JP2001292793A - パラニトロフェニル−β−プリメベロシド結晶の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 パラニトロフェニル−β−グルコシド及びパ
ラニトロフェニル−β−プリメベロシドを含有する溶液
から高純度のパラニトロフェニル−β−プリメベロシド
を製造する方法を提供する。 【解決手段】 パラニトロフェニル−β−プリメベロシ
ド及びパラニトロフェニル−β−グルコシドを含有する
溶液からパラニトロフェニル−β−プリメベロシドの結
晶を製造する方法であって、前記溶液をパラニトロフェ
ニル−β−プリメベロシドが所定の濃度以上になるまで
濃縮し、次いでこの濃縮溶液からパラニトロフェニル−
β−プリメベロシドの結晶を析出させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プリメベロシド配
糖体の製造方法に関し、特にパラニトロフェニル−β−
グルコシド及びパラニトロフェニル−β−プリメベロシ
ドを含有する溶液からパラニトロフェニル−β−プリメ
ベロシドの結晶を析出させることで、高純度のパラニト
ロフェニル−β−プリメベロシドを簡便に製造できる方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、種々の花や茶、果物、ワインなど
の香気生成の素となるアルコ−ル系香気に注目が集ま
り、微生物汚染に抵抗性のある安全性の高い天然型界面
活性剤や化粧品素材、食品添加物等への応用が期待さ
れ、その研究開発が盛んに行われている。中でもβ−プ
リメベロシド（β-primeverosides）は、アルコ−ル系
香気前駆体として烏龍茶や紅茶中に存在することが明ら
かになり（W.Gou, K.Sakata, N.Watanabe, R.Nakajima,
A.Yagi, K.Ina and S.Luo: Phytochemistry, 33,1373
−1375(1993), W.Gou, R.Hosoi, K.Sakata, N. Watanab
e, A.Yagi, A.Yagi, K.Inaand S.Luo : Biosci.Biolec
h.Biochem. 58,1532-1534(1994)）、その香気生成機構
についても最近報告されている（応用糖質科学第４５巻
第２号P123−129，1998）。

【０００３】β−プリメベロースは、グルコピラノ−ス
の６位とキシロ−スの１位とがエ−テル結合によりβ配
位した二糖である。β−プリメベロースは、自然界にお
いては、そのプリメベロ−スの１位にテルペンなどのア
グリコンが結合した配糖体として存在している。植物中
には、この配糖体の糖骨格（プリメベロ−ス鎖）と香気
成分であるアグリコンとのβ結合を切断する酵素、すな
わちプリメベロシダ−ゼが存在しており、その作用によ
りアグリコンが遊離され芳香を生成するといわれてい
る。

【０００４】プリメベロシダ−ゼは、植物香気成分の生
成機構の解明において重要な役割を果たし、また食品等
への応用に際しても該プリメベロシダ−ゼの酵素活性の
測定は必要不可欠である。プリメベロシダ−ゼの酵素活
性の測定法としては、パラニトロフェノ−ルを最終検知
物質とする方法が知られている。この方法ではパラニト
ロフェノ−ルをアグリコンとするパラニトロフェニル−
β−プリメベロシドを基質として、プリメベロシダ−ゼ
作用後の遊離パラニトロフェニルの吸光度を測定し、プ
リメベロシダ−ゼの酵素活性を調べるものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前記パラニトロフェニ
ル−β−プリメベロシドの製造方法としては、化学合成
法と酵素的合成法が知られている。酵素的合成法は比較
的低い温度で合成できること、反応の選択性が高いこと
等の利点を有する。そのため、これまで多くの酵素的合
成法が開発されている。例えば、特開平１１−４６７９
１号公報や特開平１１−２１２２０号公報には、β−Ｄ
−グルコシドのアグリコンとしてパラニトロフェノ−ル
を用いたパラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ドと、キシロビオ−スにペクチナ−ゼ等の酵素を作用さ
せてパラニトロフェニル−β−プリメベロシドを合成す
る方法が開示されている。

【０００６】しかし、上記酵素的合成法における反応溶
液中には、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドと
ともに、未反応のパラニトロフェニル−β−グルコシド
が残存している。そこで、このパラニトロフェニル−β
−グルコシドを除去して、純度の高いパラニトロフェニ
ル−β−プリメベロシドを得る必要があるが、上記公報
記載の方法では、カラム分画が用いられている。カラム
分画は、吸着、分離、再生を繰り返すため、カラム分画
の回数が増えれば、その分だけ分画工程中におけるパラ
ニトロフェニル−β−プリメベロシドの損失も多くな
り、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドの回収量
が低下する。またカラム分画は、少量の反応液の精製に
は適しているが、多量の反応液の精製には不向きであ
る。そこで、回収量を上げ、かつ、大量的に高純度のパ
ラニトロフェニル−β−プリメベロシドを製造するに
は、カラム分画に代わる新たな方法の開発が大きな課題
となっていた。

【０００７】かくして本発明は、上記課題を解決するた
めになされたものであり、パラニトロフェニル−β−グ
ルコシド及びパラニトロフェニル−β−プリメベロシド
を含有する溶液から高純度のパラニトロフェニル−β−
プリメベロシドを製造する方法を提供することを目的と
する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、パラニトロフ
ェニル−β−プリメベロシド及びパラニトロフェニル−
β−グルコシドを含有する溶液をパラニトロフェニル−
β−プリメベロシドが所定の濃度以上になるまで濃縮す
ることで、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドの
結晶を優先的に析出させることができることを見い出
し、本発明の製造方法を完成するに至った。

【０００９】本発明の製造方法は、パラニトロフェニル
−β−プリメベロシド及びパラニトロフェニル−β−グ
ルコシドを含有する溶液からパラニトロフェニル−β−
プリメベロシドの結晶を製造する方法であって、該溶液
をパラニトロフェニル−β−プリメベロシドが所定の濃
度以上になるまで濃縮し、次いでこの濃縮溶液からパラ
ニトロフェニル−β−プリメベロシドの結晶を析出させ
ることを特徴とする。

【００１０】本発明の好ましい態様は、次のとおりであ
る。 （１）前記パラニトロフェニル−β−プリメベロシド及
びパラニトロフェニル−β−グルコシドを含有する溶液
が、パラニトロフェニル−β−グルコシドとキシロース
供与体とを含む溶液にペクチナ−ゼを作用させてパラニ
トロフェニル−β−プリメベロシドを生成させることで
得られる溶液である態様。 （２）前記パラニトロフェニル−β−プリメベロシド及
びパラニトロフェニル−β−グルコシドを含有する溶液
が、パラニトロフェニル−β−グルコシドとキシロース
供与体とを含む溶液にペクチナ−ゼを作用させてパラニ
トロフェニル−β−プリメベロシドを生成させ、次いで
前記ペクチナ−ゼとキシロース供与体とを除去すること
で得られる溶液である態様。 （３）前記溶液の濃縮を、パラニトロフェニル−β−プ
リメベロシド濃度が６０％以上となるように行う態様。 （４）前記溶液の濃縮を、パラニトロフェニル−β−プ
リメベロシド濃度が９０％以上となるように行う態様。 （５）前記溶液の濃縮を、溶液に含まれるパラニトロフ
ェニル−β−グルコシドを結晶として析出させ、かつ析
出したパラニトロフェニル−β−グルコシド結晶を溶液
から除去することで行う態様。 （６）前記パラニトロフェニル−β−グルコシド結晶の
析出の際にパラニトロフェニル−β−グルコシドの種晶
を用いる態様。 （７）前記濃縮溶液が飽和濃度以下のパラニトロフェニ
ル−β−プリメベロシドを含有する溶液であり、かつこ
の溶液の温度を下げることでパラニトロフェニル−β−
プリメベロシドの結晶を析出させる態様。 （８）前記濃縮溶液が、飽和濃度以下のパラニトロフェ
ニル−β−プリメベロシドを含有する溶液であり、かつ
この溶液に水溶性溶媒を添加することでパラニトロフェ
ニル−β−プリメベロシドの結晶を析出させる態様。 （９）パラニトロフェニル−β−プリメベロシドの結晶
を析出させ、析出した結晶を除去した後の溶液を、パラ
ニトロフェニル−β−プリメベロシドが所定の濃度にま
で濃縮し、次いでこの濃縮溶液からパラニトロフェニル
−β−プリメベロシドの結晶を析出させる態様。

【００１１】本発明の製造方法によれば、パラニトロフ
ェニル−β−プリメベロシドとパラニトロフェニル−β
−グルコシドとの分離をカラム分画でおこなっていた従
来法（例えば、特開平１１−４６７９１号公報における
トヨパ−ルＨＷ−４０Ｓカラム（東ソ−社製）による分
画）に比べて、製造方法の簡便化を図れるという利点が
ある。特に本発明の製造方法では、パラニトロフェニル
−β−プリメベロシド溶液を濃縮して、パラニトロフェ
ニル−β−プリメベロシドの結晶を析出させるので、カ
ラム分画による従来の方法に比べて、パラニトロフェニ
ル−β−プリメベロシドの回収率も高く、かつ、大量的
に高純度のパラニトロフェニル−β−プリメベロシドを
製造することができる。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態におい
て本発明を詳細に説明する。

【００１３】本発明の製造方法において出発原料となる
パラニトロフェニル−β−プリメベロシド及びパラニト
ロフェニル−β−グルコシドを含有する溶液（以下「パ
ラニトロフェニル−β−プリメベロシド溶液」という）
は、少なくともパラニトロフェニル−β−プリメベロシ
ドとパラニトロフェニル−β−グルコシドとを含有する
溶液である。

【００１４】上記パラニトロフェニル−β−プリメベロ
シド溶液は、例えば、酵素的合成法により得られるもの
であることができる。例えば、特開平１１−４６７９１
号公報に記載の酵素的合成法により得られる溶液の場
合、パラニトロフェニル−β−プリメベロシド溶液は、
パラニトロフェニル−β−プリメベロシドとパラニトロ
フェニル−β−グルコシド以外に、キシロース供与体、
ペクチナ−ゼ等の酵素、Ｄ−グルコン酸δ−ラクトン等
のグルコシダ−ゼ活性阻害剤等を含むものであることが
できる。

【００１５】特開平１１−４６７９１号公報に記載の酵
素的合成法について、以下に簡単に説明する。この方法
では、パラニトロフェニル−β−グルコシド及びキシロ
ース供与体にペクチナ−ゼを作用させることよりパラニ
トロフェニル−β−プリメベロシドを生成させる。反応
生成物を含む溶液は、酵素反応生成物であるパラニトロ
フェニル−β−プリメベロシド以外に原料であるパラニ
トロフェニル−β−グルコシド及びキシロース供与体、
さらにはペクチナ−ゼを含有する。パラニトロフェニル
−β−グルコシド、キシロース供与体及びペクチナ−ゼ
の使用量は、得られるパラニトロフェニル−β−プリメ
ベロシドの量に応じて適宜決定される。好ましくはパラ
ニトロフェニル−β−グルコシド１モルに対して、キシ
ロース供与体１モル以上を添加することができる。ペク
チナ−ゼの添加量は、パラニトロフェニル−β−グルコ
シドとキシロース供与体の添加量を考慮して適宜決定す
ることができる。キシロース供与体としては、キシロダ
ーゼで切断可能なβ配位のエーテル結合を有する２糖以
上のキシロオリゴ糖やキシロース配糖体を用いることが
できる。キシロース供与体としては、例えば重合度２以
上のキシロオリゴ糖、キシロビオ−ス等を例示すること
ができる。ペクチナ−ゼは、アスペルギルス属に属する
糸状菌に由来するものであればよく、一般に市販されて
いるペクチナ−ゼ（例えば天野製薬社製のペクチナ−ゼ
Ｇ（商品名））を使用することができる。さらに、上記
酵素反応の際に、グルコシダ−ゼ活性の阻害剤として、
Ｄ−グルコン酸 δ−ラクトン等を含有させることもで
きる。

【００１６】酵素的合成法により調製したパラニトロフ
ェニル−β−プリメベロシド含有溶液は、結晶析出法に
よるパラニトロフェニル−β−プリメベロシドの分離精
製を容易にするために、濃縮前に、容易に分離すること
が可能なペクチナ−ゼやキシロース供与体、さらにグル
コシダ−ゼ活性の阻害剤としてのＤ−グルコン酸 δ−
ラクトン等を除去しておくことが好ましい。ペクチナ−
ゼは、通常、酵素反応終了時に加熱して失活させる。加
熱の温度と時間は、ペクチナ−ゼの失活温度を考慮して
適宜決定される。加熱の温度は、完全に失活させるため
に好ましくは７０℃以上、より好ましくは９０℃以上で
ある。また、加熱の時間は、好ましくは５分以上、より
好ましくは１０分以上である。加熱して失活して不溶性
物質となったものは、遠心分離や珪藻土等を用い濾過等
により分離することができる。また、キシロース供与体
やＤ−グルコン酸 δ−ラクトンは、通常の分離法を用
いて除去することができる。具体的には、パラニトロフ
ェニル−β−プリメベロシドを捕獲せずにキシロース供
与体とペクチナ−ゼを選択的に捕獲することのできる合
成樹脂（例えば、合成吸着樹脂ＨＰ−２０（三菱化学社
製））等を用いることが好適である。この際に使用する
溶出溶液は、充填剤を考慮して適宜決定されるが、例え
ば、１０〜３０％のエタノ−ルを用いることができる。

【００１７】本発明におけるパラニトロフェニル−β−
プリメベロシド溶液は、上記酵素的合成法のほか、化学
合成法により調製したものであってもよい。例えば、パ
ラニトロフェニル−β−グルコシドとアセチルキシロ−
スを硝酸銀等の触媒存在下で得られたパラニトロフェニ
ル−β−プリメベロシド溶液が、少なくともパラニトロ
フェニル−β−プリメベロシドとパラニトロフェニル−
β−グルコシドを含んでいる場合には、この溶液を本発
明の製造方法におけるパラニトロフェニル−β−プリメ
ベロシド溶液として使用することができる。

【００１８】本発明の製造方法においては、パラニトロ
フェニル−β−プリメベロシドの濃度が所定の濃度以上
になるまでパラニトロフェニル−β−プリメベロシド溶
液を濃縮する。パラニトロフェニル−β−プリメベロシ
ド溶液の濃縮は、この溶液中がパラニトロフェニル−β
−プリメベロシドをパラニトロフェニル−β−グルコシ
ドに優先して析出する状態になるように行う。即ち、パ
ラニトロフェニル−β−プリメベロシドの濃度が所定の
濃度以上である、とは、パラニトロフェニル−β−プリ
メベロシドをパラニトロフェニル−β−グルコシドに優
先して析出する状態を意味する。

【００１９】酵素合成法により調製されたパラニトロフ
ェニル−β−プリメベロシド溶液は、原料の組成比や使
用する酵素の種類によりある程度の変動はあるが、一般
に、パラニトロフェニル−β−グルコシドを０．５〜３
０％、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドを０．
１〜１０％含有する。このような組成を有するパラニト
ロフェニル−β−プリメベロシド溶液からは、パラニト
ロフェニル−β−グルコシドがパラニトロフェニル−β
−プリメベロシドに優先して析出する。しかし、パラニ
トロフェニル−β−プリメベロシドの濃度が所定の濃度
以上になると、今度はパラニトロフェニル−β−プリメ
ベロシドがパラニトロフェニル−β−グルコシドに優先
して析出するようになる。

【００２０】パラニトロフェニル−β−プリメベロシド
溶液の濃縮は、パラニトロフェニル−β−プリメベロシ
ドの濃度が６０％以上となるように行うことが、パラニ
トロフェニル−β−プリメベロシドの優先的析出を確実
に行うことができるという観点から好ましい。さらに、
パラニトロフェニル−β−プリメベロシド溶液の濃縮
は、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドの濃度が
９０％以上となるように行うことが、パラニトロフェニ
ル−β−プリメベロシドの優先的析出を確実に行うこと
のみならず、高純度のパラニトロフェニル−β−プリメ
ベロシド結晶を高収率で得られるという観点から好まし
い。

【００２１】パラニトロフェニル−β−プリメベロシド
溶液の濃縮方法は、パラニトロフェニル−β−プリメベ
ロシドの濃度を、所定の濃度に高めることができる方法
であれば特に制限はない。そのような方法としては、例
えば、加熱濃縮法、減圧濃縮法、通風濃縮法等の通常の
濃縮方法を挙げることができる。パラニトロフェニル−
β−プリメベロシド溶液を所定の濃度まで濃縮する際に
は、溶液中の水分を蒸発させるが、パラニトロフェニル
−β−プリメベロシドの濃度が所定の濃度になるまで
は、水分の蒸発に伴いパラニトロフェニル−β−グルコ
シドの結晶が析出する。析出したパラニトロフェニル−
β−グルコシドの結晶は、溶液から除去する。パラニト
ロフェニル−β−プリメベロシド溶液の組成によって
は、濃縮及び濃縮により生じたパラニトロフェニル−β
−グルコシドの結晶の除去を複数回繰り返すこともでき
る。このように、水分を蒸発させ、かつ析出したパラニ
トロフェニル−β−グルコシドの結晶を除去していくに
より、パラニトロフェニル−β−プリメベロシド溶液中
のパラニトロフェニル−β−プリメベロシド濃度を上昇
させて、所定の濃度とすることができる。

【００２２】析出したパラニトロフェニル−β−グルコ
シドの結晶は、濾過法等の通常の固液分離方法を用いて
除去することができる。析出したパラニトロフェニル−
β−グルコシド結晶を除去する回数は、パラニトロフェ
ニル−β−プリメベロシド溶液の組成と濃縮の程度を考
慮して、２回以上繰り返すこともできる。

【００２３】パラニトロフェニル−β−プリメベロシド
溶液からパラニトロフェニル−β−グルコシドの結晶を
析出させる際に、種晶を併用することもできる。種晶を
用いることで、パラニトロフェニル−β−プリメベロシ
ド溶液中に残存するパラニトロフェニル−β−グルコシ
ドを、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドに優先
して析出させることができる。種晶としては、パラニト
ロフェニル−β−グルコシドの結晶を用いるが、その構
造及び結晶形は結晶として析出するパラニトロフェニル
−β−グルコシドと似たものを用いることが好ましい。
種晶の添加量は、パラニトロフェニル−β−プリメベロ
シド溶液中のパラニトロフェニル−β−グルコシドの量
を考慮して適宜決定される。また、結晶の析出を容易に
するために、パラニトロフェニル−β−グルコシドの種
晶を添加した後、珪藻土を加えたり又は超音波装置など
を用いてパラニトロフェニル−β−プリメベロシド溶液
に振動を与えることもできる。

【００２４】パラニトロフェニル−β−プリメベロシド
溶液の濃縮により、パラニトロフェニル−β−プリメベ
ロシドが所定の濃度以上となったパラニトロフェニル−
β−プリメベロシド濃縮溶液から、パラニトロフェニル
−β−プリメベロシドの結晶を析出させる。パラニトロ
フェニル−β−プリメベロシド濃縮溶液からのパラニト
ロフェニル−β−プリメベロシド結晶の析出は、パラニ
トロフェニル−β−プリメベロシドの濃縮溶液における
パラニトロフェニル−β−プリメベロシド濃度が、飽和
濃度(溶解度)以上となるようにすることで行うことが出
来る。パラニトロフェニル−β−プリメベロシド濃度を
飽和濃度(溶解度)以上とする方法としては、例えば、温
度による溶解度の差を利用した方法や水以外の溶媒を添
加して溶解度を減少させる方法等を用いることができ
る。パラニトロフェニル−β−プリメベロシドが所定の
濃度以上である濃縮溶液を、パラニトロフェニル−β−
プリメベロシド濃度が飽和濃度(溶解度)以上となるよう
にすることで、パラニトロフェニル−β−プリメベロシ
ドの結晶を優先的に析出させることができる。

【００２５】より具体的には、パラニトロフェニル−β
−プリメベロシドの濃縮溶液の調製(パラニトロフェニ
ル−β−グルコシドの析出及び除去)を、パラニトロフ
ェニル−β−プリメベロシドの濃度が飽和濃度以下とな
る温度で行い、この溶液の温度をパラニトロフェニル−
β−プリメベロシドの濃度が飽和濃度を超えるように下
げることによりパラニトロフェニル−β−プリメベロシ
ドの結晶を析出させることができる。濃縮溶液の冷却前
の温度は、濃縮溶液のパラニトロフェニル−β−プリメ
ベロシド濃度が、上述のように、所定の濃度、例えば、
６０％以上、好ましくは９０％以上であることを考慮し
て、このような溶液において、パラニトロフェニル−β
−プリメベロシド濃度が飽和濃度以下となるよう設定す
ることができる。例えば、濃縮溶液の温度は、４０〜１
００℃、好ましくは５０〜７０℃とすることができる。
また、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドの結晶
を析出させるための冷却温度は、例えば、１０〜３０
℃、好ましくは１０〜２０℃とすることができる。また
濃縮溶液の温度は、パラニトロフェニル−β−プリメベ
ロシドの結晶を良好に成長させるために、徐々に下げる
こともできる。

【００２６】パラニトロフェニル−β−プリメベロシド
の濃縮溶液に、水溶性溶媒を添加することによりパラニ
トロフェニル−β−プリメベロシドの結晶を析出させる
こともできる。飽和濃度以下のパラニトロフェニル−β
−プリメベロシド溶液に水溶性溶媒を添加することによ
り、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドの溶解度
が低下し、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドの
結晶が析出する。この場合、水溶性溶媒添加前のパラニ
トロフェニル−β−プリメベロシド濃縮溶液の温度につ
いては特に限定はない。但し、操作の容易さ(水溶性溶
媒の揮発喪失等)を考慮すると、水溶性溶媒添加前のパ
ラニトロフェニル−β−プリメベロシド濃縮溶液の温度
は、室温であることが適当である。パラニトロフェニル
−β−プリメベロシド溶液に添加する水溶性溶媒は、特
に限定されるものではなく、例えばメタノ−ル、エタノ
−ル、アセトン等の通常の水溶性溶媒を適宜添加するこ
とができる。また水溶性溶媒の添加量についても特に制
限はなく、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドの
溶解度を考慮して適宜決定される。

【００２７】パラニトロフェニル−β−プリメベロシド
の結晶の回収率をさらに上げるために、パラニトロフェ
ニル−β−プリメベロシドの結晶を析出除去した後に残
るパラニトロフェニル−β−プリメベロシド溶液を、上
記と同様に再度濃縮してパラニトロフェニル−β−プリ
メベロシドの結晶の析出を行うこともできる。この場合
の濃縮条件及び析出条件は、最初の条件と同一であって
もよく、また必要に応じて適宜変更しても構わない。ま
た、温度差による溶解度の違いを利用したパラニトロフ
ェニル−β−プリメベロシド結晶析出法の後、溶液の組
成によっては、さらに水溶性溶媒を用いた結晶析出を行
うこともできる。

【００２８】析出したパラニトロフェニル−β−プリメ
ベロシドの結晶は、濾斗等を用いて濾取し、必要により
通常の方法により洗浄、乾燥して、高純度のパラニトロ
フェニル−β−プリメベロシドの結晶が得られる。本発
明により製造されたパラニトロフェニル−β−プリメベ
ロシドの結晶は、高純度であるため、そのまま、二糖体
であるプリメベロ−スのアグリコンを選択的に加水分解
するプリメベロシダ−ゼの酵素活性測定における基質と
して用いることができる。

【００２９】

【実施例】以下に本発明の好適な実施例を示して、本発
明をさらに詳細する。

【００３０】＜実施例１＞パラニトロフェニル−β−Ｄ
−グルコピラノシド３１．８ｇ、Ｄ−グルコン酸δ−ラ
クトン１１ｇ、キシロビオ−ス１２ｇ、ペクチナ−ゼ
（商品名：ペクチナ−ゼＧ；天野製薬社製）２．９ｇ、
アセトニトリル３０ｍｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４）６０ｍｌ、精製水２４０ｍｌを反応容器に混入し、
４０℃で１５時間インキュベ−トした。これを７０℃で
１０分加熱して反応を停止して得られたものをパラニト
ロフェニル−β−プリメベロシド溶液とした。遠心分離
機（Ｕｌｔｒａ ｓｏｎｉｃ ＵＳＣ−１；Ｐａｓｏｌｉ
ｎａ社製）を用いてパラニトロフェニル−β−プリメベ
ロシド溶液から不溶性物質を濾取した。次いでこの溶液
を合成吸着樹脂ＨＰ−２０（三菱化学社製）を充填した
カラムにチャ−ジし、水、１０％エタノ−ルの順でカラ
ムを洗浄した。次いで、この溶液を２５〜３０％のエタ
ノ−ルで溶出し、５５℃真空下で１時間濃縮してエタノ
−ルを除去した。この濃縮液に等量のメタノ−ル及び２
０ｍｇのパラニトロフェニル−β−グルコシドを種晶と
して添加して、４℃で３日間放置した後、析出したパラ
ニトロフェニル−β−グルコシドの結晶を濾取した。分
蜜液は再度濃縮し、同様な操作を２回繰り返し、最終的
に温度５０℃で濃度６０％まで濃縮した分蜜液を、放置
して３０℃まで温度を下げることによりパラニトロフェ
ニル−β−プリメベロシドの結晶２．３ｇ(純度１００
％)を得た。この結果、パラニトロフェニル−β−グル
コシド３１．８ｇとキリロビオ−ス１４５．８ｇからパ
ラニトロフェニル−β−プリメベロシド及びパラニトロ
フェニル−β−グルコシドを合わせた３４ｇを回収し
た。また、収率（回収率）は、９２％であった。

【００３１】

【発明の効果】以上説明したように本発明の製造方法に
よれば、高純度のパラニトロフェニル−β−プリメベロ
シドの結晶を高い収率で製造することができる。また本
発明の製造方法では、パラニトロフェニル−β−プリメ
ベロシド溶液の濃縮と析出を行うので、従来のカラム分
画を主とする製造法に比べて分離精製が簡便であり、か
つ、カラム等に要する費用も減少できるので、製造コス
トの低廉化を図ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０１Ｄ 9/02 ６０６ Ｂ０１Ｄ 9/02 ６０６ ６０８ ６０８Ａ ６１１ ６１１Ｚ ６１５ ６１５Ａ ６１８ ６１８Ａ (72)発明者 碓氷 泰市 静岡県静岡市大谷836 (72)発明者 岡田 正紀 神奈川県横浜市神奈川区高島台27−１ Ｆターム(参考） 4B064 AF41 CA21 DA16

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 パラニトロフェニル−β−プリメベロシ
   ド及びパラニトロフェニル−β−グルコシドを含有する
   溶液からパラニトロフェニル−β−プリメベロシドの結
   晶を製造する方法であって、 前記溶液をパラニトロフェニル−β−プリメベロシドが
   所定の濃度以上になるまで濃縮し、次いでこの濃縮溶液
   からパラニトロフェニル−β−プリメベロシドの結晶を
   析出させることを特徴とする製造方法。
2. 【請求項２】 前記パラニトロフェニル−β−プリメベ
   ロシド及びパラニトロフェニル−β−グルコシドを含有
   する溶液が、パラニトロフェニル−β−グルコシドとキ
   シロ−ス供与体とを含む溶液にペクチナ−ゼを作用させ
   てパラニトロフェニル−β−プリメベロシドを生成させ
   ることで得られる溶液である請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】 前記パラニトロフェニル−β−プリメベ
   ロシド及びパラニトロフェニル−β−グルコシドを含有
   する溶液が、パラニトロフェニル−β−グルコシドとキ
   シロ−ス供与体とを含む溶液にペクチナ−ゼを作用させ
   てパラニトロフェニル−β−プリメベロシドを生成さ
   せ、次いで前記ペクチナ−ゼとキシロース供与体とを除
   去することで得られる溶液である請求項１記載の製造方
   法。
4. 【請求項４】 前記溶液の濃縮を、パラニトロフェニル
   −β−プリメベロシド濃度が６０％以上となるように行
   う請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 前記溶液の濃縮を、パラニトロフェニル
   −β−プリメベロシド濃度が９０％以上となるように行
   う請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
6. 【請求項６】 前記溶液の濃縮を、溶液に含まれるパラ
   ニトロフェニル−β−グルコシドを結晶として析出さ
   せ、かつ析出したパラニトロフェニル−β−グルコシド
   結晶を溶液から除去することで行う請求項１〜５のいず
   れか１項に記載の製造方法。
7. 【請求項７】 パラニトロフェニル−β−グルコシド結
   晶の析出の際にパラニトロフェニル−β−グルコシドの
   種晶を用いる請求項６に記載の製造方法。
8. 【請求項８】 前記濃縮溶液が、飽和濃度以下のパラニ
   トロフェニル−β−プリメベロシドを含有する溶液であ
   り、かつこの溶液の温度を下げることでパラニトロフェ
   ニル−β−プリメベロシドの結晶を析出させる請求項１
   〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
9. 【請求項９】 前記濃縮溶液が、飽和濃度以下のパラニ
   トロフェニル−β−プリメベロシドを含有する溶液であ
   り、かつこの溶液に水溶性溶媒を添加することでパラニ
   トロフェニル−β−プリメベロシドの結晶を析出させる
   請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 パラニトロフェニル−β−プリメベロ
    シドの結晶を析出させ、析出した結晶を除去した後の溶
    液を、パラニトロフェニル−β−プリメベロシドが所定
    の濃度にまで濃縮し、次いでこの濃縮溶液からパラニト
    ロフェニル−β−プリメベロシドの結晶を析出させる請
    求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。