｗ／ｗ）の
精製糖化液約２．３リットルを得た。ついで、少量の結
晶トレハロースを添加し、３日間で６５℃から１０℃ま
で直線的に温度を下げながら、緩やかに攪拌し、さらに
１０℃で２日間攪拌しながら放置して結晶を析出させ
た。本操作により得られるトレハロースの結晶を含む糖
質を噴霧乾燥して水分約３％（ｗ／ｗ）の糖質粉末約
１．６ｋｇを得た。

【００４７】

【発明の効果】本発明によれば、一定以上の濃度の無機
燐酸塩の存在下でも固定化用イオン交換樹脂から酵素が
脱離する事なく充分にトレハロース生成活性を持続し、
可溶性酵素組成物よりもかなりの高温での酵素反応が可
能であるマルトースホスホリラーゼとトレハロースホス
ホリラーゼの固定化酵素が提供される。さらにこの固定
化酵素を用いる本発明の製造方法によれば、低ｐＨおよ
び高温で雑菌汚染による副次的な生物反応を防止でき、
かつ高濃度のマルトース若しくはマルトースを含有する
糖質からでも高収率でトレハロースを生成させることが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プレシオモナス属細菌ＳＨ−３５株の生産す
るマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホ
リラーゼ固定化酵素組成物のトレハロース生成活性に及
ぼすｐＨの影響〔○：本発明のフェノール系陰イオン交
換樹脂（デュオライトＡ−５６１）に固定化した固定化
酵素組成物（試料番号４）、●：本発明のフェノール系
陰イオン交換樹脂（デュオライトＡ−５６８）に固定化
した固定化酵素組成物（試料番号５）、×：比較例であ
るスチレン系陰イオン交換樹脂（ダイヤイオンＨＰＡ−
７５）に固定化した固定化酵素組成物（試料番号３）、
△比較例であるキトサン系陰イオン交換樹脂（キトパー
ルＢＣＷ−３５０５）に固定化した固定化酵素組成物
（試料番号６）〕

【図２】 プレシオモナス属細菌ＳＨ−３５株の生産す
るマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホ
リラーゼ固定化酵素組成物のトレハロース生成活性に及
ぼす温度の影響〔シンボルは図１と同じ〕

【図３】 プレシオモナス属細菌ＳＨ−３５株の生産す
るマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホ
リラーゼ固定化酵素組成物の温度安定性〔シンボル：可
溶性酵素組成物（□）、他のシンボルは図１と同じ〕

【図４】 プレシオモナス属細菌ＳＨ−３５株の生産す
るマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホ
リラーゼ固定化酵素組成物のｐＨ安定性〔シンボル：本
発明のフェノール系陰イオン交換樹脂（デュオライトＡ
−５６１）に固定化した固定化酵素組成物（試料番号
４）を２０ｍＭ燐酸塩存在下各ｐＨで６０分間５０℃
（○）および６０℃（●）で加温後に残存するトレハロ
ース生成活性、本発明のフェノール系陰イオン交換樹脂
（デュオライトＡ−５６８）に固定化した固定化酵素組
成物（試料番号５）を２０ｍＭ燐酸塩存在下各ｐＨで６
０分間５０℃（△）および６０℃（▲）で加温後に残存
するトレハロース生成活性〕

【図５】 プレシオモナス属細菌ＳＨ−３５株の生産す
るマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホ
リラーゼ固定化酵素組成物のトレハロース生成活性に及
ぼす基質濃度の影響〔シンボルは図３と同じ〕

【図６】 プレシオモナス属細菌ＳＨ−３５株の生産す
るマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホ
リラーゼ固定化酵素組成物のトレハロース生成活性に及
ぼす無機燐酸塩濃度の影響〔シンボルは図１と同じ〕

【図７】 プレシオモナス属細菌ＳＨ−３５株の生産す
るマルトースホスホリラーゼ（Ａ）およびトレハロース
ホスホリラーゼ（Ｂ）固定化酵素組成物のトレハロース
生成に及ぼす両酵素の活性組成比（Ａ／Ｂ）の影響〔シ
ンボル：Ａ／Ｂ＝４（×）、Ａ／Ｂ＝３（▲）、Ａ／Ｂ
＝２（△）、Ａ／Ｂ＝１（◎）、Ａ／Ｂ＝０．３３
（○）、Ａ／Ｂ＝０．２５（●）、Ａ／Ｂ＝０．２
（□）〕

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マルトースホスホリラーゼ及びトレハロ
   ースホスホリラーゼをイオン交換樹脂に吸着させた固定
   化酵素であって、ｐＨ７、６０℃で６０分間の加熱後に
   未加熱処理酵素組成物に対して９０％以上のトレハロー
   ス生成活性を有することを特徴とする固定化酵素。
2. 【請求項２】 イオン交換樹脂がフェノール系陰イオン
   交換樹脂である請求項１に記載の固定化酵素。
3. 【請求項３】 マルトースホスホリラーゼ及びトレハロ
   ースホスホリラーゼがプレシオモナス（Plesiomonas)属
   ＳＨ−３５株（生命研条寄第５１４４号）由来の酵素で
   ある請求項１または２に記載の固定化酵素。
4. 【請求項４】 フェノール系陰イオン交換樹脂がフェノ
   ール・ホルマリン縮合重合体またはフェノール・ホルマ
   リン・ポリアミン化合物縮合重合体であり、かつ弱塩基
   性を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の固定化
   酵素。
5. 【請求項５】 加燐酸分解反応でのマルトースホスホリ
   ラーゼ（Ａ）とトレハロースホスホリラーゼ（Ｂ）との
   活性の組成比（Ａ／Ｂ）が０．２５〜２の範囲である請
   求項１〜４のいずれか１項に記載の固定化酵素。
6. 【請求項６】 少なくとも一部のイオン交換樹脂の各粒
   子がマルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホ
   リラーゼの両方を吸着している請求項１〜５のいずれか
   １項に記載の固定化酵素。
7. 【請求項７】 マルトースホスホリラーゼを吸着したイ
   オン交換樹脂粒子とトレハロースホスホリラーゼを吸着
   したイオン交換樹脂粒子の混合物である請求項１〜５の
   いずれか１項に記載の固定化酵素。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の固
   定化酵素を無機燐酸および／または無機燐酸塩の存在
   下、少なくともマルトースを含む溶液に接触させること
   を特徴とするトレハロースの製造方法。
9. 【請求項９】 マルトース含有溶液が澱粉の加水分解物
   および／またはトレハロースを含有する請求項８記載の
   製造方法。
10. 【請求項１０】 マルトース含有溶液のｐＨが５〜７の
    範囲である請求項８または９記載の製造方法。
11. 【請求項１１】 固定化酵素とマルトース含有溶液との
    接触を４０〜７０℃の範囲の温度で行う請求項８〜１０
    のいずれか１項に記載の製造方法。
12. 【請求項１２】 マルトース含有溶液の糖質の濃度が５
    〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲である請求項８〜１１のいず
    れか１項に記載の製造方法。
13. 【請求項１３】 無機燐酸および／または無機燐酸塩を
    マルトース含有溶液中に１〜５０ｍＭの範囲の濃度で存
    在させる請求項８〜１２のいずれか１項に記載の製造方
    法。
14. 【請求項１４】 固定化酵素とマルトース含有溶液との
    接触をバッチ式又は連続式で行う請求項８〜１３のいず
    れか１項に記載の方法。。