DK173098B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af multiglucosylcyclodextriner - Google Patents

Description

i DK 173098 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af multiglucosylcyclodextriner.

Fremstilling af forgrenede cyclodextriner, og anvendelse og udvikling deraf har været i rask udvikling på grund af deres udmærkede fysiske egenskaber, sås om høj opløselighed, og hidtil har man kendt frem-5 gangsmåder til fremstilling af enkeltforgrenede cyclodextriner med et forgrenet dextrin, såsom a-l,4-glucan og panose, fæstnet til deres cyclodextrinringe, og mul-tiforgrenede cyclodextriner med to forgreninger af mal-tooligosaccharider, såsom glucose, maltose og malto-10 triose, fæstnet til deres cyclodextrinringe, f.eks. di-glucosylcyclodextrin med to glucoser fæstnet til den samme cyclodextrinring, dimaltosylcyclodextrin med to maltoser fæstnet til den samme cyclodextrinring og glucosyl- eller maltosylcyclodextrin med glucose- eller 15 maltoseforgreninger fæstnet til denne samme cyclodextrinring .

Disse cyclodextriner fremstilles ved, at et cyc-lodextrinsyntetiserende enzym indvirker på forgrenede dextriner, eller at en blanding af en a-l,4-glucan, så-20 som maltose eller maltotriose eller en forgrenet dextrin, såsom panose med en cyclodextrin, påvirkes med et deforgreningsenzym. Der nævnes også en fremgangsmåde til fremstilling af forgrenede cyclodextriner, hvor et deforgreningsenzym virker på en blanding af maltooligo-25 sylfluorid eller glucosylfluorid og en cyclodextrin.

Enkeltforgrenede cyclodextriner har en meget større opløselighed end de oprindelige cyclodextriner og kan benyttes indenfor mange områder. Da sådanne enkeltforgrenede cyclodextriner, f.eks. enkeltforgrenet 30 β-cyclodextrin, påvirkes af amylaser af Aspergillus oryzae (Taka-amylase), har der imidlertid været et sti- 2 DK 173098 B1 gende behov for cyclodextriner, der er yderst bestandige overfor sådanne enzymer, og effektiv fremstilling heraf.

Der er i særdeleshed nu et stort behov for mul-5 tiglucosylcyclodextriner, eftersom de så at sige ikke påv irkes af amylaser og er fremragende hvad angår opløselighed. Fremstillingen af multiglucosylcyclodextri-ner indtil nu, som beskrevet i Chemical Abstracts, 107, (1987), 156851s, omfatter imidlertid kun omdannelsen af 10 forgrenede dele af på sædvanlig måde fremstillede mul-timaltosylcyclodextriner til glucosylgrupper ved overskæring med glucoamylase. Udbytterne af multimaltosyl-cyclodextriner ved sædvanlige fremgangsmåder er desuden lave og for det meste knapt 22,3%. Den i US patent nr.

15 4.668.626 beskrevne fremgangsmåde er en fremgangsmåde til fremstilling af en enkeltforgrenet cyclodextrin, og dette patent indeholder ikke nogen beskrivelse af en fremgangsmåde til binding af mere end to glucosylgrupper til cyclodextrin. Hidtil har der ikke været udvi-20 klet en effektiv fremgangsmåde til fremstilling af multiglucosylcyclodextriner.

Man har hidtil kendt fremgangsmåder til fremstilling af maltosylcyclodextriner, maltotriosylcyclo-dextriner, panosylcyclodextriner og dimaltosylcyclodex-25 triner ud fra maltose, maltotriose, panose og cyclodextriner under anvendelse af omvendte syntesereaktioner af deforgreningsenzymer, såsom pullulanase og, på basis af disse erkendelser, har man iværksat fremstillingen af enkelt- og multiforgrenede cyclodextriner. Det har 30 yderligere været kendt, at multiforgrenede cyclodextriner, såsom multiglucosylcyclodextrin, multimaltosyl-cyclodextrin dannes ud fra maltooligosaccharid og glucosylcyclodextriner ved omvendte syntesereaktioner 3 DK 173098 B1 af deforgreningsenzymer. Det har ydermere været kendt, at forgrenede dele, bundet til sådanne cyclodextriner, kan udskæres i glucosylgrupper under virkningen af glu-coamylase.

5 Et formål med den foreliggende opfindelse er derfor tilvejebringelse af en fremgangsmåde til fremstilling af multiglucosylcyclodextriner gennem en kombination af ovennævnte erkendelser.

Til opnåelse af dette formål blandedes maltose 10 først med en cyclodextrin i overensstemmelse med sædvanlige fremgangsmåder til opnåelse af maltosyl-cyclodextrin ved den omvendte syntesereaktion af et de-forgreningsenzym. Efter adskillelse af reaktionsblandingen i maltose- og cyclodextrinbestanddele (forgrene-15 de og ikke-forgrenede cyclodextriner), påvirkes cyclo-dextrinbestanddelene dernæst med glucoamylase til dannelse af en glucosylcyclodextrln, der ikke påvirkes af forgreningsenzymet, og en ureageret cyclodextrin. Efter adskillelse og fjernelse af den fremstillede glu-20 cose blandedes cyclodextrinbestanddelene igen med maltose og påvirkedes med deforgreningsenzymet og glucoamylase. Det viste sig, at 70% eller mere af startcy-clodextrinen var omdannet til en forgrenet cyclodextrin ved de tre reaktionscykluser, og omdannelsen til multi-25 glucosylcyclodextrinen nåede op på 35% eller mere.

Disse erkendelser har således ført til den foreliggende opfindelse.

Ovennævnte og andre formål og træk ifølge opfindelsen belyses nærmere i den efterfølgende detaillerede 30 beskrivelse med henvisning til den vedhæftede figur, der er et strømskema, som viser en udførelsesform for den omhandlede fremgangsmåde.

I den foreliggende beskrivelse refererer udtrykket "forgrenede cyclodextriner" generelt til cyclo- 4 DK 173098 B1 dextriner med forgrening, såsom glucose og maltose, fæstnet til deres cyclodextrinring, og udtrykket "mul-tiforgrenede cyclodextriner" refererer generelt til cyclodextriner med to eller flere forgreninger fæstnet til deres cyclodextrinring. Hvis en cyclodextrin har 5 en type af forgreninger, hvor dette antal ligger mellem 2 og et større tal, vil den f.eks. blive benævnt som multiglucosylcyclodextrin, hvor typen af forgreninger er indføjet mellem udtrykkene "multi" og "cyclodextrin". I tilfældet hvor cyclodextriner med forgre-10 ninger, der er begrænset hvad angår type og antal, vil de specielt herefter blive omtalt f.eks. som digluco-sylcyclodextrin, glucosyl- og maltosylcyclodextrin. I de efterfølgende skematiske formler vil cyclodextrin, glucosylcyclodextrin, maltosylcyclodextrin, glucose og 15 maltose osv. blive forkortet som henholdsvis CD, G^-CD, G2—CD, , G2 osv.

Den omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig ved fremstilling af multiglucosylcyclodextrinerne gennem en kombination af den omvendte syntesereaktion af defor-20 greningsenzymet og hydrolysereaktionen af glucoamylase.

Nærmere angivet tilvejebringes ifølge den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af multiglucosylcyclodextriner, der er ejendommelig ved, at et deforgreningsenzym bringes i kontakt med en 25 blanding af maltose eller maltooligosaccharid, der indeholder maltose, og en cyclodextrin til dannelse af en forgrenet cyclodextrin, at den forgrenede cyclodextrin omdannes til glucosylcyclodextrin ved omsætning med glucoamylase, at glucosylcyclodextrinen blandes med 30 maltose eller maltooligosaccharid, der indeholder maltose, at den opnåede blanding successivt bringes i kontakt med et deforgreningsenzym og glucoamylase til dan- 5 DK 173098 B1 nelse af en multiglucosylcyclodextrin, og at den ovenstående cyklus om nødvendigt gentages.

Jo flere gentagelser af den omvendte syntesereaktion af deforgreningsenzymet - indvirkningen af glu-5 coamylase, des højere indhold af de multiglucosylcyclodextrin og eventuelt en total omdannelse af cyclodex-trinen til multiglucosylcyclodextrinen.

Figur 1 viser en udførelsesform af den omhandlede fremgangsmåde, som eventuelt kan benyttes indenfor 10 mange områder.

Idet der nu henvises til trin (l) i fig. l, kan ethvert deforgreningsenzym, såsom det i handelen tilgængelige pullulanase benyttes som enzymmateriale. En membranreaktor, hvori der anvendes enzymer af fri type, 15 kan benyttes ved den foreliggende opfindelse; immobili-serede enzymer kan imidlertid med fordel benyttes ved en kontinuerlig proces.

Idet der henvises til trin (2) i fig. I, kan ethvert materiale, der er i stand til at adskille cyclo-20 dextrinbestanddelene og saccharid(erne) til forgrening, såsom ODS, ionbytterharpikser og aktivt kul, benyttes til kolonneadskillelse. "ODS" betyder en kolonne anvendt til revers-fase-chromatografi under anvendelse af silicagel, hvortil octadesylsilan er kemisk bundet.

25 Da der ved kolonneadskillelse imidlertid benyttes et elueringsmiddel, som giver anledning til en sænkning af substratkoncentrationer, opnås bedre resultater, når koncentratorer, såsom omvendt osmose-membraner og mul-tieffektive inddampere tilvejebringes på linien i pas-30sende størrelser. Hvor der benyttes en ODS-kolonne, er det mere foretrukket at gennemføre ethanoleluering til udskillelsen af cyclodextrinbestanddele for at bevare kolonnens ydeevne. Man kan imidlertid benytte en løs, 6 DK 173098 B1 omvendt osmose-membran til samtidig udledning af ethanol og vand fra systemet.

Idet der henvises til trin (3) i fig. i, kan man som enzym vilkårligt benytte fri type og immobiliserede 5 enzymatiske materialer; det er imidlertid mere fordelagtigt at benytte de immobiliserede enzymer i kontinuerlige systemer. Idet der henvises til typerne af sådanne enzymatiske materialer, som benyttes, kan de i handelen tilgængelige rå til raffinerede produkter be-10 nyttes.

Sukkerbestanddelene, der forlader trin (3) omfatter en uomsat cyclodextrin, glucosylcyclodextrin og glucose, som eventuelt kan fjernes. Trin (4) kan derfor, når det er muligt, udelades.

15 Når glucose ikke fjernes, akkumuleres glucose således, at der, hvis systemet er af den kontinuerlige type, sker en reaktivitetsmindskelse. Derfor kan man, når glucoseindholdet først når et forudbestemt niveau, skille glucosen fra produktet på linien til genanven-20delse af maltose [(2)-(1)] ved at anvende et sådant adskillelsessystem med et bevægeligt leje, som benyttes til adskillelse ved gelfiltrering. Dette system kan desuden yderligere være anvendeligt til adskillelsen af cyclodextrin- og ikke-cyclodextrinbestanddelene 25 (oligosaccharider, såsom glucose og maltose).

Som sacchariderne til forgrening kan man benytte maltose, maltosesirup og en blanding af maltose og mal-totriose, såsom "oligotose" samt sirup eller til pulver tilvirket sirup indeholdende maltooligosaccharid. De 30 cyclodextriner, der benyttes som udgangsmateriale, kan være α-, β- eller y-cyclodextrin eller en blanding heraf, samt til pulver tilvirket cyclodextrinsirup.

Når maltose benyttes som saccharidet til forgrening, varierer sukkerbestanddelen i de respektive trin 7 DK 173098 B1 som opsummereret i det efterfølgende.

1) G2 CD -* G2 “* + CD + G2 — CD/ 2) G2 + CD + G2 - CD -* G2 (returneres til trin 1) 5 efter koncentrering til en forudbestemt koncen tration) og -♦ CD + G2 - CD, 3) CD + G2 - CD -► Gj^ + CD + G1 - CD, 4) Gj + CD + G^ - CD -♦ G^ og -♦ CD + G^ - CD (atter returnering til trin 1) efter koncentrering til 10 en forud bestemt koncentration).

Gennem denne cyklus ændres sukkerkomponenten under ét, som udtrykt ved CD -»-* G^ - CD -*-> (Gj^ - CD (n = 2 og 3). Når G^ + CD + G1 - CD returneres til 15 trin 1) i fravær af trin 4), og efter koncentrering til en forud bestemt koncentration, bliver sukkerkomponenten også til sidst Gj + ()n - CD (n = 1, 2 og 3) .

Man kan derfor opnå produkter, som indeholder glucose, eller glucose kan fjernes ved det sidste trin.

20 Det er muligt at fremstille produkter med for skelligt indhold af (G^)n - CD (n = 1, 2 og 3) ved at vælge antallet af denne cyklus.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan multiglucosylcyclodextrinerne let masseprodu-25 ceres ved en kombination af den omvendte syntesereaktion af deforgreningsenzymet med hydrolysereaktionen af glycoamylase, og deres produkter kan således tilvejebringes under lave omkostninger. På grund af deres udmærkede fysiske egenskaber, såsom opløselighed, forven-30 tes yderligere, at produkterne kan finde anvendelse indenfor mange områder, herunder levnedsmiddel-, medicinal- og kosmetikindustrier. Produkterne, fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse, har desuden et me- 8 DK 173098 B1 get højere indhold af det forgrenede cyclodextrin end sædvanlige produkter indeholdende maltosylcyclodex-trin. Multiglucosylcyclodextrinerne er især fordelagtige på grund af deres stabilitet, der er så udmærket, 5 at de så at sige ikke påvirkes af amylaser. Man har bemærket, at cyclodextriner med en række forskellige glucoseforgreninger, som er indeholdt i produktet ifølge den foreliggende opfindelse, kan isoleres individuelt til anvendelse.

10 Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de ef terfølgende eksempler.

Eksempel 1 15 En sukkervæske, indeholdende α-cyclodextrin og maltose i et vægtforhold på 1:5 og indstillet til en substratkoncentration på 60% og en pH-værdi på 5,0, cirkuleredes gennem en lmmobiliseret enzymkolonne, hvorpå delvis renset pullulanase (fremstillet af NOVO) 20 var lmmobiliseret på en keramisk bærer ved silankob-lingsmetoden, ved 65°C i seks timer, og indførtes dernæst i en ODS-kolonne, hvis temperatur blev holdt ved stuetemperatur, til fraskillelse af maltose. Temperaturen øgedes til 70eC til elueringen af cyclodextrin-25 komponenter. Eluatet førtes gennem en kolonne med i handlen tilgængeligt lmmobiliseret glucoamylase og, derefter atter gennem ODS-kolonnen, analogt til ovennævnte til fjernelse af glucose, hvorved der opnåedes en sukkervæske indeholdende 52,0% α-cyclodextrin, 40,6% 30 glucosyl-a-cyclodextrin og 7,4% diglucosyl-a-cyclodex-trin.

Denne sukkervæske koncentreredes gennem en omvendt osmosemembran, og maltose sattes til koncentratet 9 DK 173098 B1 i et vægtforhold på 5:1, og der indstilledes til en substratkoncentration på 60%. Produktet udsattes dernæst atter for pullulanase-, kolonne-, glucoamylase- og kolonnebehandlingerne, hvorved der opnåedes en anden 5 sukkervæske indeholdende 33,2% a-cyclodextrin, 44,0% glucosyl-a-cyclodextrin og 22,8% diglucosyl-a-cyclodex-trin.

Analogt til ovennævnte opnåedes en tredie sukkervæske, som indeholdt 25,5% a-cyclodextrin, 37,2% 10 glucosyl-a-cyclodextrin og 37,3% diglucosyl-a-cyclo-dextrin.

Det bemærkes, at sukkeranalyse gennemførtes ved højtryksvæskekromatografi under følgende betingelser: Kolonne - NH2, 5 y; elueringsmiddel - 50% acetonitril; 15 og strømningshastighed - 0,8 ml.

Eksempel 2

Der gennemføres operationer svarende til de i 20 Eksempel 1 angivne, med undtagelse af, at a-cyclodextrin ændredes til β-cyclodextrin, hvorved der opnåedes en første sukkervæske indeholdende 66,7% β-cyclodextrin, 26,0% glucosyl^-cyclodextrin, 7,0% diglucosyl-β-cyclodextrin og 0,3% triglucosyl^-cyclodextrin; en 25 anden sukkervæske indeholdende 44,5% β-cyclodextrin, 34,7% glucosyl^-cyclodextrin, 16,7% diglucosyl^-cyc-lodextrin og 4,1% triglucosyl^-cyclodextrin; og en tredie sukkervæske indeholdende 29,7% β-cyclodextrin, 34,9% glucosyl^-cyclodextrin, 24,5% diglucosyl-O-cyc-30 lodextrin og 10,9% triglucosyl^-cyclodextrin.

DK 173098 B1 10

Eksempel 3

Der gennemførtes operationer svarende til de i Eksempel i angivne, med undtagelse af, at a-cyclodex-5 trin ændredes til γ-cyclodextrin, hvorved der opnåedes en første sukkervæske indeholdende 63,8% y-cyclodex-trin, 28,0% glucosyl-y-cyclodextrin, 8,0% diglucosyl-y-cyclodextrin og 0,2% triglucosyl-y-cyclodextrin; en anden sukkervæske indeholdende 40,7% y-cyclodextrin, 1035,9% glucosyl-y-cyclodextrin, 18,7% diglucosyl-y-cyc-lodextrin og 4,7% triglucosyl-y-cyclodextrin; og en tredie sukkervæske indeholdende 25,9% y-cyclodextrin, 36,9% glucosyl-y-cyclodextrin, 26,9% diglucosyl-y-cyc-lodextrin og 10,3% triglucosyl-y-cyclodextrin.

Claims (3)

11 DK 173098 B1

1. Fremgangsmåde til fremstilling af multigluco-sylcyclodextriner, kendetegnet ved, at et de-forgreningsenzym bringes i kontakt med en blanding af maltose eller maltooligosaccharid, der indeholder mal- 5 tose, og med en cyclodextrin til dannelse af en forgrenet cyclodextrin, at den forgrenede cyclodextrin omdannes til glucosylcyclodextrin ved omsætning med gluco-amylase, at glucosylcydodextrinen blandes med maltose eller maltooligosaccharid, der indeholder maltose, at 10 den opnåede blanding successivt bringes i kontakt med et deforgreningsenzym og glucoamylase til dannelse af en multiglucosylcyclodextrin, og at den ovenstående cyklus om nødvendigt gentages.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, hvor den forgre-15 nede cyclodextrin er maltosylcyclodextrin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l, hvor deforgre-ningsenzymet er pullulanase.